一种解析水稻叶际内生细菌菌群结构的方法

摘要

本发明公开了一种解析植物叶际内生细菌菌群结构的方法。该方法包括如下步骤：a)提取植物及其叶际内生菌总DNA；b)以总DNA为模板，采用引物对1(序列1和序列2)进行第一次PCR扩增，得到PCR产物1；以所述PCR产物1为模板，采用引物对2(序列3和序列4)进行第二次PCR扩增，得到PCR产物2；(c)对所述PCR产物2进行测序，根据测序结果鉴定菌种，从而解析植物叶际内生细菌菌群结构。本发明打开了植物叶际内生细菌非培养法研究的大门，使得该领域的后续研究成为可能，并为整个植物叶际内生细菌研究领域提供了借鉴。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种解析植物叶际内生细菌菌群结构的方法，特别涉及一种利用嵌套PCR技术解析水稻叶际内生细菌菌群结构的方法。

背景技术

植物内生菌是指定殖于植物组织内的微生物，包括内生真菌和内生细菌，在植物生长发育的整个生命历程中，植物内生菌调节宿主植物的营养状态、参与宿主植物对环境胁迫(包括生物因素和非生物因素)的响应。

水稻是全球范围内最重要的粮食作物之一，对水稻内生菌的研究将为水稻营养、抗病等相关研究提供借鉴和指导意义。对于植物共生菌群的研究，目前主要集中于对其根际微生物的关注，水稻也不例外。从分子水平分析，PCR扩增中植物DNA对内生细菌16S rDNA的干扰是主要原因之一。植物细胞中线粒体和叶绿体两种细胞器均含有DNA，其中，线粒体的18S rDNA和叶绿体的16S rDNA与细菌菌种测序鉴定所用的细菌16S rDNA序列同源性非常高。植物根细胞只有线粒体，而地上部分绿色组织既有线粒体又有叶绿体，对菌群测序鉴定的干扰更大，很难同时排除该两种干扰。因此，目前还没有成熟的方法来解析植物叶际内生细菌的菌群结构。

就水稻而言，水稻是一种单子叶草本植物，植株结构简单，主要由地上部分的叶和地下部分的根组成。水稻内生菌的研究也可以由此分为根际菌群和叶际菌群两个方向。目前，水稻叶际菌群的研究远少于根际菌群，根据Web of Science的检索结果，水稻叶际菌群的研究仅停留在对叶片表面非定殖细菌的研究上，而水稻叶际内生细菌的研究目前还是空白，主要原因就是缺少叶际内生细菌的测序方法。

16S rDNA是细菌分类鉴定的分子钟，16S rDNA测序是目前微生物群落多样性测序的常用方法。16S rDNA存在于所有生物中，而且结构和功能高度保守。结构上，16S rDNA长约1.5Kb，由序列恒定区和序列可变区交替排列组成，因此，在应用上，可以根据16S rDNA的的序列恒定区设计引物，扩增出含有几个可变区的序列片段，然后根据可变区的序列特异性进行菌种的分类鉴定。16S rDNA测序结合二代测序技术平台，从而实现对菌群多样性的深度解析。水稻叶际内生细菌的测定也需要采用16S rDNA测序，但是问题如前文所述，水稻叶肉细胞中线粒体DNA和叶绿体DNA的存在使得扩增产物中这两种干扰占到90％以上的比例，细菌的序列信息几乎被覆盖掉，严重影响测序后数据的分析及分析质量的科学性。

目前，急需一种水稻叶际内生细菌的测序方法来开展水稻叶际内生细菌的相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种解析植物叶际内生细菌菌群结构的方法。

本发明所提供的解析植物叶际内生细菌菌群结构的方法，是基于嵌套PCR技术的，具体可包括如下步骤：

(a)提取植物及其叶际内生菌总DNA；

(b)以步骤(a)提取的总DNA为模板，采用引物对1进行第一次PCR扩增，得到PCR产物1(16S rDNA的V3-V8区)；以所述PCR产物1为模板，采用引物对2进行第二次PCR扩增，得到PCR产物2(16S rDNA的V5-V7区)；

所述引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。

其中，所述引物对1中两条引物的3’端均与植物线粒体18S rDNA序列有差异位点而与植物叶绿体和细菌的16S rDNA序列相同，因而可以避开线粒体序列，使得扩增产物为植物叶绿体16S rDNA和细菌16S rDNA的混合物(即所述PCR产物1为植物叶绿体16S rDNA和细菌16S rDNA的混合物)。所述引物对2中两条引物的3’端均与植物叶绿体16S rDNA序列有差异位点而与细菌的16S rDNA序列相同，因而可以避开叶绿体序列，使得扩增产物只有细菌16S rDNA(即所述PCR产物2为植物叶际内生细菌16S rDNA)。

(c)对所述PCR产物2(16S rDNA的V5-V7区)进行测序，根据测序结果鉴定菌种，从而解析植物叶际内生细菌菌群结构。

在步骤(a)中，所述提取植物及其叶际内生菌总DNA的方法，具体可包括如下步骤：

(a1)取植物叶片，去除表面细菌后进行液氮研磨；

其中，所述去除表面细菌具体可按照如下操作：将所述植物叶片先用体积百分含量为75％的乙醇浸泡5min，然后将所述植物叶片转移至加有表面活性剂Tween20的无菌水中，震荡，最后用无菌水清洗。

(a2)取液氮研磨后样品，加入TE缓冲液，涡旋振荡，充分混匀；

其中，所述TE缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：10mM Tris，1mM EDTA；pH 8.0。

(a3)加入SDS和蛋白酶K，涡旋振荡，充分混匀；

其中，所述SDS是以浓度为10％(10g/100ml)的SDS溶液的形式加入的，所述蛋白酶K是以浓度为100μg/ml的蛋白酶K溶液的形式加入的。

(a4)加入RNA酶，37℃温浴1h-2h(如1h)；

(a5)加入浓度为5M的NaCl溶液，混匀后再加入CTAB/NaCl溶液，混匀后65℃温育10min；

所述CTAB/NaCl溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.7M NaCl，10％(10g/100ml)CTAB。

(a6)对步骤(a5)所得样品依次进行DNA抽提、DNA沉淀和DNA溶解，从而获得所述植物及其叶际内生菌总DNA。

其中，对步骤(a5)所得样品依次进行DNA抽提、DNA沉淀和DNA溶解的具体步骤如下：1)向步骤(a5)所得样品中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)，混匀，10000g离心5min，取上清；2)加入等体积的氯仿/异戊醇(1∶1，体积比)，混匀，10000g离心5min，取上清；3)加入0.6-0.8倍(如0.7倍)倍体积的异丙醇，轻轻混匀，10000g离心5min，弃上清收集DNA沉淀；4)沉淀用1ml的70％(体积百分含量)乙醇洗涤后，10000g离心5min，弃上清；5)晾干后加ddH₂O溶解DNA；6)Nanodrop测DNA浓度后，加ddH₂O稀释至～50ng/μl，-20℃保存。

在步骤(a)中，所述TE缓冲液、所述SDS、所述蛋白酶K、所述RNA酶、所述浓度为5M的NaCl溶液和所述CTAB/NaCl溶液的配比具体可为567μl：3mg：0.76U：200μg：100μl：80μl。

在步骤(b)中，进行所述第一次PCR扩增和所述第二次PCR扩增时，所采用的DNA聚合酶均为高保真KOD Plus(东洋纺，日本)。

在步骤(b)中，进行所述第一次PCR扩增时，所采用的退火温度为63℃；进行所述第二次PCR扩增时，所采用的退火温度为54℃。

更加具体的，进行所述第一次PCR扩增时，所采用的扩增程序为：95℃3min；95℃30s，63℃30s，72℃1min06s，30个循环；72℃，10min。进行所述第二次PCR扩增时，所采用的扩增程序为：95℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，10min。

当PCR扩增需要重复以保证其建库所需PCR产物量的需求时，每个样本的PCR扩增重复应该由1^st>

步骤(c)中，所述测序可为二代测序。

本发明还保护由引物对1和引物对2组成的成套引物对。

其中，所述引物对1具体由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述引物对2具体由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。

本发明也保护所述引物对1。

所述成套引物对或所述引物对1在解析植物叶际内生细菌菌群结构中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明的实施例中，所述植物具体为水稻或拟南芥。

本发明优化了植物及其内生菌总DNA的提取方案，通过对PCR方案的不断优化(包括酶的选择、污染源的排除、扩增流程的探索等)，并结合二代测序技术平台，最终建立了一种利用引物对329F/1417R和799F/1193R的嵌套PCR技术对水稻叶际内生细菌测序的实验方案，打开了水稻叶际内生细菌非培养法研究的大门，使得该领域的后续研究成为可能，并为整个植物叶际内生细菌研究领域提供了借鉴。

附图说明

图1为1^st>

图2为2^nd>

图3为样品稀释曲线。

图4为实施例3中样品菌群组成相对丰度柱形图(属水平)。该图是各样品在属水平上的物种相对丰度柱形图，展示了物种相对丰度排名前十的10个属，这10个属之外的其他所有属的相对丰度之和以others表示。

图5为菌群组成维恩图。该图中的数字表示OTUs的个数，展示了三组共有OTUs的情况。

图6为NMDS分析图。

图7为对比例1中样品菌群组成相对丰度柱形图(属水平)。该图是各样品在属水平上的物种相对丰度柱形图，展示了物种相对丰度排名前十的10个属，这10个属之外的其他所有属的相对丰度之和以others表示。

图8为对比例2中样品菌群组成相对丰度柱形图(属水平)。该图是各样品在属水平上的物种相对丰度柱形图，展示了物种相对丰度排名前十的10个属，这10个属之外的其他所有属的相对丰度之和以others表示。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、水稻及其叶际内生菌总DNA提取实验方案

1)准备：实验中用到的研砵、研锤、离心管、镊子等均提前高压蒸汽灭菌处理。

2)去除水稻叶片组织表面的细菌：将-80℃冻存的水稻叶片先用75％(体积百分韩浪)乙醇浸泡5min，然后将所述水稻叶片转移至加有表面活性剂Tween20(AMRESCO，Solon，USA)的无菌水中(ddH₂O和Tween20按1000:1的体积比加入，涡旋震荡2-5min)，最后用灭菌ddH₂O清洗4遍。

3)液氮充分研磨后取约100mg置于2ml离心管中。

4)加567μl TE缓冲液(配方：溶剂为水，溶质为10mM Tris，1mM EDTA；pH8.0)，涡旋振荡，充分混匀。

5)加入30μl 10％(10g/100ml)SDS和20μl的蛋白酶K(100μg/ml，AMRESCO，Solon，USA)(相当于0.76U蛋白酶K)，涡旋振荡，混匀。

6)加入2μl RNase(100mg/ml，天根生化科技公司，北京)，颠倒混匀于37℃温育1小时。

7)加入100μl 5M NaCl，颠倒混匀后，加入80μl CTAB/NaCl溶液(配方：溶剂为水，溶质为0.7M NaCl，10％(10g/100ml)CTAB)，颠倒混匀后再65℃温育10min。

8)加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)，混匀，10000g离心5min，取上清。

9)加入等体积氯仿/异戊醇(1∶1，体积比)，混匀，10000g离心5min，取上清。

10)加入0.7倍体积的异丙醇，轻轻混匀，10000g离心5min，弃上清收集DNA沉淀.

11)沉淀用1ml的70％(体积百分含量)乙醇洗涤后，10000g离心5min，弃上清。

12)晾干后加ddH₂O溶解DNA。

13)Nanodrop测DNA浓度后，加ddH₂O稀释至50ng/μl，-20℃保存。

实施例2、嵌套PCR扩增

1、模板：实施例1的方法提取的水稻叶片及其内生菌总DNA

2、酶：KOD Plus(东洋纺，日本)

3、引物(浓度10μM)：329F/1417R，799F/1193R

329F：5’–ACGGHCCARACTCCTACGGGA-3’(序列1)；

1417R：5’–GTGTACAAGRCCCGGGAACG-3’(序列2)。

799F：5’–AACMGGATTAGATACCCKG-3’(序列3)；

1193R：5’–ACGTCATCCCCACCTTCC-3’(序列4)。

其中，H表示A或C或T；R表示A或G；M表示A或C；K表示G或T。引物329F/1417R的扩增产物为16S rDNA的V3-V8区，引物799F/1193R的扩增产物为16S rDNA的V5-V7区。

4、嵌套PCR

(1)第一轮PCR扩增(1^st>

反应体系：10×KOD Buffer 5μl；2mM dNTP 5μl；MgSO₄2μl；KOD>2O补足至50μl。

扩增程序：95℃3min；95℃30s，63℃30s，72℃1min06s，30个循环；72℃，10min。

1^st>

(2)第二轮PCR扩增(2^st>

反应体系：10×KOD Buffer 5μl；2mM dNTP 5μl；MgSO₄>st>3倍)1μl；ddH₂O补足至50μl。

扩增程序为：95℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，10min。

2^nd>

实施例3、扩增产物的测序鉴定

一、单克隆测序法

1、回收纯化扩增产物

(1)1％琼脂糖凝胶电泳之后，将含有目的条带的胶条切下，置于1.5ml离心管(AXYGEN)中。

(2)用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega，Madison，USA)试剂盒进行回收纯化，按照说明书进行操作。

(3)最后加65℃预热的ddH₂O>

2、扩增产物连接至空载体构建完整质粒

目的片段：高保真的KOD Plus酶的PCR产物，即嵌套PCR的扩增产物。

载体：pEasy Blunt Simple Vector(全式金，北京，中国)

连接体系：载体1μl；目的片段4μl。

反应条件：25℃，10min。

3、转化至感受态细胞并筛选阳性转化子

(1)-80℃冻存的感受态细胞Trans1-T1(全式金，北京，中国)取出置于冰上，约5min后刚刚融化。

(2)冰浴：取刚刚融化的感受态50μl加入到连接产物的Ep管中，轻轻弹拨混匀，冰浴30min。

(3)热激：42℃水浴热激60s，立即置于冰上，冰置2min。

(4)复苏：加入500μl LB液体培养基，37℃，220rpm，培养45min。

(5)蓝白斑筛选：取4μl IPTG(1M)、40μl X-Gal(20mg/ml)、26μl ddH₂O，混匀后涂于与连接载体抗性一致的平板(LB固体培养基)。待IPTG和X-Gal被吸收后，将复苏的菌液均匀涂于平板上，37℃过夜培养。

4、单克隆测序

将筛选出的阳性转化子挑单斑送中美泰和生物公司进行测序。

5、比对鉴定PCR扩增产物

利用Vector NTI软件将测序结果与相应引物进行比对，并将比对结果在NABI数据库中进行Blast从而鉴定PCR扩增产物。

6、测序结果

嵌套PCR法扩增所用的模板为以2016年9月10日采于河南开封水稻试验田健康水稻叶片为材料提取的总DNA，单克隆测序所测27个单克隆全部为细菌16S rDNA序列，没有线粒体18S rDNA和叶绿体16S rDNA序列。单克隆测序的序列信息经NCBI数据库Blast比对后，将比对结果在GenBank中检索其生物学分类地位，将全部结果统计归类后得到表1。如表1所示，该27个单克隆除6个在NCBI数据库中检索不到生物学分类信息外，其余21个涵盖了细菌界的4个门、12个属。该结果表明，嵌套PCR法成功避开了线粒体18S rDNA和叶绿体16S rDNA两种干扰，能够从三者的混合模板中特异地扩增细菌16S rDNA，并且扩增没有偏好性即扩增产物具有丰富的多样性，使得水稻叶际内生细菌的非培养法研究成为可能。

表1嵌套PCR单克隆测序结果系统进化树

二、借助二代测序平台的高通量测序

嵌套PCR法的2^nd>st>3倍后作为模板，因此，存在该方法最终的扩增产物不能充分展现初始模板中细菌的多样性即代表性不强、覆盖度不够的可能。为了检测该方法是否有此缺陷，我们设置了实验，结合二代测序平台的高通量测序来进行分析。

(一)实验设计

1、DNA提取

材料：2016.09.13采于南京农业科学院实验田的健康水稻叶片，-80℃冻存。

方法：同实施例1。

2、PCR扩增

方法同实施例2。其中，2^nd>

具体扩增方案如下：

(1)1^st>

同一DNA模板做3个重复，得到3份PCR产物，分别记为a、b、c。

(2)2^nd>

a、b、c各取1μl加灭菌ddH₂O稀释1000倍，用移液枪反复吹打充分混匀，作为2^nd>nd>

嵌套PCR可行性验证扩增方案如表2所示。

表2嵌套PCR可行性验证扩增方案

3、高通量测序

将上步所得9个样品(a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3)送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序。本次测序利用Illumina HiSeq PE250测序平台，对嵌套PCR最终扩增产物16S rDNA的V5-V7区进行高通量测序，得到平均每个样品可用于后续分析的有效Tags为67361，有效Tags的平均长度为377bp；每个样品的OTUs数目均不低于300。

(二)实验结果及分析

分析分组方案如表3所示。

表3分析分组方案

1、物种多样性

样品稀释曲线(图3)中，所有样品的稀释曲线最终都趋于平缓，说明每个样品的测序深度合理即测序数据量是足够的，可以进行数据分析。

2、组间差异分析

物种相对丰度柱形图(图4)和维恩图(图5)直观地展示了两种分析分组方案中三组之间在物种的组成及丰度上相似度都很高，组间无明显差异；进一步，表4和表5的组间差异分析数据显示，三组之间两两比较，Anosim分析和Amova分析的p-value均大于0.05，说明组间没有显著性差异，MRPP分析significance指数大于0.05，也说明组间没有显著性差异，由此说明三组样本之间统计学上没有显著性差异。综合以上分析，三组样本没有显著性差异即没有分组的必要，说明嵌套PCR法的扩增产物不存在代表性不强、覆盖度不够的问题，即嵌套PCR法结合二代测序平台的高通量测序其所测数据具有代表性且覆盖度是足够的。

a方案和A方案比较，从物种相对丰度柱形图(图4)和维恩图(图5)可以比较直观地看出A方案的组间相似度略高。从图6的NMDS分析图中可以看出，两种分组方案相比较，A方案的分组方式其组间差异明显小于a方案。表4和表5比较可以看出，三种组间差异分析指数(Anosim分析的p-value、Amova分析的p-value以及MRPP分析significance指数)均大于0.05，特别是A方案Anosim分析的p-value以及MRPP分析significance指数均为1，说明100％的概率判定A方案的组间差异不显著。另外，两种分组分析方案的Anosim分析R-value相比较，a方案的R-value均大于0，表明a方案的组间差异大于组内差异，而A方案的R-value均小于零，表明其组内差异大于组间差异，即：相对于组间差异，A方案的的组内差异对总体的差异起了主要贡献，说明A方案的分组方式能够更大程度地避免抽样误差，数据覆盖度更高。由此，两种分析分组方案组间均无显著性差异，其中，A方案分组方式其组间相似度更高。

表4 a方案分组组间差异分析指数

表5 A方案分组组间差异分析指数

综合以上分析得出如下结论：1)嵌套PCR法结合二代测序平台的高通量测序其所测数据覆盖度足够、物种多样性丰富，具有可行性。2)嵌套PCR法应用于借助二代测序平台的高通量测序，当PCR扩增需要重复以保证其建库所需PCR产物量的需求时，每个样本的PCR扩增重复应该由1^st>

对比例1

鉴于没有可以同时避开植物叶绿体16S rDNA或者线粒体的18S rDNA序列的引物，在测定植物叶际内生细菌时，目前常规的做法是先扩增得到含有叶绿体16S rDNA或者线粒体的18S rDNA干扰的扩增产物，建库测序后再将干扰序列去掉，只用剩余的细菌16S rDNA序列进行后续分析。本发明的发明人按照该方法对水稻叶际内生细菌开展了高通量测序实验，具体如下：

按照实施例1的方法提取水稻叶片及其内生细菌总DNA。14个样品其取样地点分别为开封(K)、南京(N)、哈尔滨(H)、福州(Fz-w、Fz-t)、北京(Bj-w、Bj-f)。

将提取的DNA样品送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序，以引物799F/1193R(可以避开水稻叶绿体16S rDNA但能扩增出水稻线粒体16S rDNA)进行PCR扩增，利用Illumina HiSeq PE250测序平台建库测序。

结果分析：得到平均每个样品可用于后续分析的有效Tags为45743，有效Tags的平均长度为441bp；每个样品的平均OTUs数目为28。所测结果在属水平上的物种相对丰度柱形图如图7所示，绝大部分扩增产物都是水稻线粒体序列，只有10％左右的序列是细菌序列。

实施例3步骤二中的图5的所有样品都与图7中样品N1为相同的DNA模板来源(2016.09.13采于南京农业科学院实验田的健康水稻叶片，-80℃冻存)。首先，相比于以不能避免叶绿体序列干扰的引物进行扩增，嵌套PCR法扩增到的OTUs数目高出前者十多倍；另外，图5与图7相比较，说明：1)引物799F/1193R不能避免水稻线粒体序列的干扰，2)嵌套PCR法在测定水稻叶际内生细菌时能够避免水稻线粒体序列和叶绿体序列两种干扰。

对比例2

DNA提取：以温室培育的拟南芥为实验材料，按照实施例1的方法提取拟南芥叶片及其内生细菌总DNA，DNA样品共三个重复。

PCR扩增：1)按照实施例2嵌套PCR扩增流程分别对提取的三个DNA样品进行扩增，所得扩增产物记为At.q。2)按照实施例2嵌套PCR第二轮扩增的反应体系及流程以引物799F和1193R分别对提取的三个DNA样品进行一次扩增，所得扩增产物记为At。

高通量测序：扩增产物送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序，利用Illumina HiSeq PE250测序平台，得到平均每个样品可用于后续分析的有效Tags为74842，有效Tags的平均长度为376bp；每个样品的平均OTUs数目为171。

测序结果分析：所测结果在属水平上的物种相对丰度柱形图如图8所示，嵌套PCR法(At.q)和以引物799F和1193R进行一次扩增(At)的扩增产物中都含有拟南芥叶绿体序列，说明引物799F和1193R不能避免拟南芥叶绿体序列的干扰；两组相比较，At.q组的叶绿体序列含量明显少于At组，At.q组的细菌序列约占测序总量的60％，而At组的细菌序列不足测序总量的25％。

该结果表明：对于拟南芥叶际内生细菌的测序，引物799F和1193R不能避免叶绿体序列的干扰，而实施例3中当引物799F和1193R作为嵌套PCR法的第二轮扩增引物时，嵌套PCR法可以较大程度地减少叶绿体序列的干扰从而提高扩增产物中细菌序列的相对含量。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种解析水稻叶际内生细菌菌群结构的方法

<130> GNCLN170686

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> h为a或c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> r为a或g

<400> 1

acgghccara ctcctacggg a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> r为a或g

<400> 2

gtgtacaagr cccgggaacg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> m为a或c

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<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> k为g或t

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aacmggatta gataccckg 19

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgtcatccc caccttcc 18