一种埃洛石纳米管药物载体及埃洛石纳米管载体药物的制备方法

摘要

一种埃洛石纳米管药物载体及埃洛石纳米管载体药物的制备方法，所述的载体是多个巯基壳寡糖‑叶酸分子链通过二硫键包裹结合在修饰有巯基的埃洛石纳米管表面。通过药物载体的结构创新，将接有多个叶酸靶向分子的巯基壳寡糖链包裹结合在埃洛石纳米管表面，抗癌药物负载在巯基化的埃洛石内腔中，由于是包裹结合不但可尽可能防止药物泄露的同时，埃洛石纳米管外结合的多个叶酸靶向分子也进一步增强了靶向的高效性。本发明可通过肿瘤细胞内还原剂谷胱甘肽断裂二硫键移除壳寡糖链从而控制药物释放。本发明组装了一种集合靶向性和刺激响应性于一体的多功能埃洛石纳米管载药体系，具有良好的降低抗癌药物严重毒副作用，靶向性识别肿瘤细胞并控制药物释放的效果。

说明书

技术领域

本发明属于靶向控释药物纳米材料领域，具体涉及一种多功能埃洛石纳米管载药体系和制备方法及控释性能的研究。

背景技术

近年来癌症已经成为人类死亡的主要原因之一《全球癌症报告2014》，而目前临床上的抗癌药物普遍存在选择性低，毒副作用大，半衰期短等缺点。

研究发现肿瘤细胞表面叶酸受体过度表达，远远高于正常细胞，而叶酸是细胞代谢、DNA合成及修复的基本组成成分，肿瘤细胞的快速生长需要充足的叶酸维持DNA合成。如何充分的利用叶酸的靶向作用将抗癌药物最大化运输到肿瘤部位并刺激响应控制药物释放的，是本领域的研发人员所需要解决的一个重要问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种载药量大的，无毒的，靶向性高的，循环时间长的，成本低的，并有效控制药物释放的具有新的创新结构特征的埃洛石纳米管药物载体。

本发明还在于提供一种可实现上述目的的同时，方法可行，操作简单，成本低廉，可工业化生产的埃洛石纳米管载体药物的制备方法。

本发明的药物载体的技术方案是：将多个巯基壳寡糖-叶酸分子链通过二硫键包裹结合在修饰有巯基的埃洛石纳米管表面。

在所述的药物载体的埃洛石纳米管内载上药物活性成分可得到埃洛石纳米管载体药物。

修饰有巯基的埃洛石纳米管是由硅烷偶联剂将巯基基团接枝到埃洛石纳米管而成。

埃洛石纳米管与硅烷偶联剂的质量比为1:5～20。

巯基壳寡糖与叶酸的质量比为1:10～20。

巯基化埃洛石纳米管与巯基壳寡糖-叶酸的质量比为1:1～5。

本发明人通过药物载体的结构创新，将接有多个叶酸靶向分子的巯基壳寡糖链包裹结合在埃洛石纳米管表面，抗癌药物负载在巯基化的埃洛石内腔中，由于是包裹结合不但可以尽可能防止药物泄露的同时，埃洛石纳米管外结合的多个叶酸靶向分子也进一步增强了靶向的高效性。另外，由于肿瘤细胞外谷胱甘肽的浓度仅有(2～20)×10^-3mmol/L，而肿瘤细胞内谷胱甘肽浓度高达10mmol/L，是肿瘤细胞外的1000倍。本发明可通过肿瘤细胞内还原剂谷胱甘肽断裂二硫键移除壳寡糖链从而达到控制药物释放的目的。因此，本发明组装了一种集合靶向性和刺激响应性于一体的多功能埃洛石纳米管载药体系，具有良好的降低抗癌药物严重毒副作用，靶向性识别肿瘤细胞并控制药物释放的效果。

本发明的硅烷偶联剂优选为3-巯丙基三甲氧基硅烷或3-巯丙基三乙氧基硅烷。

所述的壳寡糖分子式为(C₆H₁₁O₄N)_n，其中聚合度n优选为2-10。

本发明的埃洛石纳米管载体药物的制备方法，包括以下步骤：

(1)埃洛石纳米管巯基化修饰

埃洛石经过酸浸提纯，研磨过筛处理之后，超声分散于有机溶剂中，加入硅烷偶联剂在氮气或氩气氛围中加热回流反应后，离心分离，洗涤，干燥后得到修饰有巯基的埃洛石纳米管；

(2)药物活性成分的负载

将修饰有巯基的埃洛石纳米管超声分散于药物溶液中，整个体系处于真空环境中，药物活性成分通过扩散作用负载到所述的埃洛石纳米管内腔之中。

(3)巯基壳寡糖-叶酸的合成

壳寡糖首先与碘、三苯基膦反应得到碘代壳寡糖，碘代壳寡糖再与硫脲反应，碱水解，再酸化后得到巯基壳寡糖；用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化叶酸分子后与巯基壳寡糖进行酰化反应得到巯基壳寡糖-叶酸；

(4)埃洛石纳米管载体药物体系的组装

将(3)步得到的负载药物的修饰有巯基的埃洛石纳米管在氧化环境下与多个巯基壳寡糖-叶酸分子链通过二硫键连接，得到多个巯基壳寡糖-叶酸分子链包裹结合在修饰有巯基的埃洛石纳米管表面的埃洛石纳米管载体药物。

通过本发明的制备方法，发明人首次成功制得多个巯基壳寡糖-叶酸分子链包裹结合在修饰有巯基的埃洛石纳米管表面的埃洛石纳米管载体药物。且发明人在制备过程发现若采用以下优选方案可高效快捷的制得本发明产品提供良好的保障。

以下为所述(1)步中的优选方案：

所用的酸为稀盐酸或者稀硫酸，质量分数优选10～30％。

酸浸温度优选50～90℃。

所述的酸浸时间优选50～200分钟。

所用的筛子优选80～200目。

有机溶剂为无水甲苯、甲醇或乙醇。

硅烷偶联剂为3-巯丙基三甲氧基硅烷或3-巯丙基三乙氧基硅烷。

埃洛石纳米管与硅烷偶联剂的质量比为1:5～20，反应温度为100～120℃。

所述(2)步中的优选方案中溶剂为水、乙醇或者磷酸缓冲溶液。

以下为所述(3)步中的优选方案：

壳寡糖与碘、三苯基膦的质量比为1:1～3:2～6。

碘代壳寡糖与硫脲的质量比为1:0.5～2。

壳寡糖与碘、三苯基膦反应，以及碘代壳寡糖与硫脲反应过程中采用的溶剂为N，N-二甲基乙酰胺，二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺。

壳寡糖与碘、三苯基膦反应，以及碘代壳寡糖与硫脲反应过程中反应温度为60～90℃。

所用的碱为NaOH或KOH水溶液。

酸化过程采用的是KHSO₄水溶液。

叶酸与EDC、NHS的摩尔比为1:1.2～2:1.2～2。

巯基壳寡糖与叶酸的质量比为1:10～20，反应温度为5～40℃。巯基壳寡糖与叶酸反应过程中采用的溶剂为二甲基亚砜，N，N-二甲基乙酰胺或N，N-二甲基甲酰胺。

以下为所述(4)步中的优选方案：

发明人发现将巯基化埃洛石纳米管与巯基壳寡糖-叶酸的质量比控制在1:1～5范围内可以使得生成产品具有良好的稳定性，结合效率高。结合时间优选为12～48h。

所述的氧化环境是通过采用的溶剂为通入氧气或者含有少量双氧水的水溶液，或通入氧气或者含有少量双氧水的磷酸缓冲溶液实现的。

本发明的药物活性成分可以为5-氟尿嘧啶，阿霉素，喜树碱，紫杉醇等抗癌药物中的一种或几种。

药物活性成分负载时间优选为24～48h。

本发明针对目前临床上的抗癌药物普遍靶向性低，毒副作用大，半衰期短等问题，设计组装了一种集合靶向性和刺激响应性于一体的新的结构特征的多功能埃洛石纳米管载药体系，从而实现特异性输送药物到肿瘤部位并控制药物释放的目的。

本发明将药物负载进无毒的埃洛石纳米管内，并用巯基壳寡糖-叶酸链包裹埃洛石纳米管载体能有效地避免输送过程中药物的泄露，同时本发明的产品可以提高埃洛石载药体系在体内的稳定性并延长循环时间，埃洛石和巯基壳寡糖-叶酸链包覆后的埃洛石分别与细胞培养48h后发现本产品的细胞存活率明显高于埃洛石，并且通过壳聚糖链上接枝的大量靶向分子叶酸与肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体间的特异性识别作用，可以大大增强该体系的靶向专一性，从而降低药物对正常组织的严重毒副作用。随后，由于肿瘤细胞内还原剂谷胱甘肽诱导二硫键的断裂移去壳寡糖链，达到控制释放药物的效果。本发明的多功能埃洛石纳米管载药体系实现了靶向给药及控制释放，促进了纳米载药体系的发展，为癌症治疗提供了新思路。

附图说明

图1巯基壳寡糖-叶酸的合成路线图。

图2多功能埃洛石纳米管载药体系制备流程图。

图3埃洛石以及修饰后的红外图，埃洛石(a)，纯化的埃洛石(b)，巯基化埃洛石(c)。图(c)中2950cm^-1处-CH₂峰的出现以及偏移后2365cm^-1处的-SH峰都说明巯基基团成功被修饰到埃洛石上。

图4埃洛石纳米管透射电镜图。纯化的埃洛石(a)，巯基化埃洛石(b)，负载药物并连接巯基壳聚糖-叶酸后的埃洛石(c)。图(c)中完全被封堵的埃洛石纳米管管口及明显增大的管径说明巯基壳寡糖-叶酸链成功包裹埃洛石纳米管。

图5多功能埃洛石纳米管载药体系热重图，重量损失逐渐增多表明药物成功负载并且巯基壳寡糖-叶酸链成功包覆。

图6负载阿霉素的埃洛石纳米管载药体系在不同条件下的释放图，DOX@HNTs-SH+pH7.4PBS(a)，DOX@HNTs-S-S-COS-FA+10mM DTT(b)/5mM DTT(c)/pH7.4PBS(d)。由于还原剂二硫苏糖醇(DTT)诱导断裂二硫键，前10h释放速度急速上升，说明本发明的多功能埃洛石纳米管载药体系控释性能非常好。

图7负载5-氟尿嘧啶的埃洛石纳米管载药体系在不同条件下的释放图，5-FU@HNTs-SH+pH7.4PBS(a)，5-FU@HNTs-S-S-COS-FA+10mM DTT(b)/5mM DTT(c)/2.5mM DTT(d)/pH7.4PBS(e)。

图8正常细胞和肿瘤细胞分别与不同浓度的埃洛石(a)及巯基壳寡糖-叶酸链包覆后的埃洛石(b)培养48h后的细胞存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但并不是限定本发明。

实施例1

(1)埃洛石纳米管巯基化修饰

5.0g埃洛石粉末超声分散于50ml质量分数为25％的盐酸溶液中，70℃磁力搅拌2h后，离心分离并用大量蒸馏水洗涤至pH 6-7为止，100℃真空干燥，研磨并过100目筛，收集待用。2.0g纯化后的埃洛石粉末超声分散于100ml无水甲苯中，逐滴加入20ml 3-巯丙基三甲氧基硅烷，120℃氩气保护下回流反应24h。冷却至室温后，离心分离，分别用无水甲苯和无水乙醇洗涤多次，60℃真空干燥，得到巯基化埃洛石纳米管(HNTs-SH)，参见图3。

(2)巯基寡糖-叶酸的合成

取1g壳寡糖(COS)，1g单质碘和2g三苯基膦溶于50ml无水的N，N-二甲基乙酰胺中，氩气保护下70℃搅拌24h。反应完成后，70℃减压蒸馏除去溶剂，在低温反应浴中加入适量的甲醇钠饱和溶液调节pH至9-10，搅拌1h后，用大量的乙醇沉淀，离心分离，产品60℃真空干燥过夜，最终得到1.2g胶状固体碘代壳寡糖，产率为85.6％。取0.8g上述产物及0.5g硫脲溶于30ml无水的N，N-二甲基乙酰胺中，氩气氛围中70℃搅拌24h。减压浓缩溶剂至少量液体，加入10ml 0.5g NaOH水溶液并90℃回流2h，然后用KHSO₄水溶液酸化，并用大量的乙醇沉淀，离心收集，干燥后得到0.49g胶状固体巯基壳寡糖，产率为78.8％。

1.1g叶酸(FA)，0.95g EDC和0.6g NHS溶于20ml无水的二甲基亚砜中，避光室温搅拌2h活化叶酸的羧基基团。0.2g巯基壳寡糖溶于10ml无水的二甲基亚砜中，逐滴加入活化后的叶酸混合溶液中并避光搅拌过夜。反应后的混合液用大量的乙醇沉淀，干燥后得到产物黄色胶状固体巯基壳寡糖-叶酸(FA-COS-SH)。

(3)抗癌药物的负载及载药量的测试

100mg的巯基化埃洛石粉末超声分散于10ml阿霉素浓度为1mg/ml的磷酸缓冲溶液(PBS)中，反复抽真空数次，尽量排进体系中的空气，避光搅拌48h，期间不断抽真空，使阿霉素尽可能全部负载进埃洛石纳米管内腔中。反应完成后，离心分离，并用PBS洗涤至无色，收集上清液，测试阿霉素在480nm处的紫外吸收，根据阿霉素的标准曲线计算载药量为4.8％。干燥后得到暗红色的负载阿霉素的埃洛石粉末，描述为DOX@HNTs-SH。

(4)多功能埃洛石纳米管药载药体系的组装

负载阿霉素的埃洛石粉末和巯基壳寡糖-叶酸在含有少量双氧水的水溶液中搅拌24h，氧化形成二硫键从而将巯基壳寡糖-叶酸链固定于埃洛石纳米管表面，离心分离并干燥得到多功能埃洛石纳米管载药体系(DOX@HNTs-S-S-COS-FA)。参见图4。

(5)埃洛石纳米管载药体系释放性能的研究

利用还原剂二硫苏糖醇(DTT)代替肿瘤细胞内谷胱甘肽进行体外控释性能研究实验。分别将10mg DOX@HNTs-S-S-COS-FA分散于8ml pH 7.4PBS溶液，8ml DTT浓度为5mM的pH7.4PBS溶液，8ml DTT浓度为10mM的pH 7.4PBS溶液中，并将10mg DOX@HNTs-SH分散于8mlpH 7.4PBS溶液中作为对比，在特定时间分别测定不同释放介质中阿霉素在480nm处的紫外吸收，绘制不同介质中埃洛石纳米管载药体系的释放曲线图，参见图6。

(6)本发明的埃洛石纳米管药物载体生物相容性的研究

分别将不同浓度的埃洛石纳米管以及巯基壳寡糖-叶酸包覆后的埃洛石纳米管与HEK 293T正常细胞和SKOV3癌细胞培养48h后，通过酶标仪测定计算细胞存活率，参见图8，表明巯基壳寡糖-叶酸链包覆后的埃洛石纳米管药物载体生物相容性明显增强，对正常细胞没有毒副作用。

实施例2

(1)，(2)步同实施例1。

(3)抗癌药物的负载及载药量的测试

300mg的巯基化埃洛石粉末超声分散于10ml 5-氟尿嘧啶(5-FU)浓度为3mg/ml的PBS溶液中，反复抽真空数次，尽量排进体系中的空气，避光搅拌48h，期间不断抽真空，使5-氟尿嘧啶尽可能全部负载进埃洛石纳米管内腔中。反应完成后，离心分离，并用PBS洗涤多次，收集上清液，测试5-氟尿嘧啶在266nm处的紫外吸收，根据5-氟尿嘧啶的标准曲线计算载药量为6.7％。干燥后得到负载5-氟尿嘧啶的埃洛石粉末，描述为5-FU@HNTs-SH。

(4)多功能埃洛石纳米管药载药体系的组装

负载5-氟尿嘧啶的埃洛石粉末和巯基壳寡糖-叶酸链在含有少量双氧水的水溶液中搅拌48h，氧化形成二硫键从而将巯基壳寡糖-叶酸链固定于埃洛石纳米管表面，离心分离并干燥得到多功能埃洛石纳米管载药体系(5-FU@HNTs-S-S-COS-FA)。

(5)埃洛石纳米管载药体系释放性能的研究

分别将5mg 5-FU@HNTs-S-S-COS-FA分散于8ml pH 7.4PBS溶液，8ml DTT浓度为2.5mM的pH 7.4PBS溶液，8ml DTT浓度为5mM的pH 7.4PBS溶液，8ml DTT浓度为10mM的pH7.4的PBS溶液中，并将5mg 5-FU@HNTs-SH分散于8ml pH 7.4PBS溶液中作为对比，在特定时间分别测定不同释放介质中5-氟尿嘧啶在266nm处的紫外吸收，绘制不同介质中埃洛石载药体系的释放曲线图。参见图7。