基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法

摘要

本发明公开了一种基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法，属于育种技术领域。本发明方法包括如下步骤：收集100种以上不同品种的小麦；在镉浓度1.0±0.2mg/kg的土壤进行小麦苗期培养，采集10‑15天苗期叶片样品提取DNA，进行usw47标记检测；收获三叶期样品测定镉含量；根据小麦品种的苗期地上部镉富集系数对其进行0‑1标准化，得到苗期地上部标准化镉富集系数；根据标准化镉富集系数0.8，及usw47标记的检测结果来确定小麦品种为籽粒镉高、低积累品种。本发明方法简单，可操作性强，成本低廉，准确性高，适用性广，具有十分重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于育种技术领域。具体涉及一种基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法。

背景技术

镉(Cd)是自然界中毒性最大的重金属元素之一，其迁移性强、毒性大、极易被作物吸收和累积，通过食物链最终富集在人体，严重影响人类健康。2014年环境保护部和国土资源部公布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，土壤环境总体不容乐观，镉源污染物位点超标率达7％，镉污染耕地面积超过20万hm²，由重金属污染造成直接危害包括全国年均粮食减产1000万吨以上，经济损失超200亿元(胡鹏杰，李柱，钟道旭，等.我国土壤重金属污染植物吸取修复研究进展[J].植物生理学报，2014(5)：577-584.)。镉对人体肾、肺、肝、睾丸、脑、骨骼及血液系统均可产生毒性，其在体内的生物半衰期长达10-30年，为已知的最易在体内蓄积的毒物(刘毅.镉的危害及其研究进展(综述)[J].中国城乡企业卫生,2003(4):12-13.)。通过筛选小麦镉高低积累品种，发掘籽粒镉含量低的种质资源，是解决镉危害的一种经济有效的措施。

同时小麦是中国第二大粮食作物，在我国的粮食安全中占有重要地位。小麦作为镉中积累型作物，其籽粒镉含量要高于水稻、玉米等粮食作物(邢维芹，张红毅，Scheckel K G，等.铅冶炼污染区小麦籽粒镉含量及低积累品种筛选[J].农业环境科学学报，2015(10)：2039-2040.)。鉴于不同基因型小麦籽粒镉含量存在显著差异，故筛选镉高低积累品种具有必要性及可行性。

已知的小麦镉高低积累品种的筛选方法有传统筛选法、模型预测法等。传统筛选法通过全生育培养并测定小麦成熟期籽粒的镉含量，利用统计分析方法筛选小麦籽粒镉高、低积累品种。传统分析方法筛选小麦籽粒镉高低积累品种的优点在于其准确性与真实性，真实反应小麦自然生长环境下对镉的累积能力，因此其他筛选方法的开发均需要建立在传统分析测试的基础上进行。但传统分析测试方法的缺点也非常明显，首先小麦正常生育期很长，其次小麦籽粒镉含量受土壤镉浓度、pH值、施肥习惯等多因素影响，通常需要多年多点试验方可确定镉高低积累品种。也有相关研究者通过苗期指标、土壤pH等数据建立相关数学模型，快速预测籽粒镉含量，但由于小麦全生育期不同部位镉含量的分布均会对最终籽粒镉含量造成影响，某些苗期镉累积能力强的品种成熟期籽粒镉含量反而不高，因此这种方法也存在一定不确定性。

分子标记作为一种常用的分子生物学技术，已经广泛地应用于各个领域的研究，而将分子标记技术应用于筛选镉高低积累的作物品种是一种比较新颖且可行的方法。通过发掘与作物Cd积累相关的基因，并建立相关的分子标记，可以将其作为快速筛选作物Cd低积累品种的一种辅助手段。若是采用常规种质资源筛选手段，土壤镉浓度的变差引起的籽粒镉浓度差异，因此很难有统一的标准进行镉高低积累品种的筛选，而利用分子标记进行小麦镉高低积累品种筛选理论上可以避免这一现象。

Wiebe等(2010)在Cdu1(反映小麦镉富集能力的主效基因)的基础上开发了一个与作物镉吸收性状基因变异共分离的EST衍生标记(XBF474090)，该标记已经被成功转化为一个共显性CAPS标记(基于PCR)，并被定名为usw47(Wiebe K,Harris N S,Faris J D et al.Targeted mapping of Cdu1,a major locus regulating grain cadmium concentration in durum wheat(Triticum turgidum L.var durum)[J].Theoretical and applied genetics,2010,121(6):1047-1105.)。前人对这该标记有了一定的研究，但试验的小麦品种还是局限于典型的镉高、低积累品种，而未涉及大量未知小麦种质资源的筛选。本发明试验中当大量镉高、中、低积累型小麦品种共存时，usw47标记的有效性就大大降低，远无法达到筛选小麦籽粒镉高低积累品种的要求。

本发明利用苗期地上部标准化镉富集系数与usw47标记相结合的方式，来筛选小麦籽粒镉高低积累品种，最大化地消除单独利用以上两种方式筛选的不足。在提升筛选效率的同时提高了小麦籽粒镉高低积累品种筛选的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、快速、适用性广及可操作性强的筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法，该方法进一步提高了分子标记usw47的有效性，通过苗期地上部标准化镉富集系数+分子标记的两步法进行，相比以往小麦镉高低积累种质筛选方法显著提升了小麦籽粒镉高低积累品种筛选的准确性。

为了实现上述的目的，本发明采取以下技术方案：

一种基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法，包括如下步骤：

(1)收集100种以上不同品种的小麦。

(2)选取镉浓度1.0±0.2mg/kg的土壤进行小麦苗期培养。

(3)出苗15-20天，采集小麦幼叶叶片样品提取DNA。

(4)利用usw47标记检测不同小麦品种的DNA：以所提取DNA为模板，使用引物F：5’-gctaggacttgattcattgat-3’、R：5’-agtgatctaaacgttcttata-3’进行PCR扩增；PCR产物经Hpy 188Ⅰ限制性内切酶酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。

(5)小麦苗期镉含量获取

1)获取镉胁迫下小麦苗期地上部样品；小麦苗期优选三叶期；

2)收获的样品洗净、烘干、粉碎后测定镉含量。

(6)苗期地上部标准化镉富集系数(0-1标准化)的获得

根据如下公式计算苗期地上部标准化镉富集系数(0-1标准化)：

X_标准值＝(X₁-X_min)/(X_max-X_min)；

式中，X_标准值为0-1标准化后的苗期地上部标准化镉富集系数，X₁为计算所得的苗期地上部镉富集系数，X_min为所有小麦品种中苗期地上部镉富集系数的最小值，X_max为所有小麦品种中苗期地上部镉富集系数的最大值，苗期地上部镉富集系数＝苗期地上部镉含量/土壤实际镉含量。

(7)确定小麦籽粒镉高低积累品种

1)苗期地上部标准化镉富集系数大于0.8，且usw47标记特异性条带为225bp的小麦品种为籽粒镉高积累品种；

2)苗期地上部标准化镉富集系数小于0.3，且usw47标记特异性条带为375bp的小麦品种为籽粒镉低积累品种。

本发明利用大数据分析了分子标记(usw47)与小麦真实镉累积能力的相关性，结合分子标记以及苗期地上部标准化镉富集系数，建立了更加快速、经济、合理有效的以苗期地上部标准化镉富集系数、分子标记为基础的小麦镉低积累品种快速筛选方法，鉴于我国的实际国情，本发明具有十分重要的理论和现实意义。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)创新性：首次利用大田试验分析大量镉累积能力未知的小麦品种的真实镉积累能力与分子标记的相关性。采用苗期地上部标准化镉富集系数与分子标记结合的筛选小麦籽粒镉高低积累品种，相比单独利用苗期镉累积能力或分子标记进行筛选，鉴别准确率显著提高。

(2)成本低廉：实际生产仅需进行DNA抽提、相关标记的检验、苗期镉含量测定，常规实验室均可完成，成本较低。

(3)适用性广：由于本发明选取的小麦品种数量庞大，分布广泛，代表了中国大部分小麦主产区的品种，因此该方法的重现性较高，适用性也较广泛。

附图说明

图1是usw47标记部分结果图。

图2是不同usw47标记结果下的小麦苗期地上部标准化镉富集系数、籽粒镉含量示意图。

图3是不同小麦苗期地上部标准化镉富集系数(0.3、0.8临界值)下的小麦籽粒含量示意图。

图4是usw47标记结果与小麦苗期地上部标准化镉富集系数(0.3、0.8临界值)共同筛选下不同小麦的籽粒镉含量示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一、一种小面积筛选大量小麦品种的方法

1.分子标记部分

(1)在人工气候箱中用培养皿和蒸馏水培养小麦幼苗，大约15天左右取样，样品保存于-80℃冰箱(该实施例为保证试验严谨性，选择单独培养小麦幼苗，实际操作可直接选取田间小麦幼叶提取DNA)。供试小麦品种由西北农林科技大学资源与环境学院和华中农业大学植物科学技术学院提供(品种信息见表1，所有品种均可在市场购买获得)。

(2)使用改良的CTAB法提取水培小麦DNA：①取2-3cm小麦幼叶，加500μL的CTAB(含1％的巯基乙醇)，研磨成匀浆(冰浴)，倒入2mL离心管中。②65℃恒温水浴30min，其中将离心管上下颠倒数次。30min后取出，冷却至常温。③加入等体积的24:1(氯仿:异戊醇)，上下颠倒15min后12000g离心10min。④移取上清液至新离心管中并加入两倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀后放入4℃冰箱中30min使DNA沉淀。⑤7500g离心5min，倒去酒精，加入75％酒精500μL，弹起管底的沉淀。-20℃过夜，重复两次。⑥倒尽酒精，待挥发完，加入40μL ddH₂O溶解，-4℃冰箱保存备用。

(3)使用usw47分子标记验证134个小麦品种：引物序列为F：5’-gctaggacttgattcattgat-3’，R:5’-agtgatctaaacgttcttata-3’。PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物经Hpy 188Ⅰ限制性内切酶消化，37℃反应1h；65℃酶变性20min；最后维持在10℃。酶切结果采用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统扫描成像。

2.大田试验

为了获取最终籽粒内镉含量，因此进行全生育期的大田试验。供试小麦品种由西北农林科技大学资源与环境学院和华中农业大学植物科学技术学院提供(品种信息见表1，所有品种均可在市场购买获得)。2015-2016年田间试验地点为武汉市华中农业大学重金属实验基地，试验土壤理论值为1.0mg/kg(Cd1.0处理)。

(1)土壤基本理化性质：pH 5.39，有机质5.40g/kg，碱解氮45.96mg/kg，速效磷39.29mg/kg，速效钾179.58mg/kg，全镉0.846mg/kg。

(2)试验设置四个重复小区。小区长6.7米，宽2.35米，品种间距10cm，每个小区品种随机分布。

(3)底肥为N:P₂O₅:K₂O＝25:10:16比例的复合肥，41kg/亩均匀施入。拔节期按6kg/亩追施尿素，水溶后均匀施入。

(4)进行统一常规的田间管理，包括间苗、锄草、浇水和防治病虫害。

(5)分别在苗期三叶期、成熟期收获样品，并对收获样品洗净、烘干、粉碎后自封袋保存。

(6))根据GB 5009.15-2014食品中镉的测定方法，测定苗期地上部、成熟期不同品种籽粒镉含量。

(7)对数据进行处理分析，数据处理采用Excel、SPSS软件，绘图采用Sigmaplot12.0软件。其中，苗期地上部镉富集系数、苗期地上部标准化镉富集系数(0-1标准化)的计算如下：

苗期地上部镉富集系数＝苗期地上部镉含量/土壤实际镉含量。

X_标准值＝(X₁-X_min)/(X_max-X_min)，式中，X_标准值为0-1标准化后的苗期地上部标准化镉富集系数；X₁为计算所得的苗期地上部镉富集系数；X_min为所有小麦品种中苗期地上部镉富集系数的最小值；X_max为所有小麦品种中苗期地上部镉富集系数的最大值。

(8)通过对数据处理结果比较分析，分别得出苗期、籽粒镉高低累积小麦品种。

二、结果

(1)镉胁迫下不同小麦品种镉累积的差异

镉胁迫下不同小麦品种对镉的累积存在显著基因型差异。在本次试验中，不同小麦品种苗期地上部镉含量为11.196～19.074mg/kg(表2)；不同小麦品种成熟期籽粒镉含量为1.336～3.014mg/kg(表3)，可以看出不管是在苗期还是成熟期籽粒中的镉含量，不同小麦品种的种间差异是显著的，通过聚类分析结果可得籽粒镉高积累品种有周麦22、周麦18、宁麦13、山农15等，籽粒镉低积累品种有长旱58、北4、小偃15、中育10号等。

(2)分子标记验证结果

usw47(CAPS标记)，由WIEBE开发，与作物镉吸收性状基因变异共分离的EST衍生标记，使用限制性内切酶HPY188I消化后，可以检测镉吸收性状基因的两个等位基因，225bp(高镉吸收)，375bp(低镉吸收)。根据“张乐等(2012)”所使用的方法进行试验(张乐，陈为序，董慧等.普通小麦镉吸收基因Cdu1组成的功能标记检测[J].山东农业科学，2012,1(01)：002.)。结果显示，不同小麦品种会呈现出不同的分子标记结果，分别为225bp和375bp(图1)，分别对应镉高积累品种和镉低积累品种。

分析usw47标记和苗期地上部、籽粒镉含量的相关性，若单独使用usw47标记进行小麦籽粒镉高低积累品种的筛选，所有产生225bp条带(高积累)的品种苗期地上部平均镉含量为15.307mg/kg，籽粒平均镉含量为2.010mg/kg，此类小麦品种中有40％的品种确定为籽粒镉高积累品种；产生375bp条带(低积累)的品种的苗期地上部平均镉含量为15.253mg/kg，籽粒平均镉含量为2.023mg/kg，此类小麦品种中有32.7％的品种确定为籽粒镉低积累品种(图2，表4)。单独利用分子标记usw47所筛的小麦籽粒镉高、低积累品种的籽粒镉含量差异不显著，由此可见单独利用分子标记无法有效筛选小麦镉高低积累品种。

若只利用苗期地上部标准化镉富集系数来筛选小麦籽粒镉高低积累品种，以标准化镉富集系数0.3、0.8为临界值，将所有品种划分为苗期高镉品种、苗期低镉品种和苗期中镉品种。所筛得苗期高镉小麦品种的籽粒镉含量为2.311mg/kg，此类小麦品种中有66.7％的品种确定为籽粒镉高积累品种；所筛得苗期低镉小麦品种的籽粒镉含量为1.794mg/kg，此类小麦品种中有50％的品种确定为籽粒镉低积累品种(图3，表4)。但通过苗期地上部标准化镉富集系数所筛得的小麦籽粒镉高、低积累品种的籽粒镉含量虽然达到显著差异，但均存在较大的变差。由于小麦较长的生育期，根系、茎秆、结点、叶片等部位的镉累积能力均会影响最终籽粒镉含量，由图3也可以发现苗期镉含量高(低)的品种，其籽粒镉含量也可能会偏低(高)。

如果先利用苗期地上部标准化镉富集系数对所有品种进行一次育筛，以标准化镉富集系数0.3、0.8为临界值，将所有品种划分为苗期高镉品种、苗期低镉品种和苗期中镉品种。再利用分子标记usw47对苗期高镉品种和苗期低镉品种进行验证，通过两步法筛得的小麦镉高低积累品种，籽粒镉含量差异均达到极显著。使用苗期地上部标准化镉富集系数+usw47标记筛选的小麦镉高、低积累品种籽粒平均镉含量分别为2.538mg/kg和1.601mg/kg。进一步分析发现，通过两步法筛选的小麦镉高积累品种中有87.5％确定为籽粒镉高积累品种，筛选的小麦镉低积累品种中有80％确定为籽粒镉低积累品种(图4，表4)。

综上所述，单独利用usw47标记无法在大量种质资源存在的情况下辅助筛选小麦镉高低积累品种，利用usw47标记结果筛选得的小麦镉高、低积累品种的苗期地上部镉含量、籽粒镉含量均不存在显著差异。而采用苗期地上部标准化镉富集系数筛得的小麦镉高低积累品种的籽粒镉含量虽然存在显著差异，但仍存在较大的不确定性。但若利用苗期地上部标准化镉富集系数对品种进行预筛选后，再利用分子标记进行筛选，能大大提高所筛得小麦镉籽粒高低积累品种品种的准确性，且相比单独利用苗期镉累积能力或分子标记，两者结合的方法所获取的结果可信度更高，所筛选的小麦品种籽粒含量差异更加显著，所得小麦籽粒镉高、低积累品种准确性可达80％以上。

表1.参试小麦品种信息

表2.不同小麦品种苗期地上部镉含量(mg/kg)

表3.不同小麦品种成熟期籽粒镉含量(mg/kg)

表4.分子标记、苗期地上部标准化镉所筛得小麦镉高低积累品种苗期、籽粒镉含量差异

注：方差分析比较不同方式筛选的镉高积累品种以及镉低积累的苗期地上部镉含量、籽粒镉含量差异，***代表P<0.01的极显著差异。标注[1]鉴别率指通过通过苗期、分子标记或者两者结合的方式筛得的小麦品种存在多少比例的籽粒镉高、低积累品种。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品

种的方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F

<400> 1

gctaggactt gattcattga t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R

<400> 2

agtgatctaa acgttcttat a 21