一种胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物及其合成方法和应用方法

摘要

本发明提供了一种胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物及其合成方法和应用方法。该聚合物能够插入到细胞膜表面，并明显促进细胞黏附和增殖等细胞行为。本发明中胆固醇锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物首先通过胆固醇与酰溴反应制备带有溴基团的胆固醇分子，并将其作为原子转移自由基聚合的引发剂制备聚合物。胆固醇锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物通过胆固醇基团与细胞膜之间的亲和作用，将聚合物引入到细胞表面，一定程度上增强了细胞间的信息交流，从而更加有利于促进细胞黏附和增殖等细胞行为。本发明合成过程简单，是实现制备胆固醇末端修饰的系列性聚合物的强大手段。

说明书

技术领域

本发明涉及小分子、聚合物合成以及生物医学应用领域，具体涉及一种胆固醇锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物及其合成方法和应用方法。

背景技术

细胞表面工程是一项基于细胞膜的研究，对于哺乳动物细胞而言，其细胞表面存在很多调控细胞功能和行为的分子，这些分子分为三类：膜脂、膜糖和膜蛋白，因此哺乳动物细胞表面具有高度异质的化学环境，细胞表面工程就是利用膜上的这些分子对细胞表面进行改性和修饰。

应用于生物体内的材料需要具有优良的生物相容性，聚乙二醇具有无细胞毒性、免疫原性和无抗原性，与蛋白或细胞直接接触反应也不会破坏蛋白或细胞的生物活性，所以聚乙二醇分子被广泛地用于医药领域。胆固醇分子是膜脂的一种，它能够作为锚定基团对具有生物活性的聚合物进行修饰，从而将合成的外源聚合物直接引入到细胞表面，通过这种方法研究细胞表面不同的化学组成对细胞黏附和增殖等行为的影响，对于组织工程具有重要的科学价值和社会意义。

在这种方法的基础上可以对由胆固醇引发的聚合物进行选择与修饰，制备出具有特定功能的插膜物质，实现细胞膜的改性并调控细胞行为，为细胞膜表面工程提供一项可行性的方案。

发明内容

要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物及其合成方法，实现其对细胞膜的修饰及在促进细胞黏附、增殖方面的应用。

为达到上述目的，本发明采用的一种技术方案为：一种胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物，其分子为：

本发明一个较佳实施例，其结构式具体为：

本发明采用的技术方案为：一种胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的合成方法，包括以下步骤：

(1)将胆固醇(Chol)与2-溴异丁酰溴(BIBB)溶于溶剂一中，加入吡啶类催化剂和胺类缚酸剂，反应后得到带有溴基团的胆固醇分子(Chol-Br)；

(2)将聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯单体(OEGMA)溶于溶剂二中，加入带有溴基团的胆固醇分子(Chol-Br)，利用原子转移自由基聚合(ATRP)技术进行聚合得到胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOEGMA)。

本发明一个较佳实施例，所述步骤(1)中的溶剂一为二氯甲烷。

本发明一个较佳实施例，所述步骤(1)中的吡啶类催化剂为4-二甲氨基吡啶。

本发明一个较佳实施例，所述步骤(1)中的胺类缚酸剂为三乙胺。

本发明一个较佳实施例，所述步骤(2)中的溶剂二为无水乙醇。

本发明采用的进一步的技术方案为：一种胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的合成方法，包括以下步骤：

(1)将胆固醇(Chol)与2-溴异丁酰溴(BIBB)溶于二氯甲烷中，加入纯化的4-二甲氨基吡啶和三乙胺，在60℃下反应后，得到带有溴基团的胆固醇分子(Chol-Br)；

(2)将聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯单体(OEGMA)溶于无水乙醇中，加入带有溴基团的胆固醇分子(Chol-Br)，在60℃下反应，利用ATRP技术进行聚合得到胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOEGMA)。

本发明采用的一种技术方案为：一种胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的应用方法，向种有对象真核细胞的培养板内加入含有胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的培养液，培养孵育。

本发明一个较佳实施例，所述对象真核细胞为小鼠成纤维瘤细胞或人体宫颈癌细胞中的任一一种。

本发明采用的进一步的技术方案为：一种胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的应用方法，向种有小鼠成纤维瘤细胞的培养板内加入含有胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的无血清培养液，在37℃下进行培养孵育后，用无菌PBS溶液清洗。

本发明采用的进一步的技术方案为：一种胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的应用方法，向种有人体宫颈癌细胞的培养板内加入含有胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的无血清培养液，在37℃下进行培养孵育后，用无菌PBS溶液清洗。

有益效果：本发明的胆固醇锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物，利用化学活性基团之间的反应以及ATRP技术获得了可以插入到细胞膜上并能够在促进细胞黏附和增殖的高分子物质。与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：

1.本发明利用胆固醇的亲脂性将聚合物引入到细胞表面，研究处于细胞表面微环境的聚合物对细胞的黏附、增殖等行为的影响；

2.本发明所述的胆固醇锚定的合成方法和提纯过程简单，普适性强，适用于几乎任何ATRP聚合物。

附图说明

图1中为实施例2中所获得的带有绿色荧光素标记的胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOF)的¹H-NMR谱图；

图2中为实施例3中利用带有绿色荧光素标记的单纯的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(pOF)以及本方法合成的带有绿色荧光素标记的胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOF)对人体宫颈癌细胞细胞膜修饰的结果对比，其中control为未加任何聚合物对细胞膜修饰结果，p(OEGMA)为带有绿色荧光素标记的单纯的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物对细胞膜修饰结果，Chol-p(OEGMA)为带有绿色荧光素标记的胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物对细胞膜修饰结果；

图3是实施例4中利用胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物Chol-pOEGMA培养的小鼠成纤维瘤细胞黏附和增殖现象。

具体实施方式

实施例1：胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOEGMA)的合成

(1)将胆固醇与2-溴异丁酰溴溶于二氯甲烷中，加入纯化的4-二甲氨基吡啶和纯化的三乙胺，60℃下反应，纯化后得到带有溴基团的胆固醇分子；

(2)将聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯单体溶于无水乙醇中，加入带有溴基团的胆固醇分子，60℃下反应，利用ATRP技术进行聚合得到胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOEGMA)。

实施例2：绿色荧光素标记的胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOF)的合成

(1)将胆固醇与2-溴异丁酰溴溶于二氯甲烷中，加入纯化的4-二甲氨基吡啶和纯化的三乙胺，60℃下反应，纯化后得到带有溴基团的胆固醇分子；

(2)将聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯单体(OEGMA)与甲基丙烯酸酯单体(FluMA)溶于无水乙醇中，加入带有溴基团的胆固醇分子(Chol-Br)，60℃下反应，利用ATRP技术进行聚合得到绿色荧光素标记的胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOF)。

绿色荧光素标记的胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的¹H-NMR谱图见图1。

实施例3：带有绿色荧光素标记的胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOF)的应用于人体宫颈癌细胞进行细胞膜修饰

(1)将人体宫颈癌细胞种植于培养板上，加入胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物的无血清高糖(DMEM)培养液，37℃恒温培养箱中孵育10min；

(2)弃去上述孵育细胞的培养液，无菌PBS清洗细胞2～3次除去过量的聚合物。

用与实施例3相同的方法将人体宫颈癌细胞在含有绿色荧光素标记的单纯的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(pOF)和未加任何聚合物的培养液中，37℃恒温培养箱中孵育10min，弃去上述孵育细胞的培养液，无菌PBS清洗细胞2～3次。然后分别用4wt％多聚甲醛溶液对培养板上的细胞进行固定，在共聚焦荧光显微镜下观察聚合物在细胞膜表面的修饰情况，见图2。

实施例4：小鼠成纤维瘤细胞培养后的细胞黏附和增殖情况

(1)将制备的胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOEGMA)溶于PBS缓冲液中得到初始浓度为2mg/mL的聚合物溶液，然后进行无菌过滤待用。将培养的L929细胞消化计数，按1×10⁴每孔的数量种在96孔板中，加入聚合物溶液和RPMI1640培养液并将聚合物的终浓度分别设置为0.1mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL，每种浓度设置3个平行样，并设置一组无聚合物溶液的对照组，然后将细胞放入恒温培养箱中培养；

(2)按照设定的时间终止孵育，吸出孵育液并用无菌PBS洗液清洗2次，加入200μLRPMI1640培养液和20μLCCK溶液，放入恒温培养箱中培养1h。1h之后吸出200μL溶液分别于新的孔板中，用酶标仪检测每孔溶液的在450nm处的吸光值。

图3是CCK8试剂检测细胞毒性分析不同浓度胆固醇基团锚定的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯聚合物(Chol-pOEGMA)培养的细胞分别培养1day和3days后活细胞的数量，1day和3days的实验结果表明浓度为0.25mg/mL的聚合物对细胞具有较好的促进增殖现象。

以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。