一种民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法

摘要

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法，包括依次进行的如下步骤：获取葫芦茶的外植体、不定芽诱导、继代培养、生根培养、移栽；所述的不定芽诱导的不定芽诱导培养基包括：MS、1.0～3.0mg/L 6‑BA、0.5～1.0mg/L NAA、25～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂，不定芽诱导培养基pH为5.4～5.8，本发明通过筛选和优化不定芽诱导、不定芽增殖、生根培养等过程的培养基配方和培养条件，经诱导、继代、生根以及移栽等步骤，达到了非常高的诱导率，其诱导率达到了89％以上，实现了葫芦茶的快速繁殖，从而实现了本发明的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法。

背景技术

葫芦茶(Tadehagi triquetrum(L.)Ohashi)，又名牛虫草、金剑草、迫颈草、咸鱼草、百劳舌等，为豆科葫芦茶属半灌木植物。葫芦茶属约有6种，主要分布于亚洲热带地区、太平洋群岛和澳大利亚，其中我国分布有葫芦茶(Tadehagi triquetrum(L.)Ohashi)和蔓茎葫芦茶(Tadehagi pseudatriquetrum(DC.)Yang et Huang),主要分布于广西、广东、海南等华南地区,常见于低山、平坝路边灌丛中，其喜气候温暖条件。

葫芦茶是一种民间常用中草药，具有清热解毒、消积利湿、杀虫防腐等功效，常用于咽喉肿痛、急性肾炎、感冒发热、前列腺增生、细菌性痢疾、黄疸性肝炎等疾病的治疗。目前，葫芦茶基本上处于野生状态，但由于药农对葫芦茶过度采摘，导致其野生资源锐减，为了防止葫芦茶资源的匮乏和满足未来对其开发利用的需要，人工大面积栽培势在必行。葫芦茶主要采用种子和扦插繁殖，但由于野生葫芦茶的种子较小，难以收集，而扦插繁殖存在周期长、繁殖系数低等缺点，因此建立葫芦茶的组培快繁方法显得尤其迫切。

本发明选择野生葫芦茶新生茎段为外植体，通过筛选和优化不定芽诱导、不定芽增殖、生根培养等过程的培养基配方和培养条件，经诱导、继代、生根以及移栽等步骤，实现了葫芦茶的快速繁殖。本发明具有诱导率高、繁殖系数高、种苗品质好、成本低等特点，可直接用于葫芦茶的繁育和保护，对于葫芦茶的遗传改良、种质资源保护和开发利用具有重要意义。

目前，国内外尚未有葫芦茶组织培养技术的报道，也未有葫芦茶组培快繁专利的申请。

发明内容

本发明的目的是提供一种民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法，本发明通过筛选和优化不定芽诱导、不定芽增殖、生根培养等过程的培养基配方和培养条件，经诱导、继代、生根以及移栽等步骤，达到了非常高的诱导率，其诱导率达到了89％以上，实现了葫芦茶的快速繁殖，从而实现了本发明的目的。

本发明提供的技术方案为：一种民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法，包括依次进行的如下步骤：获取葫芦茶的外植体、不定芽诱导、继代培养、生根培养、移栽；

所述的不定芽诱导的不定芽诱导培养基包括：MS、1.0～3.0mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L NAA、25～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂，不定芽诱导培养基pH为5.4～5.8。

在上述的民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法中，所述的不定芽诱导操作的方法为：将采集得到的作为外植体的葫芦茶的新生茎段为消毒后剪切成1.0～1.5cm的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中在25～28℃进行全暗培养30～45天即可诱导形成不定芽。

在上述的民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法中，所述的继代培养操作所用到的不定芽增殖培养基包括：MS、0.5～1.5mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、0.2～0.5g/L活性炭，不定芽增殖培养基pH为5.4～5.8。

在上述的民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法中，所述的继代培养操作为将：将经过不定芽诱导操作得到的不定芽切成长1～2cm的茎段并接种到不定芽增殖培养基中培养25～30天即可实现不定芽的大量增殖。

在上述的民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法中，所述的生根培养操作所用到的生根培养基包括：1/2MS、1.0～2.0mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、0.2～0.5g/L活性炭，生根培养基pH为5.4～5.8。

在上述的民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法中，所述的生根培养操作的方法为：将继代培养操作增殖得到的长2～3cm的不定芽并接种到生根培养基中培养25～30天即能实现试管苗的生根。

在上述的民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法中，所述的移栽操作的具体方法为：将经过生根培养操作得到的健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗3～5天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的大田土壤、细沙的混合基质中栽培成苗即得种苗。

在上述的民间中草药葫芦茶的快速繁殖方法中，继代培养操作、生根培养操中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为12～14小时/天。

有益效果：

本发明利用植物组织培养技术实现了民间中草药葫芦茶的快速繁殖，具有简单、易行、经济的特点。通过本发明育成的葫芦茶试管苗移栽成活率达到95％以上，可解决葫芦茶的人工大面积栽培中存在种苗缺乏的问题。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例一

(1)外植体采集：2014年春季，于广西环江县野外选取生长健壮的葫芦茶的新生茎段为外植体。

(2)不定芽诱导：将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗过夜后于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒30分钟，无菌水冲洗2次后用无菌滤纸吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟。无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干水分，再置于0.1％的升汞溶液中消毒3分钟，无菌水冲洗5次后经无菌滤纸吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中在25℃进行全暗培养32天即可诱导形成不定芽，诱导率达到90.7％，污染率低至6.8％。所述的不定芽诱导培养基为：MS+3.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4。

(3)继代培养：将步骤(2)所得的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到不定芽增殖培养基中培养26天即可实现不定芽的大量增殖，增殖系数达到7.9倍。所述的不定芽增殖培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.2g/L活性炭，pH为5.4。

(4)生根培养：切取步骤(3)增殖得到的长约2～3cm的不定芽并接种到生根培养基中培养25天即能实现试管苗的生根，生根率为95.3％。所述的生根培养基为：1/2MS+2.0mg/LNAA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.2g/L活性炭，pH为5.4。

(5)移栽：将步骤(4)得到的健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的大田土壤、细沙的混合基质中栽培成苗即得种苗,移栽30天后成活率达到98％以上。

上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为2500lx，光照时间为12小时/天。

实施例二

(1)外植体采集：2015年春季，在广西罗城仫佬族自治县野外选取生长健壮的葫芦茶的新生茎段为外植体。

(2)不定芽诱导：将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗过夜后于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒45分钟，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟。无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸干水分，再置于0.1％的升汞溶液中消毒4分钟，无菌水冲洗6次后经无菌滤纸吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中在26℃进行全暗培养39天即可诱导形成不定芽，诱导率为92.5％，污染率低于7％。所述的不定芽诱导培养基为：MS+2.0mg/L6-BA+0.8mg/LNAA+27g/L蔗糖+5.0g/L琼脂，pH为5.6。

(3)继代培养：将步骤(2)所得的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到不定芽增殖培养基中培养28天即可实现不定芽的大量增殖，增殖系数达到6.9倍。所述的不定芽增殖培养基为：MS+1.1mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+23g/L蔗糖+5.5g/L琼脂+0.35g/L活性炭，pH为5.6。

(4)生根培养：切取步骤(3)增殖得到的长约2～3cm的不定芽并接种到生根培养基中培养27天即能实现试管苗的生根，生根达到97.6％。所述的生根培养基为：1/2MS+1.6mg/LNAA+23g/L蔗糖+4.8g/L琼脂+0.4g/L活性炭，pH为5.6。

(5)移栽：将步骤(4)得到的健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗4天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的大田土壤、细沙的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为98.2％。

上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为26℃，光照强度为2700lx，光照时间为13小时/天。

实施例三

(1)外植体采集：2016年春季，在云南丽江野外选取生长健壮的葫芦茶的新生茎段为外植体。

(2)不定芽诱导：将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗过夜后于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒60分钟，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟。无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5分钟，无菌水冲洗7次后经无菌滤纸吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中在28℃进行全暗培养45天即可诱导形成不定芽，诱导率为89.6％，污染率低于2％。所述的不定芽诱导培养基为：MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。

(3)继代培养：将步骤(2)所得的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到不定芽增殖培养基中培养30天即可实现不定芽的大量增殖，增殖系数达到6.3倍。所述的不定芽增殖培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8。

(4)生根培养：切取步骤(3)增殖得到的长约2～3cm的不定芽并接种到生根培养基中培养30天即能实现试管苗的生根，生根为92.5％。所述的生根培养基为：1/2MS+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8。

(5)移栽：将步骤(4)得到的健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗3～5天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的大田土壤、细沙的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为98.4％。

上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为3000lx，光照时间为14小时/天。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。