一种山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代的分子鉴定方法

摘要

本发明公开了一种山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代的分子鉴定方法，包括以下步骤：1、提取待测猕猴桃的基因组DNA；2、利用筛选出的12对引物，分别对待测猕猴桃的基因组DNA进行PCR扩增测序；3、利用SNP位点鉴定山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代，扩增出的12个SNP位点与山梨猕猴桃或中华猕猴桃特有基因型相同，则为山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代。本方法利用SNP位点鉴定杂交子代，重复性好，稳定性高。

说明书

技术领域

本发明属于植物种间杂交品种的鉴定，具体涉及一种山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代的分子鉴定方法。

背景技术

中国是世界猕猴桃资源的起源中心，其遗传资源极为丰富，占全世界猕猴桃遗传资源种属总数的96％。目前，商业开发利用价值较高的主要是中华猕猴桃原变种和中华猕猴桃美味猕猴桃变种、少量的毛花猕猴桃和软枣猕猴桃，因此猕猴桃遗传基础单一和消费群体对高品质猕猴桃需求的矛盾日益突出。种间杂交能聚合父母本优异性状，是猕猴桃优良品种创制的有效途径。由中国科学院武汉植物园选育的黄肉“金艳”猕猴桃是由毛花猕猴桃和中华猕猴桃杂交获得，作为第一个商业化种间杂交猕猴桃品种，“金艳”猕猴桃以其独特的风味和超长贮藏性深受消费者青睐。山梨猕猴桃抗寒、抗病、耐储性好，且果柄基部不生成离层，具有越冬不落果的特性；而中华猕猴桃果实风味佳、适应性强，且耐高温干旱。在山梨猕猴桃和中华猕猴桃的种间杂交后代中，已经筛选到抗病性强且风味优良的优株系，种间杂交的优异资源能有效解决遗传背景狭小的问题，利于优质猕猴桃品种的创新培育。

研究猕猴桃种间杂交的分子鉴定技术，对资源的深度评价以及加速植物品种创新具有重要意义。分子标记因其稳定、不受表型及环境变异影响，已成为新品种特异性、一致性及稳定性(即DUS测试)测试的重要手段。利用AFLP和SSR标记等多种分子标记的方法，对油菜、玉米和水稻等多种作物成功地进行了DUS补充测试。随着第二代测序技术的发展，目前单核苷酸多态性(SNP)标记已广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定、遗传连锁图谱构建和重要农艺性状的定位等相关研究中。最近，利用SNP标记在大麦中成功进行材料鉴定，为猕猴桃进行分子鉴定提供了重要的示例。

本发明选择山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交后代为研究对象，拟开发出一套基于测序和生物信息学手段的鉴定猕猴桃种间杂交特征的分子鉴定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一组用于鉴定山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代的引物，包括12对引物，该组引物分布于猕猴桃不同染色体上，引物扩增序列包含山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代的特有杂合位点。

本发明的再一个目的在于提供一种鉴定山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代的方法，利用SNP位点鉴定杂交子代，重复性好，稳定性高。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一组用于鉴定山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代的引物，包括12对引物，引物序列见表1。

一种用于鉴定山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代的方法，其步骤是：

1、提取待测猕猴桃的基因组DNA；

2、利用表1所示的12对引物，分别对待测猕猴桃的基因组DNA进行PCR扩增测序；

3、利用SNP位点鉴定山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代：第1对引物扩增的分子标记的第81位碱基为A或T，第2对引物扩增的分子标记的第72位碱基为T或A，第3对引物扩增的分子标记的第119位碱基为A或T，第4对引物扩增的分子标记的第94位碱基为T或C，第5对引物扩增的分子标记的第95位碱基为T或A，第6对引物扩增的分子标记的第108位碱基为T或C，第7对引物扩增的分子标记的第109位碱基为G或C，第8对引物扩增的分子标记的第111位碱基为T或C，第9对引物扩增的分子标记的第122位碱基为T或A，第10对引物扩增的分子标记的第74位碱基为T或C，第11对引物扩增的分子标记的第108位碱基为A或T，第12对引物扩增的分子标记的第72位碱基为A或T，则待测猕猴桃为山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代。

与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：

1、传统的植物分类及杂交子代鉴定主要依靠表型特征，随着分子生物学的飞速发展，本发明通过12个分布在不同染色体上的SNP位点对山梨猕猴桃和中华猕猴桃杂交子代进行分子水平的鉴定。本发明通过一组特异的位点来鉴定杂交子代，不受表型和环境因素的影响，鉴定准确率高，重复性好。

2、本发明开发出一种适用猕猴桃种间杂交品种的分子鉴定方法，经实验证明此套分子鉴定方法具有重复性好、稳定性高的特点。本发明基于第二代测序技术，分子标记分布于不同染色体上，在分子水平对种间杂交子代进行鉴定。

具体实施方式

实施例1：山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代SNP分子标记的获得

1、山梨猕猴桃(母本)、中华猕猴桃(父本)及其杂交子代的DNA提取及简化全基因组测序：采用CTAB法提取山梨猕猴桃、中华猕猴桃及250份杂交子代的DNA，将质量合格的DNA用于RAD-seq文库构建，检测文库质量，基于Illumina HiSeq2000测序平台，对所有的分析样本进行简化基因组测序，获得山梨猕猴桃、中华猕猴桃及其杂交子代的简化基因组序列；

2、山梨猕猴桃、中华猕猴桃及其子代的简化全基因组测序数据过滤和质量控制，并比对到参考基因组序列：将测序得到的原始数据进行过滤，通过接头将样本数据分类，并去除低质量碱基(即测序质量值小于20的碱基)含量大于50％的序列，剔除有测序接头污染的序列，剔除具有大量重复的序列；使用软件SOAP2(默认参数)将符合过滤标准的测序数据比对到参考基因组(http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)；

3、发掘大量母本山梨猕猴桃和父本中华猕猴桃中特有纯合位点，检测杂交子代中对应的特异杂合位点：为了降低SNP标记错误率，将测序比对结果中比对序列少于5或者多余200的测序片段剔除；使用软件SOAPsnp对每个样本进行位点变异检测，检出基因组水平的SNP位点，获得初步的检测结果.vcf格式的文件；将所有个体的变异检测结果合并为多样本的变异检测结果；通过测序比对以及SNP检测，最终获得山梨猕猴桃和中华猕猴桃均为纯合位点，而杂交子代为杂合位点的SNP位点18952个，此结果证实山梨猕猴桃和中华猕猴桃的杂交后代中，一部分基因组来源于母本山梨猕猴桃，一部分来源于父本中华猕猴桃；

4、挑选一套分布在猕猴桃不同染色体的特异SNP位点：从上述筛选到的18952个SNP位点中，挑选均匀分布于各个染色体且GC含量在40％～60％之间的SNP位点，由此筛选出均匀分布在基因组的29个SNP位点；

5、SNP位点的重验证：基于已筛选的29个SNP位点的上、下游特异序列设计引物，引物设计基于程序PRIMER 5，引物长度控制在17-23bp，GC含量40％-60％，退火温度范围在50℃-65℃，扩增的PCR产物长度在100bp-200bp。通过在杂交后代中进行PCR扩增并测序，获得一套包含12个SNP位点的标记，该套分子标记的扩增引物及SNP位点如表1所示，对应的分子标记的序列如SEQ ID NO.1-12所示，SNP位点以R表示。

表1山梨猕猴桃和中华猕猴桃杂交子代的12个SNP位点及扩增引物

在山梨猕猴桃、中华猕猴桃以及其杂交后代中扩增测序、序列比对，通过杂交后代在12个SNP位点上基因型分析，结果表明杂交后代中部分位点出现父本特异位点，部分位点出现母本特异位点，且测序峰图显示特异位点为杂合。综上所述，这套SNP位点真实可靠，以此证实本发明切实可行。

实施例2：SNP分子标记在鉴定山梨猕猴桃和中华猕猴桃杂交群体中的应用

1、山梨猕猴桃、中华猕猴桃及其杂交子代的DNA提取

采用CTAB法提取国家猕猴桃资源圃内1份山梨猕猴桃DNA、1份中华猕猴桃DNA、10份山梨猕猴桃和中华猕猴桃杂交子代的DNA、1份软枣猕猴桃DNA、1份繁花猕猴桃DNA和1份毛花猕猴桃。将获得的DNA样本储藏于-20度冰柜待用；

2、扩增山梨猕猴桃和中华猕猴桃中的特异位点

采用实施例1中获得的12对SNP位点的引物，在山梨猕猴桃、中华猕猴桃软枣猕猴桃、繁花猕猴桃、毛花猕猴桃以及10份山梨猕猴桃和中华猕猴桃杂交子代中进行PCR扩增，反应体系10μL：含有20ng·μL^-1样本DNA为模板，10mmol·L^-1dNTP>-1TaqDNA聚合酶0.05μL，10pmol·μL^-1的正反向引物各0.5μL；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环；72℃延伸5min；

3、测序扩增片段并检出特异位点

将扩增获得的山梨猕猴桃、中华猕猴桃、软枣猕猴桃、繁花猕猴桃、毛花猕猴桃以及山梨和中华猕猴桃杂交后代的扩增片段，进行测序验证，通过杂交后代在SNP位点上基因型分析，结果表明在10个杂交后代中部分位点为父本特有基因型，部分位点为母本特有基因型(表2)。而在12个位点中，软枣猕猴桃、繁花猕猴桃和毛花猕猴桃中均出现有与山梨猕猴桃和中华猕猴桃不同的基因型。该套分子标记可在分子水平上对山梨猕猴桃和中华猕猴桃杂交后代进行鉴定，克服了传统表型识别的主观性，准确率高，且不受环境影响，简单易操作。

表2不同品种的猕猴桃在特异位点的等位基因型

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉植物园

<120> 一种山梨猕猴桃和中华猕猴桃种间杂交子代的分子鉴定方法

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<170> PatentIn version 3.5

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