基于ARMS‑PCR法检测人外周血游离DNA中septin9基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系

摘要

本发明公开了一种基于ARMS‑PCR法检测人外周血游离DNA中septin9基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系。方法包括：(a)对含有septin9基因的人外周血游离DNA中的CpG位点进行转换处理，使得未甲基化的CpG位点转换为UpG；(b)以转换处理后的人外周血游离DNA作为模板进行荧光PCR反应，荧光PCR体系中包括：用于检测septin9基因甲基化的特异性引物及其探针序列，Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg

说明书

技术领域

本发明涉及基因甲基化水平检测技术领域，尤其涉及一种基于ARMS-PCR法检测人外周血游离DNA中septin9基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系。

背景技术

粪便既含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有大量从结直肠癌上脱落的癌细胞和游离的癌DNA；又由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，使从粪便中提取的DNA质量较好。因此粪便基因甲基化作为一种新的、敏感度高、特异性中等的无创性结直肠肿瘤标志物，能根据其阳性结果对疑似病例进行进一步检测，作为相关肿瘤的早期筛查手段具有很重要的临床价值。

石蜡组织切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，还用于研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要手段，由于生物组织经过固定、石蜡包埋后能够完好的保存其形态结构，大量的细胞内DNA遗传物质得以完好保存在石蜡组织当中，经过脱蜡、细胞消化、DNA提取等步骤能够将这些保存下来的DNA遗传物质释放出来。同时，石蜡组织切片也是一种短期内获取大量人体新鲜组织标本的有效方式，且部分研究涉及回顾性分析，也需要借助于病理科等长期保存的福尔马林固定石蜡包埋组织。因此，无论是作为相关肿瘤的早期筛查手段，还是从基因水平阐明肿瘤发病机制，石蜡切片组织都具有很重要的早期检测、研究用临床价值。

septin9基因位于染色体17q25.3，septin家族是一组高度保守的GTP结合蛋白，在子细胞的胞质分裂过程的最后分离阶段至关重要。最新的研究表明，在结肠腺瘤和癌组织中，SEPT9_V2转录本的甲基化模式的重大变化只限于一个CpG岛，即CGI3中的扩增子。现阶段很多相关检测商业化试剂盒，其检测的靶片段就是SEPT9_V2的这一信息最丰富的区域。

目前临床检测DNA中基因甲基化的方法主要有3种：1)直接测序法，是目前应用最多的一种检测方法，主要是Sanger测序，当组织样本DNA经过甲基化转换试剂盒处理后，经过有效富集才能被测序，优点是结果准确可靠，能读取到被检测序列信息，但其有效富集甲基化基因区域，在转换试剂盒转换效率不高、甲基化基因含量低的情况下面临极大的挑战，一般用来确认其他检测阳性结果。2)荧光定量PCR法，在荧光定量PCR平台上，利用特异的引物对DNA甲基化区域进行PCR扩增，利用荧光标记探针对扩增产物进行突变检测，这样检测方法特异性强、灵敏度高，可检测到DNA含量低至1％的突变，但目前用于基因甲基化检测通常为单一CpG位点，即通过MGB探针区分单一CpG位点，甲基化信息不全面易造成假阳性结果，同时q-PCR平台单一检测通量不高，探针成本昂贵，很难适应临床大通量样本的风险预测。3)高通量测序技术法，一般利用PCR技术对甲基化目标区域进行富集，然后构建适合于NGS上机测序的文库，最后上机测序，信息分析获得感兴趣甲基化目标区域序列信息。但是在目前对甲基化目标区域富集过程中，富集的特异性和有效性在不同的实验平台差距大，而且普通的建库流程繁杂、周期长、成本高，这些因素都造成甲基化基因高通量测序的限制因素。

因此，目前急需一种能够检测样品DNA中基因1％低频甲基化水平，甲基化覆盖不限于1个CpG位点，检测结果可快速、直观、方便进行判别，成本较低的基因甲基化检测方法和试剂盒。

发明内容

本发明提供一种基于ARMS-PCR法检测人外周血游离DNA中septin9基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系，只有在10个CpG位点都甲基化时才检出荧光PCR信号，避免1个CpG位点甲基化代表整个基因甲基化水平的假阳性现象；甲基化水平检测限低至1％，灵敏度高。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种基于ARMS-PCR法检测人外周血游离DNA中septin9基因甲基化的荧光PCR方法，包括：

(a)对含有上述septin9基因的人外周血游离DNA中的CpG位点进行转换处理，使得未甲基化的CpG位点转换为UpG；

(b)在荧光PCR体系中，以上述转换处理后的人外周血游离DNA作为模板进行荧光PCR反应，其中上述荧光PCR体系中包括：

(b1)用于检测septin9基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：ATTCGTTGTGTATTAGTTATTATdITC(SEQ ID NO：1)，

荧光探针序列为：ATTTCGCGGTGACCGCGTA(SEQ ID NO：2)，

下游引物序列为：GCAACAACCAACCCAACdICC(SEQ ID NO：3)；

其中，上述引物序列中的dI表示脱氧次黄嘌呤核苷酸；上述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团和小沟结合分子(Minor Groove Binder，MGB)；

(b2)Taq酶、UNG酶(Uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶)、dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、dUTP、Mg²⁺和PCR缓冲液；

(b3)第一添加剂和第二添加剂，上述第一添加剂包括牛血清白蛋白，上述第二添加剂包括二甲基亚砜、NH₄Cl和山梨糖醇水溶液。

进一步地，上述荧光基团是FAM，上述淬灭基团是BHQ1。当然，荧光基团也可以是HEX、TET等其他荧光基团，淬灭基团也可以是TAMRA等其他淬灭基团。

进一步地，上述荧光PCR体系中还包括：

用于检测作为内标的ACTB基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA(SEQ ID NO：4)，

荧光探针序列为：TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT(SEQ ID NO：5)，

下游引物序列为：AAAACCAACCACAAAACAA(SEQ ID NO：6)；

其中，上述荧光探针序列的5’端具有荧光基团VIC，3’端具有淬灭基团BHQ1。

进一步地，每50μL上述荧光PCR体系中含有：

Taq酶、UNG酶2个单位；10mM的dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)和2.5mM的dUTP 0.4μL；50mM的Mg²⁺1.5μL；10×PCR缓冲液5μL；10μM的引物序列各自1μL，10μM的探针序列各自1.5μL；作为模板的转换处理后的人外周血游离DNA>4Cl和60％山梨糖醇水溶液1.25μL，以及余量的水。

进一步地，上述每50μL上述荧光PCR体系中还含有：

10μM的上述内标的引物序列各自1μL，以及10μM的上述内标的探针序列0.5μL；上述内标的引物序列和探针序列包括：

用于检测作为内标的ACTB基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA(SEQ ID NO：4)，

荧光探针序列为：TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT(SEQ ID NO：5)，

下游引物序列为：AAAACCAACCACAAAACAA(SEQ ID NO：6)；

其中，上述荧光探针序列的5’端具有荧光基团VIC，3’端具有淬灭基团BHQ1。

进一步地，上述荧光PCR反应的程序为：

50℃反应2min；95℃反应5min；95℃反应15s然后60℃反应30s进行15个循环；95℃反应15s然后60℃反应30s进行30个循环并收集荧光信号；20℃反应2min。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种基于ARMS-PCR法检测人外周血游离DNA中septin9基因甲基化的荧光PCR试剂盒，包括：

(1)用于检测septin9基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：ATTCGTTGTGTATTAGTTATTATdITC(SEQ ID NO：1)，

荧光探针序列为：ATTTCGCGGTGACCGCGTA(SEQ ID NO：2)，

下游引物序列为：GCAACAACCAACCCAACdICC(SEQ ID NO：3)；

其中，上述引物序列中的dI表示脱氧次黄嘌呤核苷酸；上述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团和小沟结合分子；

(2)Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和PCR缓冲液；

(3)第一添加剂和第二添加剂，上述第一添加剂包括牛血清白蛋白，上述第二添加剂包括二甲基亚砜、NH₄Cl和山梨糖醇水溶液；以及

任选地，(4)用于检测作为内标的ACTB基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA(SEQ ID NO：4)，

荧光探针序列为：TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT(SEQ ID NO：5)，

下游引物序列为：AAAACCAACCACAAAACAA(SEQ ID NO：6)；

其中，上述荧光探针序列的5’端具有荧光基团VIC，3’端具有淬灭基团BHQ1。

进一步地，上述荧光基团是FAM，上述淬灭基团是BHQ1。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种基于ARMS-PCR法检测人外周血游离DNA中septin9基因甲基化的荧光PCR反应体系，每50μL上述荧光PCR反应体系包括：

(1)10μM的引物序列各自1μL，10μM的探针序列各自1.5μL；其中，上述引物序列和探针序列包括：

用于检测septin9基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：ATTCGTTGTGTATTAGTTATTATdITC(SEQ ID NO：1)，

荧光探针序列为：ATTTCGCGGTGACCGCGTA(SEQ ID NO：2)，

下游引物序列为：GCAACAACCAACCCAACdICC(SEQ ID NO：3)；

其中，上述引物序列中的dI表示脱氧次黄嘌呤核苷酸；上述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团和小沟结合分子；优选地，上述荧光基团是FAM，上述淬灭基团是BHQ1；

(2)Taq酶、UNG酶2个单位；10mM的dNTPs和2.5mM的dUTP 0.4μL；50mM的Mg²⁺1.5μL；10×PCR缓冲液5μL；

(3)第一添加剂2μL，第二添加剂1.25μL，上述第一添加剂包括10mg/mL牛血清白蛋白，上述第二添加剂包括二甲基亚砜、250mM NH₄Cl和60％山梨糖醇水溶液；

(4)作为模板的转换处理后的人外周血游离DNA 20～40ng，其中，上述转换是对含有上述septin9基因的人外周血游离DNA中的CpG位点进行转换处理，使得未甲基化的CpG位点转换为UpG；以及

(5)余量的水。

进一步地，上述每50μL上述荧光PCR体系中还含有：

(6)10μM的内标的引物序列各自1μL，以及10μM的内标的探针序列0.5μL，其中上述内标的引物序列和探针序列包括ACTB基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA(SEQ ID NO：4)，

荧光探针序列为：TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT(SEQ ID NO：5)，

下游引物序列为：AAAACCAACCACAAAACAA(SEQ ID NO：6)；

其中，上述荧光探针序列的5’端具有荧光基团VIC，3’端具有淬灭基团BHQ1。

本发明的有益效果体现在：实现了septin9基因甲基化在人外周血游离DNA中的检出，人外周血游离DNA中片段化程度高、DNA丰度低、提取杂质多，可以检测人外周血游离DNA中的septin9基因甲基化水平；实现了septin9基因低甲基化水平1％的检出，提高了检测灵敏度；实现了由单个CpG位点到不少于10个CpG位点的精准性提升，避免以往的检测因单个CpG岛代表整个基因甲基化水平而造成的假阳性结果。此外，检测结果判读快速直观，以往的试剂盒通常采用△△CT算法对检测结果进行判读，100ng转换后野生型人DNA即易产生较强非特异性扩增，容易造成结果判别不清导致的假阳性结果，而本发明的septin9基因甲基化水平检测无需△△CT算法，在200ng人DNA中无扩增信号，有低频甲基化即有扩增信号，结果判别快速清晰。

附图说明

图1为正常组织(未甲基化)CpG位点经过重硫酸盐处理转换为UpG的原理示意图；

图2为肿瘤组织(甲基化)CpG位点经过重硫酸盐处理后为CpG的原理示意图；

图3为肿瘤型可以检测出荧光信号，野生型检测无荧光信号的原理示意图，其中dI(deoxyInosine)为脱氧次黄嘌呤修饰3’端倒数第3个碱基，其结合力弱；

图4为转换处理后肿瘤(甲基化)DNA 0.15ng(1％)+转换处理后正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(99％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图；

图5为转换处理后肿瘤(甲基化)DNA 0.15ng(1％)+转换处理后正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(99％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图；

图6为转换处理后肿瘤(甲基化)DNA 0.15ng(100％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图；

图7为转换处理后肿瘤(甲基化)DNA 0.15ng(100％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图；

图8为转换处理后正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(100％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图；

图9为转换处理后正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(100％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图；

图10为无转换处理正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(100％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图；

图11为无转换处理正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(100％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图；

图12为转换处理后游离血浆DNA 15ng(100％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图；

图13为转换处理后游离血浆DNA 15ng(100％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明人进行了一系列研究，并在研究人粪便DNA、石蜡切片DNA的septin9基因甲基化检测时发明了一种新的基于ARMS(突变扩增系统)-PCR法检测septin9基因甲基化水平的检测方法及其试剂盒，有非诊断性用途。本发明的检测方法针对人septin9基因中，SEPT9_V2区段CGI3甲基化CpG岛中不少于10个CpG位点区段设计ARMs-PCR引物及其探针，结合优化的PCR反应液及高效Taq酶，实现对甲基化转换试剂处理后样品DNA中septin9基因低频1％甲基化水平、检测区域包括不少于10个CpG位点、检测结果快速、直观、方便进行判别。本发明的检测方法包括：使用甲基化转换试剂对生物样本DNA转换后(其原理参见图1和图2)，检测转换后DNA中septin9基因各自特定CpG岛区域不少于10个CpG位点的甲基化水平，通过对该基因区段上游CpG位点特异性ARMS引物设计与碱基修饰、下游CpG位点特异性ARMS引物设计与碱基修饰、中间CpG位点区域Taq-man MGB探针引物的设计(其原理参见图3)，并进一步对PCR扩增体系当中dNTPs、Mg离子、NH₄Cl、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)、山梨糖醇等化学试剂特定比例组成的添加，以达到ARMS-PCR引物工作的最佳反应体系条件，对PCR扩增步骤的优化，结合q-PCR平台，实现septin9基因低甲基化水平1％的检出，同时在转换后200ng/反应的野生型人DNA背景下无扩增信号，不出现假阳性情况，检测结果快速、直观、方便进行判别。

本发明所使用的特异性引物及其探针序列包括：

用于检测septin9基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：ATTCGTTGTGTATTAGTTATTATdITC(SEQ ID NO：1)，

荧光探针序列为：ATTTCGCGGTGACCGCGTA(SEQ ID NO：2)，

下游引物序列为：GCAACAACCAACCCAACdICC(SEQ ID NO：3)；

其中，引物序列中的dI表示脱氧次黄嘌呤核苷酸；荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团和小沟结合分子。

本发明的特异性引物及其探针序列是特别设计的，其特点是只有在不少于10个CpG位点甲基化时才检出荧光PCR信号，从而避免1个CpG位点甲基化代表整个基因甲基化水平的假阳性现象，而这种假阳性现象是现有检测septin9基因甲基化的方法难以避免的。本发明的荧光探针序列在与目标区域结合时，只要有至少3个位点(优选3-5个位点)不能结合，则整个荧光探针序列就结合不上，这些位点就是经甲基化转换试剂转换以后在甲基化的CpG位点与未甲基化的CpG位点之间有差异的位点。荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端除了具有淬灭基团以外，还具有小沟结合分子，其能够在位点不结合的情况下进一步“弹开”荧光探针序列，进一步保证只有在不少于10个CpG位点甲基化时才检出荧光PCR信号。同时，引物序列中的dI位于3’端倒数第3个碱基，该碱基的存在，使得其与目标区域的结合力变弱，从而使得一旦引物序列3’末端的碱基不能与目标区域配对，则难以发生扩增反应，也就是在正常组织(未甲基化)CpG位点经过重硫酸盐处理转换为UpG的情况下，3’末端的碱基不能发生配对，则无法发生扩增反应；而甲基化CpG位点经过重硫酸盐处理后，3’末端的碱基依然能够发生配对，发生扩增反应。因此，上述特异性引物及其探针序列的巧妙设计，保证了只有在不少于10个CpG位点甲基化时才检出荧光PCR信号。

本发明还使用UNG酶，其选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂。因此在UNG酶和dUTP存在的体系，能够消除和防止污染。例如，在PCR反应前设置50℃反应2min的步骤，使UNG酶作用于U碱基切断环境当中可能存在的扩增产物，以排除由此可能引起的假阳性结果，使检测结果更准确。

本发明使用牛血清白蛋白作为第一添加剂，以及含有二甲基亚砜、NH₄Cl和山梨糖醇水溶液的第二添加剂，能够为探针和引物在CpG位点甲基化不同的情况下，灵敏地结合或不结合目标区域。也就是说，第一添加剂和第二添加剂的存在，为探针和引物的结合提供有利的环境，使得在不少于10个CpG位点甲基化的情况下，产生阳性的荧光PCR信号；而在只有1个CpG位点甲基化的情况下，不能产生阳性的荧光PCR信号。

此外，设置甲基化特异内标(人类ACTB基因保守区域)控制，与目标基因采用不同的荧光标记探针，通过检测内标是否正常来监测待测甲基化转换试剂处理后样本有效DNA的量，同时监测转换处理后样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。

发明人还对荧光PCR反应体系进行了优化，实现了最佳的扩增效果。发明人得到一个最佳的荧光PCR反应体系，每50μL荧光PCR反应体系中含有：Taq酶、UNG酶2个单位；10mM的dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)和2.5mM的dUTP 0.4μL；50mM的Mg²⁺1.5μL；10×PCR缓冲液5μL；10μM的引物序列(SEQ ID NO：1、3)各自1μL，10μM的探针序列(SEQ ID NO：2)各自1.5μL；作为模板的转换处理后的人外周血游离DNA>4Cl和60％山梨糖醇水溶液1.25μL，以及余量的水。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案和技术效果，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

以下实施例中，样本DNA转换处理使用来源于ZYMO RESEARCH公司EZ-96DNAMethylation-GoldTMMagPre试剂盒按照操作说明书进行。

使用的特异性引物及其探针序列如下：

(1)用于检测septin9基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：ATTCGTTGTGTATTAGTTATTATdITC(SEQ ID NO：1)，

荧光探针序列为：ATTTCGCGGTGACCGCGTA(SEQ ID NO：2)，

下游引物序列为：GCAACAACCAACCCAACdICC(SEQ ID NO：3)；

(2)用于检测作为内标的ACTB基因甲基化的特异性引物及其探针序列：

上游引物序列为：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA(SEQ ID NO：4)，

荧光探针序列为：VIC-TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT-BHQ1(SEQ ID NO：5)，

下游引物序列为：AAAACCAACCACAAAACAA(SEQ ID NO：6)。

检测septin9基因甲基化的单管反应液的组成成分如下表1所示：

表1

荧光PCR反应的程序为：50℃反应2min；95℃反应5min；95℃反应15s然后60℃反应30s进行15个循环；95℃反应15s然后60℃反应30s进行30个循环并收集荧光信号；20℃反应2min。

图4示出了转换处理后肿瘤(甲基化)DNA 0.15ng(1％)+转换处理后正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(99％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图，可见有荧光信号；图5示出了转换处理后肿瘤(甲基化)DNA 0.15ng(1％)+转换处理后正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(99％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图，可见有荧光信号；图6示出了转换处理后肿瘤(甲基化)DNA0.15ng(100％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图，可见有荧光信号；图7示出了转换处理后肿瘤(甲基化)DNA0.15ng(100％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图，可见有荧光信号；图8示出了转换处理后正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(100％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图，可见无荧光信号；图9示出了转换处理后正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(100％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图，可见有荧光信号；图10示出了无转换处理正常细胞(无甲基化)DNA 15ng(100％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图，可见无荧光信号；图11示出了无转换处理正常细胞(无甲基化)DNA15ng(100％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图，可见无荧光信号；图12示出了转换处理后游离血浆DNA 15ng(100％)septin9基因目标区域检测信号FAM荧光曲线图，可见无荧光信号；图13示出了转换处理后游离血浆DNA 15ng(100％)内标区域检测信号VIC荧光曲线图，可见有荧光信号。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司

<120> 基于ARMS-PCR法检测人外周血游离DNA中septin9基因甲基化的荧光PCR方法

、试剂盒及体系

<130> 17I23925

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<170> PatentIn version 3.3

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