猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的联合生成、纯化方法

摘要

本发明涉及猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的联合生成、纯化方法，技术路线为：猪胆汁膏皂化水解→溶解脱色→2次酸化、过滤(PH梯度法)→猪去氧胆酸粗品和鹅去氧胆酸粗品；猪去氧胆酸粗品→烘干→溶剂结晶→猪去氧胆酸晶体成品；鹅去氧胆酸粗品→离子交换层析→酸化离心→鹅去氧胆酸成品。技术方案用PH梯度法分离猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸粗品，其中猪去胆酸收率可达85％以上；鹅去氧胆酸收率为83％以上；进一步纯化后，猪去氧胆酸含量达到98％以上，收率达到65％以上；进一步纯化后，鹅去氧胆酸含量达到98％以上，收率达到70％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工领域，特别涉及猪去氧胆酸粗品、鹅去氧胆酸的联合生成、纯化方法。

背景技术

猪去氧胆酸为从猪胆汁中提取的一种胆烷酸，白色或略带微黄色粉末，味苦。臭微腥。略溶于醇，丙酮中微溶，乙醚、氯仿中极微溶，几不溶于水。猪去氧胆酸能抑制胆酸的形成及溶解脂肪，降低血中胆固醇和甘油三酯，适用于Ⅰa或Ⅰb型高血脂症、动脉粥样硬化症，而且对百日咳杆菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌等有一定的抑菌作用，也可用作消炎药，治疗慢性支气管炎、小儿病毒性上呼吸道炎症等。

鹅去氧胆酸主要作用是降低胆汁内胆固醇的饱和度，绝大多数患者服用鹅去氧胆酸后(当鹅去氧胆酸占胆汁中胆盐的70％时)，脂类恢复微胶粒状态，胆固醇就处于不饱和状态，从而使结石中的胆固醇溶解、脱落。大剂量的鹅去氧胆酸(每日10～15mg/kg)可以抑制胆固醇的合成，并增加胆石症患者胆汁的分泌，但其中的胆盐和磷脂分泌量维持不变。目前鹅去氧胆酸是世界上用量最大的治疗胆结石药物之一，又是合成熊去氧胆酸(UDCA)和其他甾体化合物的原料。

传统的从猪胆汁膏中提取、纯化猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的方法，提取制备工艺过程复杂，收率低，特别是纯度上不去，只能达到90％左右，且溶剂损耗量大，而且周期长，不适合工业化大生产。目前也有各种柱层析纯化猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的方法，虽然晶体的纯度提高可达到98％以上，但产率较低，猪去氧胆酸的产率普遍在30％以下，鹅去氧胆酸的产率在20％以下。

发明内容

为此，需要提供适合工业化生产的高纯度和高产率的猪去氧胆酸粗品、鹅去氧胆酸的提取、纯化方法。

为实现上述目的，发明人提供了一种猪去氧胆酸粗品和鹅去胆酸粗品的联合生成方法，包括以下步骤，

皂化水解：将1质量份猪胆汁膏加入6～10质量份浓度为16％～20％的氢氧化钠溶液，加热煮沸至猪胆汁膏完全溶解，制成第一混合溶液，将第一混合溶液继续煮沸回流18～20小时完成皂化，弃碱水层，得到第一胶状液；

溶解脱色：将第一胶状液加入8～12质量份的水，搅拌至完全溶解，控制溶解温度为40～50℃，制成第二混合溶液；搅拌第二混合溶液的同时缓缓加入0.05～0.1质量份浓度为30％～35％的氢氧化钠溶液，制成第三混合溶液，将第三混合溶液搅拌15～25分钟后静置12～24小时进行脱色，得到第四混合溶液；

一次酸化：将第四混合溶液加入8～12质量份的水，搅拌加热至60～80℃，制成第五混合溶液；用体积百分比浓度为25％的醋酸溶液，调节第五混合溶液的pH值为7～8；

一次过滤：将第五混合溶液冷却至室温后进行过滤，除去沉淀物，得到第一滤液；

二次酸化：将第一滤液搅拌加热至60～80℃，用体积百分比浓度为25％的醋酸溶液，调节第一滤液的pH值为5～7；

二次过滤：冷却第一滤液至40℃并静置12～24小时，制成第一悬浊液；将第一悬浊液使进行离心，获得第二滤液和第一离心物；将第一离心物进行水洗，得到第一水洗液和猪去氧胆酸粗品，将第二滤液和第一水洗液过滤后合并为第三滤液；

三次酸化：将第三滤液搅拌加热至60～80℃，用体积百分比浓度为25％的醋酸溶液，调节第三滤液的pH值为4.5～6.5；

三次过滤：冷却第三滤液至40℃并静置12～24小时，制成第二悬浊液；将第二悬浊液进行离心，获得第二离心物；将第二离心物进行水洗，得到鹅去氧胆酸粗品。

在热状态(60～80℃)下加醋酸对溶液进行的三次酸化(pH分别为7～8、5～7、4.5～6.5)，然后进行冷却，这使得溶液pH值轻微降低，可以从溶液中分别析出不同pH范围的物质：脂肪、蛋白质第一次酸化后析出、猪去氧胆酸粗品第二次酸化后析出、鹅去氧胆酸在第三次酸化后析出。

进一步地，所述二次过滤和三次过滤步骤中，使用400目离心袋进行离心。

进一步地，所述二次过滤步骤中，将第二滤液和第一水洗液用0.45μm滤膜过滤后合并为第三滤液。

发明人还提供了一种猪去氧胆酸的纯化方法，包括以下步骤，

烘干：将猪去氧胆酸粗品烘干，烘干温度为60～80℃，得到第一固态物，第一固态物的含水量在1％质量百分比以下。

溶剂结晶：将1质量份的第一固态物放置于反应釜中，加10～15质量份的乙酸乙酯，加热煮沸回流1.5～2.5小时，第一固态物完全溶解，制成第六混合溶液；将第六混合溶液加热至60～70℃，用稀硫酸溶液调节第六混合溶液至pH为8～9，加入3质量份的水，制成第七混合溶液；搅拌第七混合溶液并在搅拌过程中加入0.2～0.25质量份硫酸镁，制成第八混合溶液；将第八混合溶液过滤获得第四滤液，搅拌第四滤液冷却至15～25℃，冷却后的第四滤液结晶析出第一晶体，将第一晶体进行离心，获得猪去氧胆酸成品。

发明人还提供了一种鹅去氧胆酸的纯化方法，包括以下步骤，

溶液配制：将1质量份的鹅去氧胆酸粗品加入14～16质量份的水和0.1～0.3质量份的碳酸氢钠，煮沸回流至完全溶解后进行过滤，得到第五滤液；调节第五滤液的pH值为8～9；

柱层析：将第五滤液以每小时1～2倍柱体积流速进行上样吸附；依次用纯水、1％氯化钠溶液、3％氯化钠溶液进行3次色谱柱洗脱，收集第3次洗脱的洗脱液；

酸化离心：将洗脱液用10％浓度的硫酸酸化至pH为3～4，制成第三悬浊液，将第三悬浊液进行离心，得到鹅去氧胆酸晶体。

进一步地，所述离子交换色谱柱为D208或D309型号阴离子树脂。

进一步地，所述柱层析步骤，纯水为第一洗脱剂，以每小时2～3倍柱体积流速进行色谱柱洗脱，至洗脱液pH值为6.8～7.2；1％氯化钠溶液为第二洗脱剂，以每小时3～4倍柱体积流速进行色谱柱洗脱，洗脱时间为2小时；3％氯化钠溶液为第三洗脱剂，以每小时3～4倍柱体积流速进行色谱柱洗脱，洗脱时间为2小时。

进一步地，鹅去氧胆酸的纯化方法，还包括以下步骤：

晶体干燥：将鹅去氧胆酸晶体进行真空干燥，干燥温度控制60～70℃，真空度小于-0.08Mpa，真空干燥时间控制在10～12小时，得到干燥的鹅去氧胆酸晶体。

区别于现有技术，上述技术方案可同时提取猪去氧胆酸粗品及鹅去氧胆酸粗品，猪去氧胆酸粗品中猪去氧胆酸收率可达到85％以上；进一步纯化后晶体中猪去氧胆酸的含量可达到98％以上，猪去氧胆酸的收率可达到65％以上；鹅去氧胆酸粗品中鹅去氧胆酸收率可达到80％以上；进一步纯化后晶体中鹅去氧胆酸的含量可达到98％以上，鹅去氧胆酸的收率可达到70％以上。

附图说明

图1为猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的联合生成、纯化方法的技术路线图。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

请参阅图1，猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的联合生成、纯化方法的技术路线图。

本实施方式中使用HPLC来确定原材料以及分离、纯化后的猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量。本实施方式中，作为各实施例原料的猪胆汁膏中猪去氧胆酸含量为20％，鹅去氧胆酸的含量为13.9％。

实施例1猪去氧胆酸粗品和鹅去胆酸粗品的提取：

皂化水解：将100g猪胆汁膏加入800g浓度为18％的氢氧化钠溶液，加热煮沸至猪胆汁膏完全溶解，继续煮沸回流20小时完成皂化，弃碱水层，得到上层胶状液；

溶解脱色：将胶状液加入1000g的水，搅拌至完全胶状液完全溶解，控制溶液温度为45℃，继续搅拌溶液，同时缓缓加入5g浓度为35％的氢氧化钠溶液，继续搅拌溶液20分钟后静置24小时进行脱色；

首次酸化：溶液加入1000g的水，加热并搅拌至温度达到70℃；边搅拌边加入体积百分比浓度为25％的醋酸溶液，调节溶液的pH值为7.2；

首次过滤：将溶液冷却至室温后进行过滤，除去沉淀物，得到滤液；

二次酸化：将滤液搅拌加热至70℃，边搅拌边加入体积百分比浓度为25％的醋酸溶液，调节溶液pH值为6；。

二次过滤：冷却溶液至40℃并静置15小时，溶液出现浑浊沉淀，使用400目离心袋进行离心，分离离心物和母液，离心物进行水洗，收集水洗沉淀物和洗液，水洗沉淀物为25g猪去氧胆酸粗品；将母液和洗液用0.45μm滤膜过滤后合并得到混合滤液

三次酸化：滤液搅拌加热至70℃，用体积百分比浓度为25％的醋酸溶液，调节第四滤液的pH值至5.5；

三次过滤：冷却滤液至40℃并静置12小时，滤液出现浑浊沉淀，用400目离心袋进行离心，离心物进行水洗，收集水洗沉淀物，得到21g的鹅去氧胆酸粗品。

将实施例1所得的25g猪去氧胆酸粗品和21g鹅去氧胆酸粗品用HPLC进行含量测试，测试结果为猪去胆酸粗品中猪去氧胆酸含量为70％，猪去胆酸的收率为87.5％；鹅去胆酸粗品中鹅去氧胆酸含量为55％，鹅去胆酸的收率为83.1％。

实施例2猪去氧胆酸的纯化

烘干：将实施例1获得的25g猪去氧胆酸粗品置于烘箱中烘干，烘箱温度控制为60～80℃，得到17g第一固态物。第一固态物的含水量为0.6％。

溶剂结晶：将17g的第一固态物放置于反应釜中，加200g的乙酸乙酯，加热煮沸回流2小时，第一固态物完全溶解，继续加热溶液至65℃，用稀硫酸溶液调节pH为8.3，加入50g的水进行稀释；搅拌稀释液的同时加入3.5g的硫酸镁；溶液冷却至室温，静置过夜，并用0.45μm滤膜进行过滤获得滤液，搅拌冷却滤液至20℃，冷却后的滤液结晶析出晶体，将晶体进行离心，获得13.8g猪去氧胆酸成品。

将实施例2所得的猪去氧胆酸成品用HPLC进行含量测试，测试结果为，猪去胆酸成品中猪去氧胆酸含量为98％，猪去胆酸的收率为67.6％。

实施例3鹅去氧胆酸的纯化

溶液配制：将实施例1获得的21g的鹅去氧胆酸粗品加入300g的水、4.2g的碳酸氢钠，加热回流至完全溶解后进行过滤，得到滤液，调节滤液pH值为8。

柱层析：色谱柱采用D309型号阴离子树脂，滤液以每小时2倍柱体积(BV)流速通过离子交换色谱柱，进行上样吸附。用纯水，以3BV/小时流速洗脱色谱柱，洗脱3小时，至洗脱液pH值为7.0；再用1％氯化钠溶液，以3BV/小时流速洗脱色谱柱，洗脱2小时；继续用3％氯化钠溶液，以3BV/小时流速洗脱色谱柱，洗脱2小时；

酸化离心：收集3％氯化钠溶液洗脱液，用稀硫酸(10％)酸化至PH为3.2，400目滤布离心，收集白色沉淀物，得到鹅去氧胆酸晶体。

将鹅去氧胆酸晶体进行真空干燥，干燥温度控制65℃，真空度小于-0.08Mpa，真空干燥12小时，得到10g的鹅去氧胆酸干燥晶体，干燥晶体的含水量为0.5％。

将实施例3所得的鹅去氧胆酸干燥晶体用HPLC进行含量测试，测试结果为鹅去胆酸晶体中鹅去氧胆酸含量为99％，鹅去胆酸的收率为71.2％。

由以上实施例和对比实施例可看出，本发明所提供的制备和纯化方法，可得到高纯度的猪去胆酸和鹅去胆酸的同时收率提高，避免造成原料中有效物质的浪费。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。