一种L‑茶氨酸铁螯合物及制备方法和含该螯合物的速溶茶粉及制备方法

摘要

本发明一种L‑茶氨酸铁螯合物及制备方法和含该螯合物的速溶茶粉及制备方法，所述L‑茶氨酸铁螯合物的制备方法，以L‑茶氨酸和亚铁盐为原料，以pH值为3‑7的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30‑80℃下混合，反应完全后将反应液分离纯化，获得L‑茶氨酸铁螯合物；所述L‑茶氨酸与亚铁盐溶液质量比为(4‑1)：1；所述的L‑茶氨酸由枯草芽孢杆菌发酵所产的γ‑谷氨酰转肽酶，以L‑谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物发酵制备得到。本发明采用微生物酶法制备L‑茶氨酸，在此基础上，采用水体系合成法螯合亚铁离子和L‑茶氨酸，得到L‑茶氨酸铁螯合物，生产成本低，环境安全性高，资源消耗少，能够进行大量安全生产。

说明书

技术领域

本发明涉及茶氨酸螯合物及其功能性茶饮料的制备方法，具体为一种L-茶氨酸铁螯合物及制备方法和含该螯合物的速溶茶粉及制备方法。

背景技术

铁元素是人体内必须的微量元素。铁参与机体组织内氧的正常运输，直接影响机体的能量和蛋白质代谢，而且会影响人体的免疫机能。据调查，中国67.5％的孕妇会发生贫血，孕妇贫血的话会出现疲倦、乏力、头晕、耳鸣、注意力不集中等症状。孕妇贫血对孕妇和胎儿来说危害性很大，如果严重贫血会导致胎儿缺氧，引起胎儿宫内发育迟缓，早产甚至死亡。铁以二价铁(亚铁)的形式吸收，而以三价铁(正铁)的形式起作用。补铁剂的发展经历了三个阶段。第一代为有机亚铁盐类，如硫酸亚铁、氯化亚铁、碳酸亚铁等。第二代为有机亚铁盐类，如乳酸亚铁、柠檬酸亚铁；第三代为氨基酸亚铁，如甘氨酸亚铁。目前国内外使用的补铁剂主要是第一、第二代产品。第一代产品性质不稳定，易潮解易氧化，有铁腥味。第二代补铁剂吸收利用率有较好提高，但会引起肠胃不良反应。第三代产品性质稳定，口感好、利用率高，不刺激肠胃，但生产成本高。我国市场上已有多种氨基酸金属螯合物产品问世，如母力铁、红亮素、佳乐美铜、蛋白微素精等。食品和营养科学研究表明，在食品中添加氨基酸亚铁螯合物可明显改善人体的血红蛋白和血清血红素水平，对贫血患者治疗效果显著。而且氨基酸亚铁螯合物能增加铁元素在动物肠腔中的溶解度，大大促进机体对亚铁离子的吸收。

L-茶氨酸(L-Theanine)是茶叶中含量最高的氨基酸，约占游离氨基酸总量的50％以上，占茶叶干重的1％-2％。L-茶氨酸为白色针状体，易溶于水。具有甜味和鲜爽味，是茶叶的滋味组分。L-茶氨酸含量约为新茶的1～2％左右，其含量随发酵过程减少。L-茶氨酸本身还具有许多生理功能：(1)能影响脑内神经传达物质的变化，增强记忆力；(2)有镇静作用，可能预防神经失调症、失眠症、经期综合症等；(3)能保护神经细胞，可用于对脑栓塞、脑出血、脑中风、脑缺血以及老年痴呆等疾病的防治；(4)有降血压作用；(5)能增强抗癌药物的疗效；(6)能抑制癌细胞的漫润；(7)能提高免疫力。1964年，日本批准了L-茶氨酸为食品添加剂使用，而美国FDA也在1985年给予了L-茶氨酸GRAS的分类，意味着可以自由地用于各种食品中。而在中国L-茶氨酸应用的进展比较慢，直到2014年7月18日，卫计委终于批准了它作为新的食品原料。

早在20世纪70年代就已经发现氨基酸和小肽具有促进铁吸收的作用，而且氨基酸和肽的金属复合体如Fe、Zn和Mg的生物学利用率比无机盐高，且无毒副作用。因此，开发兼具L-茶氨酸多种生理功能和微量元素高生物学利用率的的氨基酸螯合铁保健品具有重要意义。无论是单一氨基酸还是用蛋白质水解得到的复合氨基酸，当其与金属离子螯合时，螯合工艺大致相同，主要有：水体系合成法、微波固相法、室温固相法及电解合成法。水体系合成法工艺周期长，螯合反应温度和pH较难控制，易被废液污染，但产率较高。此工艺是氨基酸螯合微肥生产较为理想的选择。微波固相法合成操作简便省时，制得产品纯度较高，但易产生副产物且在微波下易焦糊，很难大规模生产。室温固相法主要用于纳米材料的合成，对螯合原料纯度要求较高。电解合成法昂贵又费时。目前国内外研究较多的是甘氨酸亚铁、蛋氨酸亚铁、酪氨酸亚铁等，而对于L-茶氨酸与亚铁离子的螯合物几乎没有相关报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种L-茶氨酸铁螯合物及制备方法和含该螯合物的速溶茶粉及制备方法，生产成本较低，不受资源限制，环境污染小，可大量生产且产品比较安全。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种L-茶氨酸铁螯合物的制备方法，以L-茶氨酸和亚铁盐为原料，以pH值为3-7的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-80℃下混合，反应完全后将反应液分离纯化，获得L-茶氨酸铁螯合物；

所述L-茶氨酸与亚铁盐溶液质量比为(4-1)：1；所述的L-茶氨酸由枯草芽孢杆菌发酵所产的γ-谷氨酰转肽酶，以L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物发酵制备得到。

优选的，所述L-茶氨酸铁螯合物具体制备步骤如下：

步骤1，合成L-茶氨酸原料液；

步骤2，将L-茶氨酸原料液脱色过滤后，滤液备用；

步骤3，在滤液中加入滤液体积10％的抗坏血酸用于防止亚铁离子被氧化，搅拌后加入质量浓度为20％的亚铁盐溶液；用柠檬酸调节至pH值为3-7，氮气吹扫，于30-80℃下搅拌10-30min进行螯合反应；

步骤4，螯合反应结束后，自然冷却至室温，进行纯化；将反应液离心后，除去上清液，将沉淀用95％的乙醇洗涤抽滤多次，取滤饼干燥后得到L-茶氨酸铁螯合物。

进一步，所述的步骤1的具体步骤如下，

1.1将枯草芽孢杆菌接种在平板培养基上，在37℃下静置培养16h进行一次活化后，再转接到液体培养基上进行二次活化；将经两次活化好的枯草芽孢杆菌二级种子液按体积分数3％接种量转接于30mL发酵培养液中，置于恒温培养箱中37℃振荡培养12-16h；

1.2收集振荡培养的发酵液离心后得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液；采用分光光度计测定酶活，选取酶活0.01U/mL-0.2U/mL的粗酶液备用，进行催化反应；

1.3分别加入粗酶液质量10％的L-谷氨酰胺和粗酶液质量10％的乙胺盐酸盐溶液进行催化反应，L-谷氨酰胺的浓度为15-50mmol/L，乙胺盐酸盐的浓度为20-80mmol/L；用乙胺水调节催化反应体系至pH值为10，37℃静置培养5-8h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

再进一步，步骤2中，加入L-茶氨酸原料液重量2％的活性炭进行吸附脱色，反应过程温度为60-80℃，反应时间为3-8min。

优选的，所述亚铁盐为硫酸亚铁或氯化亚铁。

一种由本发明所述的方法制备得到的L-茶氨酸铁螯合物。

一种含L-茶氨酸铁螯合物的速溶茶粉制备方法，包括如下步骤，

步骤1，将本发明所述的L-茶氨酸铁螯合物配制成质量体积分数为10％-30％的溶液，添加营养物和赋形剂溶解后混合均匀；得到混合溶液；

步骤2，将混合溶液依次经过湿热灭菌和喷雾干燥，出粉后采用液化床冷却，过筛后即获得含L-茶氨酸铁螯合物的速溶茶粉。

优选的，湿热灭菌的灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min；喷雾干燥的进风温度为160-180℃，排风温度为80-85℃；过筛时筛孔的大小为60目。

优选的，所述的营养物采用维生素C；所述的赋形剂采用麦芽糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇中的至少一种。

一种由本发明所述的方法制备得到的含L-茶氨酸铁螯合物的速溶茶粉。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明采用微生物酶法制备L-茶氨酸，在此基础上，采用水体系合成法螯合亚铁离子和L-茶氨酸，得到L-茶氨酸铁螯合物，生产成本低，环境安全性高，资源消耗少，能够进行大量安全生产。L-茶氨酸被评为“最值得开发的食品新材料”，其特有的生理功能与亚铁离子补血功能相结合，不但能提高彼此的生物利用率，还能获得清香茶风味，在食品、医药、化妆品行业具有广泛应用前景。本发明制备的L-茶氨酸铁螯合率稳定性高，如图1所示；不会被胃酸或食物中的植物酸、草酸等破坏，因此不会受到食物的干扰而影响吸收，无任何毒副作用。

本发明所述的含L-茶氨酸铁螯合物的速溶茶粉，作为保健茶，既有L-茶氨酸所含的茶香味和鲜爽味，又具有提高免疫力等多重功能。茶粉冲服成水饮品之后色泽清润透亮、气味香甜，茶香浓郁，饮用方便、口感极佳。

进一步的，通过乙醇纯化析出结晶，得到产品纯度较好，含量可到95％以上，回收率为96％-99％，晶体质地均匀，色泽纯净，质量上佳。

附图说明

图1为本发明实例中所述L-茶氨酸和L-茶氨酸铁螯合物由紫外扫描仪U-1800得到的吸收光谱曲线。

图中：a为L-茶氨酸的吸收光谱曲线，b为L-茶氨酸铁螯合物的吸收光谱曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

一种含L-茶氨酸铁螯合物的速溶茶粉制备方法，包括如下步骤：

第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢杆菌接种在平板培养基上，37℃静置培养16h，再转接到3mL液体培养基上进行活化。将活化2次的枯草芽孢杆菌二级种子液按体积分数3％接种量转接于30mL发酵培养液中，置于恒温培养箱中37℃振荡培养，隔夜培养12h。

第二：收集发酵液于8000rpm离心25min，得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液。采用分光光度计测定酶活。选取酶活0.01U/mL的粗酶液20mL备用进行催化反应。

第三：分别加入粗酶液重量10％的L-谷氨酰胺(浓度15mmol/L)和乙胺盐酸盐(浓度20mmol/L)溶液进行催化反应，用乙胺水调节反应体系至pH10，37℃静置培养5h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

第四：将原料液过滤，除去杂质。加入原料液重量2％的活性炭搅拌，进行吸附脱色，反应过程温度为60℃，反应时间为3min。脱色后再次过滤，滤液备用。

第五：加入滤液体积10％的抗坏血酸防止亚铁离子被氧化，搅拌后加入质量浓度为20％的亚铁盐溶液，加入量为滤液质量的25％，用柠檬酸调节至pH3，氮气吹扫，于30℃下搅拌10min进行螯合反应。采用双硫腙显色法初步判断螯合物质量及稳定性。所述亚铁盐为氯化亚铁。

第六：螯合反应结束后，自然冷却。将反应液在4000rpm下离心20min，除去上清液，用适量无水乙醇处理得到沉淀，抽滤，收集滤饼。具体的，离心3次后，用体积浓度95％乙醇溶液洗涤抽滤3次，最后对滤饼真空冷冻干燥得L-茶氨酸铁螯合物。真空冷冻干燥温度为5℃-40℃，本具体实施例优选5℃。

第七：制备L-茶氨酸铁螯合物溶液(10％，w/v)、添加营养物维生素C和赋形剂麦芽糊精各5％(w/v)，蔗糖3％(w/v)溶解混匀。

第八：将上述混合液进行湿热灭菌(121℃，15min)，喷雾干燥(进风温度160℃，排风温度80℃)，出粉后采用液化床冷却，过60目筛，制粒，装袋。

实施例2

一种含L-茶氨酸铁螯合物的速溶茶粉制备方法，包括如下步骤：

第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢杆菌接种在平板培养基上，37℃静置培养16h，再转接到3mL液体培养基上进行活化。将活化2次的枯草芽孢杆菌二级种子液按体积分数3％接种量转接于30mL发酵培养液中，置于恒温培养箱中37℃振荡培养，隔夜培养16h。

第二：收集发酵液于8000rpm离心25min，得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液。采用分光光度计测定酶活。选取酶活0.15U/mL的粗酶液20mL备用进行催化反应。

第三：分别加入粗酶液重量10％的L-谷氨酰胺(浓度30mmol/L)和乙胺盐酸盐(浓度50mmol/L)溶液进行催化反应，用乙胺水调节反应体系至pH10，37℃静置培养6h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

第四：将原料液过滤，除去杂质。加入原料液重量2％的活性炭进行吸附脱色，反应过程温度为70℃，反应时间为6min。脱色后再次过滤，滤液备用。

第五：加入滤液体积10％的抗坏血酸防止亚铁离子被氧化，搅拌后加入质量浓度为20％的亚铁盐溶液，加入量为滤液质量的50％，用柠檬酸调节至pH5，氮气吹扫，于40℃下搅拌20min进行螯合反应。采用双硫腙显色法初步判断螯合物质量及稳定性。所述亚铁盐为硫酸亚铁。

第六：螯合反应结束后，自然冷却。将反应液在4000rpm下离心30min，除去上清液，用适量无水乙醇处理得到沉淀，抽滤，收集滤饼。具体的，离心3次后，用体积浓度95％乙醇溶液洗涤抽滤4次，最后对滤饼真空冷冻干燥得L-茶氨酸铁螯合物。真空冷冻干燥温度为20℃。

第七：制备L-茶氨酸铁螯合物溶液(25％，w/v)、添加营养物维生素C和赋形剂山梨醇各5％(w/v)，木糖醇3％(w/v)，乳糖3％(w/v)溶解混匀。

第八：将上述混合液进行湿热灭菌(121℃，15min)，喷雾干燥(进风温度170℃，排风温度83℃)，出粉后采用液化床冷却，过60目筛，制粒，装袋。

实施例3

一种含L-茶氨酸铁螯合物的速溶茶粉制备方法，包括如下步骤：

第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢杆菌接种在平板培养基上，37℃静置培养16h，再转接到3mL液体培养基上进行活化。将活化2次的枯草芽孢杆菌二级种子液按体积分数3％接种量转接于30mL发酵培养液中，置于恒温培养箱中37℃振荡培养，隔夜培养14h。

第二：收集发酵液于8000rpm离心25min，得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液。采用分光光度计测定酶活。选取酶活0.2U/mL的粗酶液20mL备用进行催化反应。

第三：分别加入粗酶液重量10％的L-谷氨酰胺(浓度50mmol/L)和乙胺盐酸盐(浓度80mmol/L)溶液进行催化反应，用乙胺水调节反应体系至pH10，37℃静置培养8h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

第四：将原料液过滤，除去杂质。加入原料液重量2％的活性炭进行吸附脱色，反应过程温度为80℃，反应时间为8min。脱色后再次过滤，滤液备用。

第五：加入滤液体积10％的抗坏血酸防止亚铁离子被氧化，搅拌后加入质量浓度为20％的亚铁盐溶液，加入量为滤液质量的100％，用柠檬酸调节至pH7，氮气吹扫，于60℃下搅拌30min进行螯合反应。采用双硫腙显色法初步判断螯合物质量及稳定性。所述亚铁盐为氯化亚铁。

第六：螯合反应结束后，自然冷却。将反应液在4000rpm下离心40min，除去上清液，用适量无水乙醇处理得到沉淀，抽滤，收集滤饼。具体的，离心3次后，用体积浓度95％乙醇溶液洗涤抽滤5次，最后对滤饼真空冷冻干燥得L-茶氨酸铁螯合物。真空冷冻干燥温度为40℃。

第七：制备L-茶氨酸铁螯合物溶液(30％，w/v)、添加营养物维生素C和赋形剂甘露醇5％(w/v)，木糖醇3％(w/v)，蔗糖3％(w/v)溶解混匀。

第八：将上述混合液进行湿热灭菌(121℃，15min)，喷雾干燥(进风温度180℃，排风温度85℃)，出粉后采用液化床冷却，过60目筛，制粒，装袋。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各方面的单个例子，本发明范围还包括功能等同的方法和组分。本领域技术人员在没有脱离权利要求限定范围的前提下，仍然可以对本发明做出各种改进和变换，所做的改进和变换仍然属于本发明的保护范围。