具有荧光发射性质的蛋白质/多肽‑聚合物缀合物及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种具有荧光发射性质的蛋白质/多肽‑聚合物缀合物，具有式I所示结构。所述的蛋白质/多肽‑聚合物缀合物由双官能度荧光分子桥接蛋白质/多肽与聚合物，所述的双官能度荧光分子本身不具有或者仅具有弱的荧光发射能力，仅当蛋白质/多肽‑聚合物缀合后荧光分子才具有强的荧光发射，因此所述蛋白质/多肽‑聚合物缀合物的缀合过程可以通过荧光变化原位监控，并且所述蛋白质/多肽‑聚合物缀合物可应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。

说明书

技术领域

本发明涉及有机桥接分子技术领域，尤其涉及一种具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物及其制备方法和应用。

背景技术

多肽、蛋白质及抗体与合成聚合物、药物和成像探针的共价功能化形成了重要的可应用于临床治疗的生物偶联物，与蛋白质-聚合物偶联物，抗体-药物偶联物一起，成为典型的例子。蛋白质-聚合物偶联物可追溯到1970年，Davis，Abuchowski和合作者报道了聚乙二醇(PEG)与牛血清白蛋白的偶联。这项技术现在被称为PEGylation且延伸到了许多聚合物类型上，如，响应性聚合物和两性离子聚合物。合成的聚合物接到蛋白质上如PEGylation能带来许多优点，包括增强蛋白质的溶解性和稳定性，减少免疫原性，增加血液循环半衰期，目前至少PEGylated蛋白质已被美国食品与药物管理局(FDA)认证。另一方面，抗体药物偶联物(ADCs)与能特异性靶向病变部位的单克隆抗体的结合能杀死癌细胞。两种FDA认证的ADCs，brentuximabvedotin(商品名，Adcetris)和曲妥单抗(商品名，Kadcyla)，是目前可商购的，目前临床上使用的ADCs约40种。

蛋白质-聚合物偶联物通过长出支链(graft from)、嫁接支链(graft to)和大单体共聚接枝(graft through)的方法来制备。抗体-药物偶联物和蛋白质-聚合物的制备都依赖于选择合适的高效的偶联反应和连接基元。对于蛋白质/抗体偶联物来说，选择不影响蛋白质/药物活性和抗体功能是最好的。典型的，可以通过蛋白质/抗体组织工程天然蛋白质特异性位点的改性(如，二硫键的还原，碳末端的改性，或多糖的氧化)，和直接利用特定氨基酸的特异性反应来实现。合成的功能性聚合物/药物共价接到蛋白质/抗体上主要利用了正交的click反应，如Staudinger反应，铜催化的叠氮-炔环加成(CuAAC)，张力促进的叠氮-环炔烃的环加成(SPAAC)，D-A加成，迈克尔加成，和由醛和酮形成肟/腙。新的设计原则的引入，如，模块化设计，温和的合成方式，光学示踪和多功能集成的能力，进一步促进了该领域的发展。

值得注意的是，即使是最优设计的蛋白质-聚合物偶联物，蛋白质功能和活性的明显减弱是不可避免的。一种解决方法是制备可断裂的生物偶联物，在体内随着时间的增加释放出天然的蛋白质。在细胞内化的过程中，ADCs应能有效释放出其活性的药物负载，以展现出细胞毒性。然而，监测发现蛋白质-聚合物偶联物和抗体-药物偶联物的偶联和随后释放蛋白质/药物的程度主要依赖于传统的非原位技术，如，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，质谱(MS)，高效液相色谱(HPLC)，和体积排除色谱(SEC)。这阻止了对聚合物/药物偶联物在体外和细胞水平上的释放过程的实时监测。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物及其制备方法和应用，能够通过荧光监测的方法原位监控缀合过程，并应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。

本发明提供了一种具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物，具有式I所示结构：

其中，POI为蛋白质或多肽；Polymer为聚合物。

本发明提供了一种具有荧光发射性质的蛋白质-聚合物缀合物，具有式I-a所示结构：

其中，所述POI为牛血清蛋白或鲑鱼降钙素，所述Polymer为聚乙二醇。

本发明提供了上述蛋白质-聚合物缀合物的制备方法，包括以下步骤：

含巯基的牛血清蛋白、叠氮端基的聚乙二醇和化合物B进行Michael反应和点击反应，制备得到式I-a所示的蛋白质-聚合物缀合物；

其中，POI为牛血清蛋白，n为23～445；

或者包括以下步骤：

含巯基的鲑鱼降钙素、叠氮端基的聚乙二醇和化合物B进行Michael反应和点击反应，制备得到式I-a所示的蛋白质-聚合物缀合物；

其中，POI为鲑鱼降钙素；n为23～445。

本发明提供了一种具有荧光发射性质的多肽-聚合物缀合物，具有式I-b所示结构：

其中，所述POI为基质金属蛋白酶可切断多肽，所述Polymer为聚三亚甲基碳酸酯。

本发明提供了上述多肽-聚合物缀合物的制备方法，包括以下步骤：

式C所示的基质金属蛋白酶可切断多肽、式D所示的叠氮端基的聚三亚甲基碳酸酯和化合物B进行Michael反应和点击反应，制备得到式I-b所示的多肽-聚合物缀合物；

其中，m为10～55。

优选的，通过荧光发射强度原位监控缀合物的缀合效率。

本发明提供了上述多肽-聚合物缀合物或上述制备方法制备的多肽-聚合物缀合物组成的聚合物囊泡。

优选的，所述聚合物囊泡粒径为60～150nm。

优选的，所述聚合物囊泡具有基质金属酶响应特性。

本发明提供了上述聚合物囊泡作为药物载体的应用，或作为荧光指示剂实时监控药物释放的应用。

与现有技术相比，本发明提供了一种具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物，具有式I所示结构。所述的蛋白质/多肽-聚合物缀合物由双官能度荧光分子桥接蛋白质/多肽与聚合物，所述的双官能度荧光分子本身不具有或者仅具有弱的荧光发射能力，仅当蛋白质/多肽-聚合物缀合后荧光分子才具有强的荧光发射，因此所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物的缀合过程可以通过荧光变化原位监控，并且所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物可应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。

附图说明

图1为实施例2制备牛血清蛋白-聚乙二醇缀合物的缀合过程荧光变化过程曲线图；

图2为实施例2制备牛血清蛋白-聚乙二醇缀合物的荧光变化与缀合效率之间关系图；

图3为实施例2制备牛血清蛋白-聚乙二醇缀合物的十二磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图4为实施例3制备鲑鱼降钙素-聚乙二醇缀合物的缀合过程荧光变化过程曲线图；

图5为实施例3制备鲑鱼降钙素-聚乙二醇缀合物的体积排除色谱图；

图6为实施例3制备鲑鱼降钙素-聚乙二醇缀合物的十二磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图7为实施例6制备的囊泡在水中的透射电镜图；

图8为实施例7的药物控释曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物，具有式I所示结构：

其中，POI为蛋白质或多肽；Polymer为聚合物。

所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物由双官能度荧光分子桥接蛋白质/多肽与聚合物，所述的双官能度荧光分子本身不具有或者仅具有弱的荧光发射能力，仅当蛋白质/多肽-聚合物缀合后荧光分子才具有强的荧光发射，因此所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物的缀合过程可以通过荧光变化原位监控，并且所述蛋白质/多肽-聚合物缀合物可应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。

在本发明的某些具体实施例中，所述POI为牛血清蛋白，所述Polymer为聚乙二醇，其结构如式I-a所示：

其中，n为23～445。

上述蛋白质-聚合物缀合物优选按照以下方法制备：

含巯基的牛血清蛋白、叠氮端基的聚乙二醇和化合物B进行Michael反应和点击反应，制备得到式I-a所示的蛋白质-聚合物缀合物；

本发明对上述反应的原料配比、反应条件并无特殊限定，可以为本领域常规的Michael反应和点击反应的配比和条件。

本发明优选的，通过荧光发射强度原位监控上述蛋白质-聚合物缀合物的缀合效率。

在本发明的另外一些具体实施例中，所述POI为鲑鱼降钙素，所述Polymer为聚乙二醇，其结构如式I-a所示：

其中，n为23～445。

上述蛋白质-聚合物缀合物优选按照以下方法制备：

含巯基的鲑鱼降钙素、叠氮端基的聚乙二醇和化合物B进行Michael反应和点击反应，制备得到式I-a所示的蛋白质-聚合物缀合物。

本发明对上述反应的原料配比、反应条件并无特殊限定，可以为本领域常规的Michael反应和点击反应的配比和条件。

本发明优选的，通过荧光发射强度原位监控上述蛋白质-聚合物缀合物的缀合效率。

在本发明的另外一些具体实施例中，所述POI为基质金属蛋白酶可切断多肽，其序列为βAPVGLIGβAC-SH，其中，SH为巯基(巯基位于碳端半胱氨酸残基)，上述多肽购自上海强耀生物科技公司，所述Polymer为聚三亚甲基碳酸酯。其结构如式I-b所示：

其中，m为10～55。

其制备方法优选为：

式C所示的基质金属蛋白酶可切断多肽、式D所示的叠氮端基的聚三亚甲基碳酸酯和化合物B进行Michael反应和点击反应，制备得到式I-b所示的多肽-聚合物缀合物；

本发明对上述反应的原料配比、反应条件并无特殊限定，可以为本领域常规的Michael反应和点击反应的配比和条件。

本发明优选的，通过荧光发射强度原位监控上述蛋白质-聚合物缀合物的缀合效率。

本发明还公开了一种囊泡，由上述多肽-聚合物缀合物或上述制备方法制备的多肽-聚合物缀合物组成。

本发明对所述囊泡的制备方法并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的制备方法。本发明优选的，将上述多肽-聚合物缀合物溶解于DMSO中，加去离子水，然后用去离子水透析即可。

本发明提供的上述聚合物囊泡分散均匀，且粒径分布均匀，其粒径分布为60～150nm。

上述聚合物囊泡具有基质金属酶响应特性，因此可以作为药物载体应用，或作为荧光指示剂实时监控药物释放。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的具有荧光发射性质的蛋白质/多肽-聚合物缀合物及其制备方法和应用进行详细描述。

双官能荧光分子B的合成路线如下：

实施例1c1的合成

4-溴水杨醛(1；3.11g,15.4mmol),Pd(PPh₃)₂Cl₂(0.22g,0.31mmol),PPh₃(0.061g,0.23mmol),无水四氢呋喃(50mL)加入到含有磁力搅拌子的反应烧瓶中，用干燥的氮气鼓起泡对反应体系脱气30min，然后新蒸的干燥Et₃N(3.05g,30.0mmol)和三甲基乙炔基硅(1.67g,17.0mmol)在氮气氛围下加入，溶液变成橙色。搅拌20min后将助催化剂CuI(0.088g,0.46mmol)在氮气氛围下加入到反应体系，溶液变成暗棕色。室温下搅拌过夜，然后移除溶剂得到暗棕色固体，将其溶解到正戊烷中过滤得到黄色溶液。旋除所有溶剂，最后，正己烷中两次重结晶得到黄色晶体2(2.96g,收率:88.2％,>95％purity>

¹H>3,δ,ppm,TMS):11.0(s,1H,苯-OH),9.87(s,1H,-CHO),7.48(d,J＝8.4Hz,1H,芳香氢),7.07(m,2H,芳香氢),0.26(s,9H,-Si(CH₃)₃)。

将2(2.85g,13.1mmol)溶于干燥的THF(40mL)中，然后加入20mL含有KOH(0.74g,13.2mmol)的MeOH溶液，反应体系在室温下搅拌过夜，然后旋发移除所有溶剂，残存物重新分散在水中，加入1.0mL乙酸并用3x200mL氯仿萃取。合并有机相并用无水硫酸镁干燥，过滤后移除所有溶剂得到棕色固体，正己烷中重结晶两次得到黄色固体3(1.02g,收率:53.2％,>95％purity>

¹H>3,δ,ppm,TMS):11.0(s,1H,苯-OH),9.89(s,1H,-CHO),7.52(d,J＝8.4Hz,1H,芳香氢),7.12(m,2H,芳香氢),3.29(s,1H,-C≡CH)。

将苯磺酰氯(2.51g,14.3mmol),Et₃N(2.15g,21.3mmol)和N-乙酰甘氨酸(0.88g,7.5mmol)溶于THF并在室温下搅拌过夜。移除不溶性盐后，化合物3(1.02g,7.0mmol)添加到反应体系中并在80℃搅拌10h，然后冷却到0℃，得到沉淀4(1.09g,收率:68.5％,>95％HPLC纯度)。

¹H>3,δ,ppm,TMS):9.80(s,1H,-CO-NH-),8.57(s,1H,芳香氢),7.67(d,J＝8.4Hz,1H,芳香氢),7.35(m,2H,芳香氢),4.40(s,1H,-C≡CH),2.14(s,3H,-COCH₃)。

化合物4(1.09g,4.8mmol),4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.11g,0.96mmol),(Boc)₂O(2.11g,9.8mmol)溶解在40mL>2NH₂·H₂O(0.96g,19.2mmol)，反应体系再搅拌4h。加入CH₂Cl₂，然后反应混合物用1MHCl溶液水洗，收集有机相并用无水MgSO₄干燥。过滤除掉不溶性的MgSO₄，所有溶剂都用旋转蒸发移除，残存物溶解到CH₂Cl₂(40mL)和TFA(10mL)的混合溶剂中，搅拌2h后用NaHCO₃溶液水洗，有机相用MgSO₄干燥，滤除MgSO₄后，旋转蒸发除掉溶剂得到目标产物5(0.76g)，立刻用于合成C1，具体如下：

化合物5(0.76g,4.1mmol)和马来酸酐(2.01g,20.5mmol)溶解在100mL丙酮中，回流过夜，冷却到0℃得到黄色固体沉淀。上述黄色固体沉淀(1.03g)和一水合对甲苯磺酸(154mg)溶解在30mL甲醇中回流过夜，冷却到0℃得到粗产物黄色沉淀，用EtOAc/DCM(v/v＝1/2)作为洗脱剂通过柱层析进一步纯化，得到黄色固体C1(480mg,收率:39.4％,>95％HPLC纯度)。

¹H>6-DMSO,δ,ppm,TMS):10.28(s,1H,-CONH-),8.65(s,1H,芳香氢),7.73(d,J＝8.1Hz,1H,芳香氢),7.49(s,1H,芳香氢),7.38(s,1H,芳香氢),6.74(d,J＝9.3Hz,1H,-NHCOCH＝CH-),6.51(d,J＝8.7Hz,1H,-CH＝CH-COO-),4.43(s,1H,-C≡CH),3.66(s,3H,-COO-CH₃)。

¹³C>3,δ,ppm>

RP-HPLC分析:4.4min(流动相:MeOH/H₂O>

ESI-MS:m/z calc.for C₁₆H₁₂NO₅:298.06[M+H]⁺；found:298.0705。

实施例2双官能荧光分子c1介导的BSA和PEG₂₂₇-N₃的荧光缀合物

牛血清蛋白BSA(498mg,7.5μmol)溶解在磷酸缓冲液(PBS)(70mL,pH 6.5,0.1M,含1mM EDTA)中，同时将三(2-氯乙基)磷酸酯盐酸化物(TCEP·HCl)(21.5mg,75μmol)溶解在PBS(2.5mL)中，然后逐滴加入到上述BSA溶液中，4h后，溶液用去离子水透析24h(2.0kDa截留分子量)，然后冻干以获得BSA_red。

BSA或BSA_red(4mg,0.06μmol)溶解在PBS(0.9mL,pH>227-N₃(6mg,0.6μmol)和CuSO₄/Na-抗坏血酸盐(1/5摩尔比)加入到溶液中，25℃搅拌不同的时间，通过原位观测在约420nm处荧光发射强度的改变检测轭合进程。达到既定时间后，80μL的样品溶液被取出，然后用2mL>

反应过程中，其荧光变化图如图1所示，其荧光变化与缀合效率之间的关系如图2所示。

凝胶电泳实验：SDS-PAGE实验在凝胶电泳仪(Bio-Rad)上操作，含有BSA-PEG缀合物的溶液(80μL)与20μL SDS-PAGE加样缓冲液混合，根据标准方案使用15.0wt％聚丙烯酰胺凝胶，凝胶电泳带在紫外光(365nm)或者UVP EC3成像系统的白光辐照(染色用考马斯亮蓝)可以直接观察到。

其凝胶电泳图如图3所示。

实施例3双官能荧光分子c1介导的鲑降钙素(sCT)和PEG₂₂₇-N₃的荧光缀合物

TCEP·HCl(14.2mg,50μmol)溶解在PBS(2mL,pH 7.0,50mM)中，取40μL上述溶液(含1μmolTCEP·HCl)添加到含有鲑降钙素(sCT,1.7mg,0.5μmol PBS(9mL,pH 7.0,0.05M))的小瓶中，在室温下搅拌，RP-HPLC分析显示Cys¹-Cys⁷二硫键在～30min内定量还原。

200μLC1的DMSO溶液(含0.2μmolC1)，PEG₂₂₇-N₃(10.0mg,1.0μmol)和CuSO₄/Na-抗坏血酸盐(1/5摩尔比)添加到还原的sCT(0.1μmol,溶解于1.8mL>

反应过程中，其荧光变化图如图4所示。

采用体积排除色谱法测定制备的蛋白质-聚合物缀合物分子量，其体积排除色谱图如图5所示。

凝胶电泳实验：SDS-PAGE实验在凝胶电泳仪(Bio-Rad)上操作，含有sCT-PEG缀合物的溶液(80μL)与20μL SDS-PAGE加样缓冲液混合，根据标准方案使用了15.0wt％聚丙烯酰胺凝胶，凝胶电泳带在紫外光(365nm)或者UVP EC3成像系统的白光辐照(染色用CoomassieBrilliant Blue)可以直接观察到。

其凝胶电泳图如图6所示。

实施例4合成叠氮功能化的PTMC(PTMC-N₃)

重结晶的三亚甲基碳酸酯(TMC)单体(500mg,4.9mmol)溶解在干的CH₂Cl₂中(1mL)，然后逐滴滴加3-叠氮基-1-丙醇(24mg,0.24mmol)和1,3-二环己基脲(DCU,8mg,0.05mmol)在干的CH₂Cl₂中(1mL)，反应混合物在室温氮气氛围下搅拌12h，用乙酸淬灭反应，四氢呋喃稀释，然后用过量的冷甲醇沉淀三次，放进真空干燥箱干燥得到白色粉末PTMC-N₃(160mg,收率30.5％)，PTMC的实际聚合度由¹H>14-N₃。

实施例5双官能荧光分子C1介导的PVGLIG多肽和PTMC₁₄-N₃的荧光缀合物

PTMC₁₄-N₃(7.5mg,5.0μmol)和C1(1.5mg,5.1μmol)溶解在DMSO中(1.8mL)，PVGLIG(8.1mg,10.1μmol)和CuSO₄/抗坏血酸(1/5摩尔比)溶于0.2mL去离子水后加入，反应体系在25℃搅拌，缀合过程通过荧光原位检测。在共培养～3h后，快速添加铜离子吸附树脂(美国海洋化学公司,100mg)移除铜离子，震荡5min后，上清液通过0.22μm无菌针筒过滤器滤出，滤液用过量冷乙腈沉淀，离心收集沉淀后真空干燥箱干燥过夜。

实施例6制备PVGLIG-C1-PTMC₁₄聚合物囊泡

PVGLIG-C1-PTMC₁₄(2mg)溶于1mL>

制备的囊泡在水中的透射电镜图如图7所示。

实施例7PVGLIG-C1-PTMC₁₄聚合物囊泡包埋阿霉素盐酸盐

PVGLIG-C1-PTMC₁₄(2mg)溶于1mL>

其药物控释应用曲线图如图8所示。

由上述实施例可知，本发明制备的上述蛋白质/多肽-聚合物缀合物可以通过荧光发射强度原位监控缀合效率，并且应用于治疗多肽与抗癌药物的传输。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。