植物生物产量相关蛋白SOD3及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了植物生物产量相关蛋白SOD3及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，是如下1)或2)：1)序列表中序列1所示的蛋白质；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白质。本发明的实验证明了，SOD3及其编码基因可以增加植物器官大小并提高生物量，为作物遗传改良奠定了坚实基础，对于作物产量的提高具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物生物产量相关蛋白SOD3及其编码基因与应用。

背景技术

随着经济的发展和人口的增加，粮食需求日益增长，而耕地面积的减少对粮食生产的约束日益突出，粮食安全面临严峻挑战。植物的器官大小是重要的农艺性状，直接关系作物的产量。因此，研究植物体如何实现自身对器官大小的控制已经成为提高作物产量的重要策略之一。

作为一类重要的泛素连接酶，由F-box蛋白参与组成的SCF复合体高效降解生长发育的关键蛋白，广泛参与植物激素信号转导、光周期及器官发育等生物学过程，对于植物的生长发育至关重要。

发明内容

本发明一个目的是提供植物生物产量相关蛋白SOD3及其编码基因。

本发明提供的蛋白，命名为SOD3，是如下1)或2)：

1)序列表中序列1所示的蛋白质；

2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物生物产量和/或器官大小中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，

所述器官大小体现在叶片面积、花瓣面积、角果宽度和/或种子面积；

所述生物产量体现在百粒种子重量；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育植物生物产量和/或器官大小中的应用也是本发明保护的范围；

所述器官大小体现在叶片面积、花瓣面积、角果宽度和/或种子面积；

所述生物产量体现在百粒种子重量；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

本发明另一个目的是提供一种培育高生物产量和/或器官增大转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的生物产量和/或器官大小均高于所述目的植物。

上述方法中，

所述器官大小体现在叶片面积、花瓣面积、角果宽度和/或种子面积；

所述生物产量体现在百粒种子重量；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

本发明的实验证明，本发明发现一种新蛋白SOD3及其编码基因，将其导入野生型拟南芥中，得到转基因植株，该转基因植物的器官如叶片面积、花瓣面积、角果宽度、种子面积及其生物量(百粒种子重量)均高于野生型拟南芥，表明该蛋白SOD3及其编码基因可以增加植物器官大小并提高生物量，为作物遗传改良奠定了坚实基础，对于作物产量的提高具有重要意义。

附图说明

图1为PCR鉴定转基因拟南芥植株的电泳图；

其中，A，从左至右的泳道依次为野生型拟南芥对照、15个转基因拟南芥植株和质粒35S:SOD3阳性对照；B，从左至右的泳道依次为野生型拟南芥对照、15个转基因拟南芥植株和质粒35S:SOD3阳性对照。

图2为转SOD3拟南芥表达量的电泳图；

其中，A为SOD3基因的表达量，从左至右的泳道依次为野生型拟南芥对照和转基因拟南芥，30个PCR循环；B为内参ACTIN7基因的表达量，从左至右的泳道依次为野生型拟南芥对照和转基因拟南芥，25个PCR循环。

图3为转SOD3拟南芥植株的表型及统计结果图；

其中，Ⅰ为野生型，Ⅱ为转基因株系，**代表P＜0.01水平差异显著，A为拟南芥植株的叶片，B为主茎上的第5朵花，C为主茎上的第6个角果，D为主茎上第8个角果的种子，E为第5片真叶叶片面积统计的柱形图，F为花瓣面积统计的柱形图，G为角果宽度统计柱形图，H为种子面积统计柱形图，I为100粒种子重量统计柱形图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、SOD3蛋白及其编码基因的获得

1、SOD3编码基因的获得

称取200mg新鲜的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Col-0，The EuropeanArabidopsis Stock Centre，N1092)幼苗(萌发后10天)，在液氮中研磨成粉末，用植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取总RNA。提取完成后，用分光光度计检测总RNA的浓度。取5μg总RNA，用反转录试剂盒(INVITROGEN)进行反转录，得到cDNA。

以cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增。

SOD3-F：ATGTCTACCTCCTCCTCTTCTT

SOD3-R：CTACAGTGCACCGAAATCCCATAG

PCR反应体系(50μL)：5μL 10×KOD-Plus Buffer，5μL 2mM dNTP，2μL 25mM MgSO4，1.5μL 10μM引物SOD3-F和1.5μL 10μM引物SOD3-R，1μL KOD-Plus(TOYOBO)。

PCR反应条件：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，68℃延伸1.5分钟，循环32次；68℃10分钟。反应完成后加入0.5μL Taq DNA聚合酶(TAKARA)，72℃反应30分钟添加碱基A。

在1％的琼脂糖凝胶中电泳上述PCR产物，PCR产物大小约1.4kb。

用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收上述PCR产物，连入pCR8/GW/TOPO TA载体(INVITROGEN)中，得到SOD3-TOPO载体。对该载体上连接的DNA片段进行测序验证。

测序结果表明，SOD3-TOPO载体中的PCR产物具有序列表中序列2所示的核苷酸核苷酸序列，PCR产物所示的基因命名为SOD3基因，开放阅读框为序列2第1-1341位核苷酸，该基因编码序列表中序列1所示的蛋白，将该蛋白命名为SOD3，序列1由446个氨基酸残基组成。

实施例2、SOD3蛋白及其编码基因的应用

一、重组载体35S:SOD3的构建

将实施例1制备的SOD3-TOPO载体与目的载体pMDC43(INVITROGEN)进行LR反应(INVITROGEN)，得到35S:SOD3重组载体。

将重组载体35S:SOD3进行测序验证，重组载体35S:SOD3为将序列2所示的SOD3基因与目的载体pMDC43发生LR重组反应得到的载体。

二、转SOD3拟南芥的获得

1、重组农杆菌的获得

用电击仪Micropulser(Bio-RAD)将重组载体35S:SOD3转入根癌农杆菌GV3101中，将菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素、40μg/mL庆大霉素和10μg/mL利福平YEP固体培养基平板上，获得的阳性克隆即为含有35S:SOD3载体的根癌农杆菌，命名为GV3101/35S:SOD3。

YEP固体培养基：酵母提取物(OXOID)10g/L，胰蛋白胨(OXOID)10g/L，NaCl5g/L，其余为水，调PH值至7.0，添加15g/L琼脂，制成YEP固体培养基。

2、侵染液制备

挑取上述步骤1获得的阳性克隆GV3101/35S:SOD3，用含有50μg/mL卡那霉素、40μg/mL庆大霉素和10μg/mL利福平的YEP液体培养基28℃摇床过夜培养，至OD₆₀₀为1.5-2.5。然后，14℃、4000转离心10分钟收集菌体，用转化缓冲液重悬，得到侵染液。

转化缓冲液：2.2g/L MS(PHYTOTECHNOLOGY)，5％蔗糖，0.5g/L MES(AMRESCO)，调PH至5.7，然后加入0.03％的Silwet L-77(LEHLE SEEDS)。

3、花序侵染

选取生长健壮的野生型拟南芥Col-0植株，用滴管将侵染液滴到花序上，直至花序被完全浸润。竖直避光放置1天，之后置于光下正常培养，约1个月后收种，即为转基因种子。

4、转SOD3拟南芥的获得

将上述3得到的转基因种子播种在潮霉素抗性筛选培养基上培养10天。将获得的抗性转基因植株移栽到培养介质(按2：1体积混匀的蛭石和营养土)中，16小时光照/8小时黑暗，光照强度4000Lux，温度22℃，湿度60-80％进行培养。共筛选到32个转基因植株，标记为T1代转SOD3拟南芥。

采用相同的方法将空载体pMDC43转入野生型拟南芥中，得到12个T1代转空载体拟南芥。

上述潮霉素抗性筛选培养基组成：在1/2MS固体培养基(2.2g/L MS，10％葡萄糖，0.5g/L MES，0.8％琼脂，pH 5.7)中加入30μg/mL的潮霉素。

5、转SOD3拟南芥的鉴定

以SOD3ID-F和SOD3ID-R为引物，分别以野生型拟南芥Col-0、T1代转空载体拟南芥和T1代转SOD3拟南芥的叶片的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

SOD3ID-F：CTCCCACAACGTATACATCATG

SOD3ID-R：TATCAGGCTCGTCCACATCA

PCR反应体系(20μL)：2μL DNA，2μL 10×PCR buffer、2μL 2.5mM dNTP、1μL 10mM引物SOD3ID-F和1μL 10mM引物SOD3ID-R，0.3μL的Taq DNA聚合酶(TAKARA)。

PCR反应条件：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环40次；72℃10分钟。

结果如图1所示，30个T1代转SOD3拟南芥均可得到750bp左右的条带，而野生型拟南芥无此条带，说明30个T1代转SOD3拟南芥植株全部为阳性。T1代转空载体拟南芥与野生型拟南芥的结果一致。

6、转SOD3拟南芥的表达量分析

分别称取萌发后10天的野生型Col-0和T1代转SOD3拟南芥幼苗，按实施例1中的方法提取总RNA并反转录得到cDNA。

以cDNA为模板，用如下引物分别进行PCR扩增。

SOD3RT-F：ATGTCTACCTCCTCCTCTTCTT

SOD3RT-R：TAGATGGTCGGAGCGAGAGA

ACTIN7-F：ATCCTTCCTGATATCGAC

ACTIN7-R：GAGAAGATGACTCAGATC

在1％的琼脂糖凝胶中电泳上述PCR产物。

结果如图2所示，与野生型拟南芥相比，T1代转SOD3拟南芥中SOD3基因的表达量显著升高。

三、转SOD3拟南芥的表型分析

在相同且正常的条件下，种植野生型拟南芥(Ⅰ)种子、T1代转SOD3拟南芥(Ⅱ)种子和T1代转空载体拟南芥种子，分别统计12个单株的叶片、花瓣、角果和种子等指标。

统计方法及结果如下：

1、叶片面积

播种40天后，测量第5片真叶的叶片面积，方法如下：从植株上取下第5片真叶，展平后拍照，用Image J软件测量叶片的面积，并用EXCEL进行统计分析。

拍照结果如图3A所示，统计结果如图3E所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，T1代转SOD3拟南芥的第5片真叶的叶片面积显著增加。

野生型拟南芥和T1代转空载体拟南芥结果无显著差异。

2、花瓣面积

播种40天后，测量花瓣面积，方法如下：取主茎上开放的第4至第6朵花，剥下花瓣，放在体式镜(LEICA S8APO)下观察并拍照(LEICA DFC420)，用Image J软件测量花瓣的面积，并用EXCEL进行统计分析。

拍照结果如图3B所示，统计结果如图3F所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，T1代转SOD3拟南芥花瓣面积显著增加。

野生型拟南芥和T1代转空载体拟南芥结果无显著差异。

3、角果宽度

播种50天后，测量角果宽度，方法如下：取主茎上第4至第6个角果，放在体式镜下观察并拍照，用Image J软件测量角果的宽度，并用EXCEL进行统计分析。

拍照结果如图3C所示，统计结果如图3G所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，T1代转SOD3拟南芥的角果宽度显著增加。

野生型拟南芥和T1代转空载体拟南芥结果无显著差异。

4、种子面积

播种70天后，测量种子的面积，方法如下：收获主茎上第4至第10个角果的种子，室温放置1个月后在体式镜下拍照，用Image J软件测量种子的面积，并用EXCEL进行统计分析.

拍照结果如图3D所示，统计结果如图3H所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，T1代转SOD3拟南芥的的种子面积显著增加。

野生型拟南芥和T1代转空载体拟南芥结果无显著差异。

5、种子重量

播种70天后，测量种子重量，方法如下：精确数出T1代植株100粒种子，在天平(METTLER TOLEDO AL104)上测量种子重量，共4次重复。

统计结果如图3I所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，T1代转SOD3拟南芥的百粒种子重量显著增加。

野生型拟南芥和T1代转空载体拟南芥结果无显著差异。