一株抗坏血酸克吕沃尔菌及其应用

摘要

一株抗坏血酸克吕沃尔菌及其应用，属微生物技术领域。该菌株已于2017年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.13726,分类命名：抗坏血酸克吕沃尔菌Kluyvera ascorbata。本发明菌株是从云南野外紫茎泽兰寄生昆虫泽兰实蝇(Procecidochares utilis Stone)消化道筛分出来的，可在自然环境下快速侵染紫荆泽兰根茎，造成根茎病变，嫩茎、根部腐败，直至植株整株枯死，用于紫茎泽兰的防控，效果好成本低。

说明书

技术领域

本发明为微生物技术领域，具体为一株抗坏血酸克吕沃尔菌(Kluyveraascorbata)菌株及其应用。

背景技术

紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)，菊科泽兰属，多年生草本或亚灌木，能快速形成单优群落，并且会以多种方式抑制其它植物生长，是一种世界性的恶性杂草，也是我国现存危害最大的一种外来植物。由于紫茎泽兰含有多种有毒组分及恶臭组分，仅有泽兰等极少数物种对其有采食现象。近年来虽然人们对紫茎泽兰的治理采取了投放专性天敌、除草剂、植物防控等手段，但均收效甚微。

微生物作为一种高效、安全、无残留的现代农药在现代农业生产及科学研究中有着举足轻重的地位。相应地，针对紫茎泽兰的微生物农药研发也成为近年来紫茎泽兰防治领域的一个主要方向，但由于紫茎泽兰本身含有多种抑菌物质，导致研发工作至今也收效甚微。

发明内容

本发明的目的在于提供一株抗坏血酸克吕沃尔菌及其应用，以该抗坏血酸克吕沃尔菌为活性成分的菌剂用于紫茎泽兰的防控，效果好成本低。

本发明所提供的抗坏血酸克吕沃尔菌(Kluyvera ascorbata)，专利申请人的菌株编号为ZLSY22；该菌株已于2017年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.13726,分类命名：抗坏血酸克吕沃尔菌Kluyvera ascorbata。

本发明菌株ZLSY22 CGMCC No.13726的生物学特性为：

LB培养基(LB Medium)培养的菌落为乳白色，圆形隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，有臭味；

菌体为小的杆状细胞，0.5～0.7μm×2～3μm，革兰氏阴性，以稀周毛运动。

淀粉水解实验阴性，油脂水解实验阴性，石蕊牛奶实验阳性，尿素实验阴性；发酵葡萄糖可产酸，但不产气；吲哚实验阳性，柠檬酸盐实验阳性，硫化氢实验阴性，V-P阴性，M-R阳性。

本发明菌株是从云南野外紫茎泽兰寄生昆虫泽兰实蝇(Procecidochares utilisStone)消化道筛分出来的。本发明菌株可在自然环境下快速侵染紫荆泽兰根茎，造成根茎病变，嫩茎、根部快速腐败，直至植株整株枯死，是一种具有良好效果及开发研究前景的微生物。

本发明菌株ZLSY22 CGMCC No.13726用于防控紫茎泽兰。

本发明菌株ZLSY22 CGMCC No.13726可以由以下方法分离纯化得到：

泽兰实蝇采自云南农业大学化学楼附近的紫茎泽兰上，将有虫瘿的紫茎泽兰采回实验室。对采回的虫瘿整体消毒后在超净工作台内解剖出幼虫，幼虫用75％酒精漂洗三次，每次两分钟，无菌水漂洗三次后解剖，获得泽兰实蝇消化道。

1.灭菌

所用培养皿、离心管、试管，枪头等实验器材及无菌水均采用高压灭菌，0.1MPa，121℃，灭菌30分钟。

2.研磨

将泽兰实蝇消化道分段放入无菌离心管中，加入1ml无菌水，用研磨棒研磨。

3.梯度稀释

取研磨后的汁液1ml，放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10^-1稀释度的菌液，再从10^-1稀释度的菌液中取1ml放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10^-2稀释度的菌液，以此类推制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释度的菌液。

4.培养基的配置

细菌的分离常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基(NA培养基)，纯化常用LB培养基。

NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，水1000ml，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。

LB培养基：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1L；PH 7.0，121℃灭菌20min。

倒平板，每个培养皿倒大约15ml的培养基，平放静置，待冷却备用。

5.涂布

将稀释菌液10^-4、10^-5、10^-6、10^-7分别涂布于平板上，每个梯度涂三皿，并在皿低做上标记。

6.培养

倒置平皿于28℃培养箱中培养3-5天。

7.菌的纯化

在无菌条件下用挑针将NA培养基上长出的单菌落挑取于LB培养基上划线培养。纯化3-4次可得纯化后的单菌落。

抗坏血酸克吕沃尔菌培养条件研究

1.温度

将抗坏血酸克吕沃尔菌接种于pH 7.0的LB培养基，分别在15℃、25℃、30℃、35℃、40℃温度条件下，转速为220r/min的摇床培养，培养了24h时取样测定在波长600nm处的光吸收值(OD₆₀₀)。见下面的表1，比较各温度条件下抗坏血酸克吕沃尔菌培养液的OD₆₀₀值可知，抗坏血酸克吕沃尔菌的最适培养温度为25℃，较适宜的生长范围在20℃-30℃之间。

表1 温度对抗坏血酸克吕沃尔菌生长的影响

2.pH值

抗坏血酸克吕沃尔菌分别接种于pH为5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5的LB培养基，在摇床(转速为220r/min，温度为25℃)培养，在24h时取样测定在波长600nm处的光吸收值(OD600)。见表2，比较各pH条件下抗坏血酸克吕沃尔菌培养液的OD₆₀₀值可知，在5.5-8.5pH范围之间抗坏血酸克吕沃尔菌均能较好地生长，其中pH为7.5时生长最好。

表2 pH对抗坏血酸克吕沃尔菌生长的影响

3.培养基

抗坏血酸克吕沃尔菌分别接种于pH 7.0的LB培养基、TSB培养基和NA培养基，在摇床(转速为220r/min，温度为25℃)培养，在24h时取样测定在波长600nm处的光吸收值(OD600)。由表3可知，在三种培养基中，LB培养基最适合抗坏血酸克吕沃尔菌的生长。

表3 培养基对抗坏血酸克吕沃尔菌生长的影响

注：NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，水1000ml，121℃灭菌20min。

LB培养基：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1L；121℃灭菌20min。

TSB培养基：胰蛋白胨15g；大豆蛋白胨5g；氯化钠5g；琼脂15g；蒸馏水1L；121℃灭菌20min。

用本发明菌株ZLSY22 CGMCC No.13726制成菌剂防控紫茎泽兰可以按以下方法：

ZLSY22的一阶段扩繁培养：用标准固体LB培养基，按体积比0.2％比例添加紫茎泽兰水提取物，调pH值5.5～8.5，倒平板培养皿冷却后，接种ZLSY22菌株，温度15℃-40℃培养1-3天，见菌落长满培养基即可。

ZLSY22的二阶段扩繁培养基：标准液体LB培养基，按体积比0.5％比例添加紫茎泽兰水提取物，pH值5.5-8.5。接入第二步扩繁后长满菌株的固体培养基，在温度15℃～40℃培养1～3天，每12小时进行一次搅拌，接种比例为：1cm²二阶段固体培养基接种2L液体培养基的比例进行接种。

ZLSY22的使用液，将二阶段培养完成的培养液，8℃冷藏8小时，取出后静置至常温按1:5～1:10的比例加水稀释后，直接喷洒至紫茎泽兰茎部或通过灌溉方式浇灌至植株根部。

所说紫茎泽兰水提取物为：紫茎泽兰鲜品植株(含叶片)，粉碎后在40℃±5℃下，按照质量比1:9～1:12的比例浸提2小时，去除固体后取上清，0.22μm滤膜过滤后即可使用。

通过试验获得了不同施用方式、致死率与施用后时间的关系，见图1。图1的纵坐标为紫荆泽兰的致死率，横坐标为施用时间。致死率和施用时间观察统计的是第4、6、10、12、14、18、20天。图1中的线条1为浇灌，线条2为叶面喷洒，线条3为空白对照。

从图1可看出，使用含本发明菌的菌液后，紫荆泽兰会快速发病并死亡，其高峰期出现在第8至10天，至20天。尚未死亡的植株，表明未被感染或产生抗性，具体原因和机理仍待进一步研究。

本发明的有益效果：本发明提供的抗坏血酸克吕沃尔菌用于紫茎泽兰的防控，效果好成本低。

附图说明

图1为不同施用方式、施用后时间与紫茎泽兰致死率的关系图。

具体实施方式：

实施例1。

第一步：将筛分纯化好的ZLSY22菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未凝固前添加0.2％紫茎泽兰提取物，并调整pH值至5.5.倒平板，待冷凝后将ZLSY22接种至培养基上，在25℃培养基上培养1天后，将带菌培养基分割成顶面面积为1平方厘米的小块备用。

第二步：配置标准液体LB培养基。灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至5.5，降温至25℃，将上一步骤准备好带菌的1cm²小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在25℃下培养3天，每12小时进行一次搅拌。取出降温至8℃冷藏8小时。

第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按1份体积的培养基加水10份体积的比例稀释后，喷洒至紫茎泽兰茎部或芽基部。

实施例2。

第一步：首选将筛分纯化好的ZLSY22菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未凝固前添加0.2％紫茎泽兰提取物，并调整pH值至7.0倒平板，待冷凝后将ZLSY22接种至培养基上，在29℃培养基上培养3天后，将带菌培养基分割成顶面面积为1平方厘米的小块备用。

第二步：配置标准液体LB培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至6.5，降温至29℃，将上一步骤准备好带菌的1cm²小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在29℃下培养5天，每12小时进行一次搅拌。取出降温至8℃冷藏8小时。

第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按体积比为培养基：水＝1:10的比例加水稀释后，浇灌至植株基部。

实施例3：

第一步：首选将筛分纯化好的ZLSY22菌株，用标准固体LB培养基灭菌后，在未凝固前添加0.2％紫茎泽兰提取物，并调整pH值至7.5倒平板，待冷凝后将ZLSY22接种至培养基上，在25℃培养基上培养5天后，将带菌培养基分割成顶面面积为1平方厘米的小块备用。

第二步：配置标准液体LB培养基，灭菌后按体积比添加0.5％的紫茎泽兰提取物，调整pH值至7.5，降温至25℃，将上一步骤准备好带菌的1cm²小块培养基按比例接种(添加)至液体培养基中，在25℃下培养3天，每12小时进行一次搅拌，取出降温至8℃冷藏8小时。

第三步：将冷藏好的带菌液体培养基取出，按体积比为培养基：水＝1:5的比例稀释后，喷洒至紫茎泽兰茎部或芽基部。

实施例4。

对人工种植的紫茎泽兰各100株，进行效果对比的实验。空白对照为紫茎泽兰鲜品植株(含叶片)，粉碎后在45℃下，按照质量比1:10的比例浸提2小时，去除固体后取上清，0.22μm滤膜过滤后加10倍水稀释为空白对照液，其余均用实施例2的菌液。使用量：喷洒为100株2L，灌溉模式为100株5L，使用一次后连续观察20天累计数据如下：

以上数据可以看出施用ZLSY22菌株后能够在20天内显著诱发紫茎泽兰发生多项病变，并且能够快速导致紫茎泽兰死亡。