一种鉴定中药守宫的特异性引物、试剂盒及鉴别方法

摘要

本发明提供了一种鉴定中药守宫的特异性引物、试剂盒及鉴别方法，基于守宫的CYTB基因设计了大量的引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物，使用上述引物对待测中药守宫进行鉴定，能将守宫药材与其他混淆品准确的分开，且其PCR扩增产物仅为100～250bp，分子量小，保证了其在短时间内进行大量的中药守宫鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定中药守宫的特异性引物、试剂盒及鉴别方法。

背景技术

守宫为壁虎科动物无蹼壁虎(Gekko Swinhoana Gunther)的全体，其药性寒、味咸，有小毒，入肺、肾经。具有散结解毒、滋阴凉血、熄风镇痉、透经达络等功效。古代医学典籍中关于守宫的记载有很多，如《本草纲目》中记载，守宫主治中风瘫痪，手足不举，或历节风痛，及风惊痫，小儿疳痢，血积瘰，疗蝎螫；清代赵其光在《本草求原》中提到守宫入血分、治血病，有滋阴降痰之功效；《四川中药志》称其能“驱风、破血积包块，治肿瘤”。

由于守宫的来源比较复杂，市售守宫常出现混杂或伪品，如东方蝾螈、中国瘰螈、变色树蜥、蛤蚧、红螺疣螈、喜山岩蜥、青海沙蜥、石龙子和变色沙蜥等。对其中的一些品种，守宫正品与之形态学特征差别细微，采用传统的鉴别方法很难对守宫药材进行鉴定，鉴于守宫在炮制、加工、储藏和运输等各个环节形态有所改变，使得守宫及其混伪品的性状特征消失，从而加大了鉴别难度。而不法分子在经济利益的驱使下，守宫“以假充真”、“以次充好”、“不合格产品”的市场现象普遍存在，即使具有丰富鉴别经验的人员也很难根据形态特征进行准确地鉴别。为确保中药材的质量及临床疗效，已有研究采用现代分子生物学PCR扩增技术，可在短时间内完成对部分中药材的鉴别，然而现有技术中还未提出一种利用PCR技术来快速鉴别中药守宫种的特异性引物以及方法。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种鉴定中药守宫的特异性引物，采用所述引物鉴定中药守宫，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测中药守宫进行快速鉴定，效率高。

本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种鉴定中药守宫的试剂盒，采用所述试剂盒鉴定中药守宫，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测中药守宫进行快速鉴定，效率高。

本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种鉴定中药守宫的方法，采用所述方法鉴定中药守宫，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测中药守宫进行快速鉴定，效率高。

为此，本发明提供了一种用于鉴定中药守宫的引物，所述引物如下：

上游引物：5′-CAACGGGGCCCTATATTCCG-3′；

下游引物：5′-AGGGTTGCGTATGGGGTTTC-3′。

本发明提供了一种鉴定中药守宫的试剂盒，含有上述的引物。

所述的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg²⁺扩增缓冲液、dNTPs、Taq>2O。

本发明还提供了一种所述的引物或所述的试剂盒在鉴定中药守宫中的应用。

本发明提供了一种鉴定中药守宫的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测中药守宫的总DNA，备用；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：

上游引物：5′-CAACGGGGCCCTATATTCCG-3′；

下游引物：5′-AGGGTTGCGTATGGGGTTTC-3′。

(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有100～250bp的DNA片段，则所述待测中药守宫为真；反之，则所述待测中药守宫为假。

所述的方法，所述步骤(2)中，所述PCR反应体系包括：

DNA模板，100ng，2μL；

上游引物，10μM，1μL；

下游引物，10μM，1μL；

PCR>

ddH₂O，8μL；

反应总体积为22μL。

所述的方法，所述步骤(2)中，所述PCR扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，然后继续72℃延伸5min，降温至4℃，获得的扩增产物4℃保存。

所述的方法，所述步骤(3)中，所述100～250bp的DNA片段为110～150bp的DNA片段。

所述的方法，所述100～250bp的DNA片段为116bp的DNA片段。

所述的方法，所述的116bp的DNA片段序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明技术方案，具有如下优点：

(1)本发明所述的用于鉴定中药守宫的特异性引物，基于守宫的CYT B基因设计了大量的引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物，使用上述引物对待测中药守宫进行鉴定，能将守宫药材与其他混淆品准确的分开，且其PCR扩增产物仅为100～250bp，分子量小，保证了其在短时间内进行大量的中药守宫鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。

(2)本发明所述的用于鉴定中药守宫的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的用于鉴定中药守宫的特异性引物，所述引物具有种属特异性，使用上述引物对待测中药守宫进行鉴定，能将守宫药材与其他混淆品准确的分开，在短时间内进行大量的中药守宫鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。

(3)本发明所述的鉴定中药守宫的方法，包括如下步骤：(1)提取待测中药守宫的总DNA，备用；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用本发明设计的引物进行PCR扩增；(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有100～250bp的DNA片段，则所述待测中药守宫为真；反之，则所述待测中药守宫为假；所述方法能将守宫药材与其他混淆品准确的分开，且PCR扩增产物仅为100～250bp，分子量小，保证了其在短时间内进行大量的中药守宫鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。

(4)本发明所述的鉴定中药守宫的方法，所述步骤(3)中，所述100～250bp的DNA片段为116bp的DNA片段，PCR扩增产物分子量小，保证了其在短时间内进行大量的中药守宫鉴定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，很显然下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3中的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明所使用的主要试剂如下：

Genomic>PCR SuperMix(+dye)和Trans2K Plus DNA Marker(北京全式金生物技术公司)。

本发明所使用的主要设备如下：

ST16R高速冷冻离心机购自赛默飞世尔、V-GES电泳仪购自威泰克、Dolphin View凝胶成像系统购自威泰克。

实施例1

本实施例提供了一种用于鉴定中药守宫的特异性引物，针对守宫的CYT B基因设计的特异性引物如下，参见序列表中SEQ ID NO：1-2所示：

上游引物：5′-CAACGGGGCCCTATATTCCG-3′；

下游引物：5′-AGGGTTGCGTATGGGGTTTC-3′。

上述引物由上海英潍捷基公司(北京合成部)合成。

实施例2

本实施例提供了一种用于鉴定中药守宫的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述引物液为含所述实施例1中的所述特异性引物；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg²⁺扩增缓冲液、dNTPs、Taq>2O，每支所述试剂盒的配方为：

上游引物，10μM，1μL；

下游引物，10μM，1μL；

PCR>

ddH₂O，8μL。

实施例3

本实施例提供了一种利用实施例1的特异性引物或实施例2的试剂盒鉴定中药守宫的方法，包括如下步骤：

(1)药材收集于山西、安徽、广西和河北等省份(表1)，表1中试验所有的样品均为市售产品，可以通过购买得到，或是自来源地采集或购买。

表1守宫及其常见伪品样品来源

选取上表1中的样品的冻干粉采用Genomic DNAKit提取总DNA，按照说明书操作，步骤如下：

(1)提取待测中药守宫的总DNA

1)分别取各样品的冻干粉≤25mg，置于一无菌的1.5mL离心管中；

2)加入100μL的LB2(裂解液)和20μL的Proteinase K(蛋白酶K)；

3)55℃金属浴孵育直至完全裂解，大约1小时，每15min颠倒混匀一次；

4)加入20μL的RNase A(RNA酶)于样品中，室温孵育2min，以去除RNA的干扰；

5)12000rpm离心5min，转移上清液于一无菌的离心管中；

6)加入500μL的BB2(结合缓冲液)，立即涡旋5s，室温孵育10min；

7)将全部的溶液加入离心柱中，12000rpm离心30s，弃去流出液；

8)加入500μL的CB2(清洗缓冲液)，12000rpm离心30s，弃去流出液；

9)重复步骤8)一次；

10)加入500μL的WB2(洗涤缓冲液)，12000rpm离心30s，弃去流出液；

11)重复步骤10)一次；

12)12000rpm离心2min，彻底去除残留的WB2；

13)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入50μL 65℃预热EB(洗脱缓冲液)，室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA作为供试品溶液，置于-20℃保存。

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：

上游引物：5′-CAACGGGGCCCTATATTCCG-3′；

下游引物：5′-AGGGTTGCGTATGGGGTTTC-3′。

所述PCR反应体系包括：

DNA模板，100ng，2μL；

上游引物，10μM，1μL；

下游引物，10μM，1μL；

PCR>

ddH₂O，8μL；

反应总体积为22μL。

所述PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，然后继续72℃延伸5min，降温至4℃，获得的扩增产物4℃保存。

(3)取步骤(2)中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用V-GES电泳仪，测得各样品的PCR扩增产物的大小，琼脂糖凝胶电泳法按照2015年版中国药典三部附录ⅣB，胶浓度为1％，电泳缓冲液为TAE缓冲液(Tris-EDTA-乙酸缓冲液，pH 8.3)，上述步骤(2)中获得的各样品的PCR反应溶液的上样量分别为10μL，DNA分子量标记(Trans2K Plus DNAMarker)上样量为2μL，电泳结束后，取凝胶在溴化乙锭溶液(0.5μg/mL)中染色20min，在Dolphin View凝胶成像系统上观察结果，其中1为DNA Marker，2为守宫，3为蛤蚧，4为变色树蜥，5为丽斑麻蜥，6为中国石龙子(图1)，蛤蚧、变色树蜥、丽斑麻蜥和中国石龙子没有条带，而守宫的冻干粉的PCR反应液分别在100～250bp和250～500bp各有一条DNA条带，其中250～500bp扩增条带为非特异性扩增带，在100～250bp位置的DNA条带为引物设计的PCR产物大小(116bp)，表明本发明设计的引物具有种属特异性，采用该引物及本发明方法能准确的将守宫药材与其他混淆品鉴别开来，并且扩增的DNA片段仅为116bp，分子量小，检测速率快，采用OMEGA公司的DNA Gel Extraction Kit纯化回收在100～250bp位置的DNA条带即116bp的DNA片段序列，然后由上海英潍捷基公司(北京合成部)进行测序，所述的116bp的DNA片段序列如SEQ.ID NO：3所示，由所述序列SEQ.ID NO：3可知，所述116bp的DNA片段序列为特异性扩增条带，进一步证明本发明设计的引物具有种属特异性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京建生药业有限公司

<120> 一种鉴定中药守宫的特异性引物、试剂盒及鉴别方法

<130> HA201602557

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caacggggcc ctatattccg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agggttgcgt atggggtttc 20

<210> 3

<211> 116

<212> DNA

<213> 守宫Gekko swinhoana gunther

<400> 3

caacggggcc ctatattccg accactcact cgattaacac ttttaatcct agccaacaac 60

atcatcctac tgacctgatt aggcggagaa ccagttgaaa ccccatacgc aaccct 116