视黄醇结合蛋白的大肠杆菌表达体系及其蛋白的制备方法

摘要

本发明涉及微生物分子生物学领域，特别涉及视黄醇结合蛋白的大肠杆菌表达体系及其蛋白的制备方法。一种视黄醇结合蛋白基因工程菌的大肠杆菌表达体系包括以下步骤：人工合成链接有FAD合成酶的视黄醇结合蛋白基因，通过PCR反应程序得到扩增基因产物；PCR扩增的引物为RBPF：ATCGCCATGGATGCTGCATCAGCCGACC和RBPR：ATCGCTCGAGTTACTGCACTTTTTTAAACACC；将所述扩增基因产物用NcoI和XhoI双酶切，并串联构建到NcoI和XhoI双酶切后的pET30a载体上，构建成为视黄醇结合蛋白表达载体；将所述视黄醇结合蛋白表达载体转化至大肠杆菌细胞中获得视黄醇结合蛋白基因工程菌的大肠杆菌表达体系。本发明的有益效果在于：能够解决现有技术中所面临的产量少，纯度低，复性率低等问题，经济有效的解决现有技术中存在的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学领域，特别涉及视黄醇结合蛋白的大肠杆菌表达体系及其蛋白的制备方法。

背景技术

正常人尿中视黄醇结合蛋白(RBP)含量很少，约为0.1μg/min以下，其排量增加被认为是一种敏感的近端肾小管损伤的诊断指标。视黄醇结合蛋白与尿白蛋白、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(β2-MG)等有显著的正相关。在碱性环境中较β2-MG稳定，在37℃温度下亦不分解(而β2-MG在pH 5.5以下时迅速分解，室温放置2小时后，有80％会被分解掉)。而尿视黄醇结合蛋白作为肾小管损伤的指标较NAG敏感。在疾病状态下，尿视黄醇结合蛋白浓度又是NAG的10倍。因此，尿视黄醇结合蛋白的测定比NAG和β2-MG更有价值，是更实用、可靠的肾功能指标，当肾小管功能受损时，尿中视黄醇结合蛋白可明显增高，较肌酐、尿素更准确灵敏。。

肝病患者血清中视黄醇结合蛋白显著低于正常人，且急性病毒性肝炎病程早期血清视黄醇结合蛋白含量降低较晚期更明显。血清视黄醇结合蛋白水平能准确、灵敏地反映肝功能变化。甲亢患者视黄醇结合蛋白水平较正常人低，甲减患者视黄醇结合蛋白水平高于正常人。此外，当血清视黄醇结合蛋白低于正常一半时，患者才出现暗适应能力降低，提示血清视黄醇结合蛋白含量能更灵敏地反映维生素A缺乏症。

可见视黄醇结合蛋白水平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标，具有广阔的应用前景。为了更准确的对视黄醇结合蛋白水平进行检测，检测试剂盒或色谱检测常需要标准品。目前，制得视黄醇结合蛋白的方法主要是从血浆分离纯化，但是视黄醇结合蛋白在血浆中含量较少，从血或肾病综合征尿液中分离视黄醇结合蛋白，所需样品量大，成本高，步骤繁琐，且不易得到有活性的视黄醇结合蛋白。近年来，有学者和专家研究和利用基因工程的方法制得视黄醇结合蛋白，具有较高的安全性，且繁殖速度快，能够大规模生产，降低成本，还能够高效表达目的基因，可诱导调控，易于分离提纯；但传统的工艺手段往往存在产量过低，复性率不高等问题。

发明内容

本发明的目的是提供视黄醇结合蛋白基因工程菌的构建及其蛋白的制备、复性方法，利用基因工程手段人工合成编码RBP的基因在原有基因片段上增加FAD合成酶基因片段，构建基因工程菌株，能够解决现有技术中从血浆中分离纯化视黄醇结合蛋白所面临的问题，经济有效的解决现有技术中存在的问题。

本发明具体技术方案如下：

一种视黄醇结合蛋白的大肠杆菌表达体系，包括以下步骤：

人工合成链接有FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)合成酶的视黄醇结合蛋白基因，通过PCR(聚合酶链式)反应程序得到扩增基因产物；

PCR扩增的引物为

RBPF(正向引物)：ATCGCCATGGATGCTGCATCAGCCGACC和

RBPR(反向引物)：ATCGCTCGAGTTACTGCACTTTTTTAAACACC；

将所述扩增基因产物用NcoI和XhoI双酶切，并串联构建到NcoI和XhoI双酶切后的pET30a载体上，构建成为视黄醇结合蛋白表达载体；

将所述视黄醇结合蛋白表达载体转化至大肠杆菌细胞中获得视黄醇结合蛋白基因工程菌的大肠杆菌表达体系。

进一步地，基因序列为：

ATGCTGCATCAGCCGACCGTGGAAGTGACCGATGATGCGAGCGTGCGTCGTCGTCCGCGTGCGGTGGCGATTGGCGTGTTTGATGGCGTGCATATTGGCCATGCGCAGGTGATTGCGGGCTGCGATACCGTGCTGACCTTTGATCCGCATCCGCTGCAGGTGCTGCGTCCGGATGATGTGCCGGCGCTGCTGACCACCGTGCCGACCAAAGTGGCGCGTCTGGCGGCGCTGGGCGTGCGTGAAGTGGTGGTGCTGCGTTTTGATGCGCGTTGGGCGGCGGTGGCGGCGCCGAGCTTTGTGGATGATCTGCTGGTGGGCCGTCTGGGCGCGCATACCGTGAGCGTGGGCGCGAACTTTCGTTTTGGCGCGGGCGGCGAAGGCAGCGGCCATGTGCTGCGTCGTGATGGCCGTTTTCGTACCCGTGTGACCCCGCTGGTGCGTAGCGCGGCGGGCGTGGTGAGCAGCAGCCGTATTCGTGCGAGCCTGAGCAGCGGCGATATTGGCGCGGTGACCCGTCTGCTGGGCCGTCCGCATGCGCTGACCGGCCGTGGCGCGCCGGGCCGTAGCGTGGTGGTGGATACCGGCCTGGCGGTGCCGCCGGCGGGCCGTTATCGTGTGCTGGTGAACGATGTGCCGACCCATGCGGTGGTGGATGATCGTGGCCGTATTACCGTGGATGAACAGCTGCGTGGCCGTGTGGAACTGGTGCTGCGTTGCCGTGTGGATCGTccaactttgtacaaaaaagtgccggtggattttaccggctattggaaaatgctggtgaacgaaaactttgaagaatatctgcgtgcgctggatgtgaacgtggcgctgcgtaaaattgcgaacctgctgaaaccggataaagaaattgtgcaggatggcgatcatatgattattcgtaccctgagcaccgttcgtaactatattatggattttcaggtgggcaaagaatttgaagaagatctgaccggcattgatgatcgtaaatgcatgaccaccgtgcgctgggatggcgataaactgcagtgcgtgcagaaaggcgaaaaagaaggccgtggctggacccagtggattgaaggcgatgaactgcatctggaaatgagtgtggaaggcgtggtgtgcaaacaggtgtttaaaaaagtgcagTAA。

进一步地，所述大肠杆菌采用菌株BL21(DE3)。

进一步地，一种视黄醇结合蛋白的发酵制备方法，包括以下步骤：

在发酵初始培养基中接入细菌种子培养基，调节pH为6.5～7.3，并保持温度为37℃，溶氧量大于20％，接入视黄醇结合蛋白基因工程菌株，使菌体自然生长；

当培养基中糖份基本耗尽时，保持温度为37℃，将通气量加大至2L/min，加入第一补料液加速诱导；然后匀速加入第二补料液；当第一补料液加入时开始，每4h加入第三补料液，待养分耗尽后收集菌体。

进一步地，所述第一补料液包括酵母提取物、胰蛋白胨和乳糖。

进一步地，所述第二补料液包括甘油和乳糖。

进一步地，所述第三补料液包括FAD和PB-Na溶液。

进一步地，一种视黄醇结合蛋白的复性方法，包括以下步骤：

采用Urea(尿素)和Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶液冲平Ni-IDA琼脂糖柱；将变性蛋白低温离心去除不溶物后上柱；

上柱完成之后，用Urea和Tris溶液冲平亲和柱，将不易吸附的杂质清洗干净，然后用Imi(咪唑)、Urea及Tris溶液洗去蛋白；

依次用Urea溶液、Urea和FAD的混合溶液及Tris和FAD的混合溶液冲洗所述Ni-IDA琼脂糖柱后完成视黄醇结合蛋白的复性。

进一步地，一种视黄醇结合蛋白的用途，作为视黄醇结合蛋白试剂盒或含量检测的标准品。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明利用基因工程手段，人工合成编码视黄醇结合蛋白的基因，即在原有基因片段上增加FAD合成酶基因片段，构建基因工程菌株。构建的基因工程菌株表达的视黄醇结合蛋白产量可以提高200％，复性成功率提高250％以上，特定缓冲液中37℃稳定性延长20天，由于带有FAD表达产物分子量增大并且在FAD的存在下大大提高其稳定性，使得其在免疫动物的体内存在时间增加免疫原性大大提高，工艺过程方法简化准确，蛋白分子量增大，免疫原性大大提高。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的具体实施方式进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例1视黄醇结合蛋白基因工程菌表达体系的构建

1.1设计引物克隆视黄醇结合蛋白基因

RBPF：ATCGCCATGGATGCTGCATCAGCCGACC；

RBPR：ATCGCTCGAGTTACTGCACTTTTTTAAACACC。

2.2复制子扩增条件

反应体系中包括20mM(mmol/L，毫摩尔每升，下同)Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷，pH 8.8)、10mM KCl(氯化钾)、10mM(mol/L，摩尔每升，下同)(NH₄)₂SO₄(硫酸铵)、2mM>4(硫酸镁)、0.1％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、50M>

2.3扩增反应程序

将上述反应体系于95℃下预变性5min，然后进行30个循环的“95℃变性30s、55℃退火30s和72℃延伸2min”，最后在72℃下终延伸10min。将得到的PCR扩增基因产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，并用QIAGEN快速提取凝胶试剂盒回收1000bp(碱基对)左右单一条带的DNA片段。

将得到的基因经NcoI和XhoI双酶切4h，并串联构建到NcoI和XhoI双酶切后的pET30a载体上，构建成为视黄醇结合蛋白表达载体。

将所述视黄醇结合蛋白表达载体转化至BL21(DE3)细胞中获得视黄醇结合蛋白基因工程菌。

实施例2视黄醇结合蛋白的发酵制备方法

2.1细菌种子培养基

所述细菌种子培养基包括10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L氯化钠。使用前于121℃灭菌20min，冷却后加入硫酸卡那霉素至终浓度为50mg/L。

2.2发酵初始培养基

所述发酵初始培养基包括10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物，6～12g/L磷酸氢二钾、3～6g/L磷酸二氢钠、0.2～1g/L一水柠檬酸、0.2～2g/L硫酸镁、1～10ml/L微量元素母液，调节pH至6.8～7.2，于121℃灭菌20min。接种前加入灭菌的葡萄糖至终浓度15～20g/L，使用氨水调pH至6.5～7.3。加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。

在初始培养基中磷酸盐以体积比计，磷酸氢二钾︰磷酸二氢钠＝2︰1。

所述微量元素母液包括10g FeSO₄·7H₂O(七水合硫酸亚铁)，2.25g>4·7H₂O(七水硫酸锌)，1g>4·5H₂O(五水硫酸铜)，0.5gMnSO4·5H₂O(五水硫酸镁)，0.23gNa₂B₄O₇·10H₂O(四硼酸钠)，2g>2·2H₂O(氯化钙)，0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄(七钼酸铵)，溶于5M盐酸中。

2.3第一补料液

所述第一补料液包括250±50g/L酵母提取物、100±20g/L胰蛋白胨和10±2g/L乳糖，使用前于121℃灭菌20min。

2.4第二补料液

所述第二补料液包括400±50g/L甘油和5g/L乳糖，使用前于121℃灭菌20min。

2.5第三补料液

所述第三补料液包括5mg/L FAD和50mM PB-Na溶液。

2.6发酵制备方法

在发酵初始培养基中接入细菌种子培养基，调节pH为6.5～7.3，并保持温度为37℃，溶氧量大于20％，接入视黄醇结合蛋白基因工程菌株，使菌体自然生长；

当培养基中糖份基本耗尽时，保持温度为37℃，将通气量加大至2L/min，加入第一补料液加速诱导；然后匀速加入第二补料液；当第一补料液加入时开始，每4h加入第三补料液，待养分耗尽后收集菌体。

在发酵初始培养基中接入5％～20％体积的OD600＝2～4的细菌种子培养基，使用氨水、硫酸调节pH 6.5～7.3，并保持温度为37℃，溶氧量大于20％，接入视黄醇结合蛋白基因工程菌株，使菌体自然生长；在培养初期不断调节转速使得溶氧始终大于20％，使菌体浓度快速上升；当初始培养基中糖份基本耗尽时，保持温度为37℃，调节转速为最大转速的60％，通气量加大至2L/min；按照60～100ml/L的比例加入第一补料液加速诱导，并按照5～10ml/h/L的速率匀速加入第二补料液，并使用氨水调节pH至6.5～7.3。在诱导阶段，当第一补料液加入时开始，保持温度为37℃，每4h加入第三补料液，待养分消耗后收集菌体。

所述发酵制备方法过程中不可降低发酵温度，第二补料液和第三补料液必须保证合适的浓度，使得所述视黄醇结合蛋白表达量提高2～3倍。

实施例3视黄醇结合蛋白的纯化及复性

3.1纯化工艺

将发酵液调pH至7.0～8.0，600～900bar匀浆，使目标蛋白释放出来；

向匀浆液中加入核酸酶，充分搅拌混匀，5000g离心20min，去除绝大部分核酸、细胞碎片，以及部分杂蛋白；然后收集沉淀；

用2M Urea和50mM Tris重悬沉淀后超声30min，10000g离心30min去除杂蛋白舍弃上清收集沉淀；

向沉淀中加入原体积1/5～1倍体积的50Mm Tris和1％的曲拉通溶液，搅拌30min，10000g离心30min；

变性液采用6M Urea、50mM Tris和2mM DTT溶液，变性包涵体用体积比为1︰10的变性液变性，搅拌充分溶解2h，10000g离心30min；

收集上清。

3.2低温柱上复性方法及纯度测定

将变性后的变性蛋白10℃离心30min，以去除不溶物，制备样品；

用6M Urea和50mM Tris冲平Ni-IDA亲和柱,将所述样品以2cm/min的流速上柱；

上柱完成之后先用8M Urea和50mM Tris溶液冲平亲和柱，将不易吸附于柱子上的杂质清洗干净；

用50mM imI、6M Urea和50mM Tris溶液洗去蛋白，以免影响复性收率和样品质量；

用6M Urea以1cm/min的流速冲洗柱子5～6个柱体积，4M Urea以0.8cm/min的流速冲洗柱子6～8个柱体积；

于4℃条件下用2M Urea和1mg/L FAD溶液以0.6cm/min的流速冲洗柱子8～10个柱体积；pH为8.5的50Mm Tris和2mg/L FAD溶液以0.5cm/min的流速冲洗柱子10～12个柱体积。

将复性后的活性蛋白用Ni²⁺填料纯化，Ni²⁺有六个螯合价位，其中Ni-IDA螯合了三价，载量较高。

用SDS PAGE(十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验样品纯度；采用SP精纯得到高活性高纯度的RBP蛋白。

用此低温柱上复性方法，获得的视黄醇结合蛋白纯度大于95％，且蛋白复性收率大于70％，较现有技术提高约50％。

实施例4视黄醇结合蛋白的稳定性、免疫原性测定

4.1稳定性

4.1.1视黄醇结合蛋白的稳定保存

将本发明所述视黄醇结合蛋白脱盐到含有20mM PB(蛋白体)，用1mM间甲酚和10mMFAD溶液于37℃水浴中加热36h，然后无菌过滤后于-80℃冷冻保存。

4.1.2稳定性检测方法及结果

采用RBP试剂盒确定蛋白活性：RBP试剂盒采购于北京利德曼，测定方案按照试剂说明书于日立7080生化仪上进行测定。

项目对比例A组B组C组蛋白活性(平均)4348535753305342

由于上述数据表明，经过处理的视黄醇结合蛋白活性明显高于对比组，分析原因是经过37℃加热处理后，在保护剂的作用下使得其快速形成正确稳定的结构。

4.2免疫原性检测方法及结果

取家兔30只，并随机分成3组，每组10只，分别编号为A组、B组和C组；将本发明所述视黄醇结合蛋白注射至家兔体内，并采用双向免疫扩散测定其抗体效价，实验结果如下表所示：

项目对比例A组B组C组抗体效价(平均)1：321：641：641：64

由上述结果可知，FAD与视黄醇结合蛋白结合后，免疫原性大大提高。分析原因是由于分子量增大，使得其更加容易被免疫动物识别，并且由于免疫原中FAD的存在，使得其在动物体内存在的时间增加，更加容易产生抗体。实施例5视黄醇结合蛋白的基因序列测定

5.1基因序列

ATGCTGCATCAGCCGACCGTGGAAGTGACCGATGATGCGAGCGTGCGTCGTCGTCCGCGTGCGGTGGCGATTGGCGTGTTTGATGGCGTGCATATTGGCCATGCGCAGGTGATTGCGGGCTGCGATACCGTGCTGACCTTTGATCCGCATCCGCTGCAGGTGCTGCGTCCGGATGATGTGCCGGCGCTGCTGACCACCGTGCCGACCAAAGTGGCGCGTCTGGCGGCGCTGGGCGTGCGTGAAGTGGTGGTGCTGCGTTTTGATGCGCGTTGGGCGGCGGTGGCGGCGCCGAGCTTTGTGGATGATCTGCTGGTGGGCCGTCTGGGCGCGCATACCGTGAGCGTGGGCGCGAACTTTCGTTTTGGCGCGGGCGGCGAAGGCAGCGGCCATGTGCTGCGTCGTGATGGCCGTTTTCGTACCCGTGTGACCCCGCTGGTGCGTAGCGCGGCGGGCGTGGTGAGCAGCAGCCGTATTCGTGCGAGCCTGAGCAGCGGCGATATTGGCGCGGTGACCCGTCTGCTGGGCCGTCCGCATGCGCTGACCGGCCGTGGCGCGCCGGGCCGTAGCGTGGTGGTGGATACCGGCCTGGCGGTGCCGCCGGCGGGCCGTTATCGTGTGCTGGTGAACGATGTGCCGACCCATGCGGTGGTGGATGATCGTGGCCGTATTACCGTGGATGAACAGCTGCGTGGCCGTGTGGAACTGGTGCTGCGTTGCCGTGTGGATCGTccaactttgtacaaaaaagtgccggtggattttaccggctattggaaaatgctggtgaacgaaaactttgaagaatatctgcgtgcgctggatgtgaacgtggcgctgcgtaaaattgcgaacctgctgaaaccggataaagaaattgtgcaggatggcgatcatatgattattcgtaccctgagcaccgttcgtaactatattatggattttcaggtgggcaaagaatttgaagaagatctgaccggcattgatgatcgtaaatgcatgaccaccgtgcgctgggatggcgataaactgcagtgcgtgcagaaaggcgaaaaagaaggccgtggctggacccagtggattgaaggcgatgaactgcatctggaaatgagtgtggaaggcgtggtgtgcaaacaggtgtttaaaaaagtgcagTAA。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。