一种利用皮肤成纤维细胞钾离子通道评价抗衰老功效的方法

摘要

本发明公开了一种对受试样品的抗衰老功效进行评价的方法，所述方法包括以下步骤：a)在细胞培养液中培养成纤维细胞，得到包含成纤维细胞的培养液；b)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到基线电流；c)将受试样品加入步骤a)的培养液中；d)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到加入受试样品之后的电流；e)将步骤b)的检测结果与步骤d)的检测结果进行比较，与基线电流相比电流升高则判定所述样品具有抗衰老功效。本发明还涉及对受试样品的抗衰老功效进行评价的装置。

说明书

技术领域

本发明涉及抗衰老领域一种新的评估方法，具体涉及一种通过膜片钳技术检测皮肤成纤维细胞钾离子通道来评价产品抗衰老功效的方法。本评估方法可以用于包括皮肤外用剂在内的化妆品、药品、食品的抗衰老功效评估领域。

背景技术

抗衰老作为化妆品、食品、药品以及保健品等领域的一个重要研究课题，已经得到广泛关注，对于抗衰老的研究也日益深入，有关皮肤衰老的机理学说也多达十余种。近年来，最为常见的皮肤衰老的机理是自由基学说、基因学说、线粒体DNA损伤学说等等。

皮肤衰老在表皮表现为表皮更新减慢、屏障功能减弱、角质形成细胞活力下降、表皮受伤后修复能力减弱。真皮衰老表现为真皮对外来化学物清除力下降，真皮厚度变薄、胶原蛋白和弹性蛋白合成减少、分解增加，分解酶活性增强。真皮厚度变薄，胶原含量减少，特别是可溶性胶原含量下降明显；胞外间质中透明质酸和硫酸皮肤素含量明显下降，糖胺多糖总含量下降。此外，胶原纤维和弹性纤维排列也渐趋紊乱。作为皮肤的一个重要组成部分和皮肤真皮中主要的细胞类型，成纤维细胞在调节皮肤生理和病理方面发挥关键作用，因为他们能够生产真皮组织的细胞外基质。此外，成纤维细胞之间不仅能够相互沟通还能够与皮肤中其他类型的细胞有联系。而且，成纤维细胞不仅积极参与刺激细胞的增殖和凋亡，也参与到创面修复，免疫反应和真皮的炎症过程中，因为他们能通过自分泌和旁分泌的相互作用释放多种生长因子和细胞因子。因此，调节成纤维细胞的增殖与抗皮肤衰老息息相关。

目前现有技术中的针对抗衰老的体外评估方法中，比较广泛使用的方法有：DPPH自由基清除检测、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测、DNA损伤检测、成纤维细胞增殖等方法。现有技术的抗衰评估方法存在许多缺点，例如DPPH自由基清除检测法中，DPPH既是氧化剂又是自由基指示剂，当被测物与DPPH紫外吸收有交叠时，会影响测定结果。此外，DPPH的颜色虽然主要因单电子转移反应消除，但也可以由氢转移反应消除。由于空间位阻决定反应的倾向，因此小分子化合物由于更接近自由基而拥有相对较高的抗氧化能力。许多在体内与过氧自由基发生快速反应的抗氧化剂可能因空间位阻等原因不易与DPPH自由基反应。此外，大部分抗衰老评价方法，没有深入揭示抗衰老功效的机理，易引起假阳性结果，并需要多个实验组合，共同验证抗衰老功效，操作较复杂、成本较高。

本发明是基于以下意外发现：抗衰老作用与成纤维细胞钾离子通道的开放有关。钾离子通道是细胞膜上允许K+流入或者流出细胞的离子通道蛋白。它也是目前发现亚型最多，功能最复杂的一类离子通道。钾离子通道具有很强的普遍性，分布广泛。它大范围地存在于机体的各种组织和器官中，如心脏、神经、血管、气管、皮肤和内分泌等细胞上都有钾离子通道的存在。钾离子通道具有较强的多样性，并且不同类型的钾离子通道都有各自特异性的阻断剂，比如：Apamin、Scyllatoxin和Curare可以阻断SK；而Clotrimazole则是中电导的钙激活钾离子通道的特异性阻断剂。钾离子通道不仅能够参与神经细胞膜静息电位的建立、决定其动作电位的发放频率和幅度，还与细胞的发育、成熟等有关，钾离子通道作为药物的靶点也正在广泛开展。因此，研究钾离子通道的调控以及在生物学功能中的作用和规律，不仅对于研发药物治疗钾离子通道疾病可提供临床指导价值，对于深入研究药物(添加剂)的功效也具有重要意义，但是对于钾离子通道的研究还未有涉及抗衰老领域。

人皮肤成纤维细胞上的离子通道表达的研究第一次是由Estacion在1991年使用膜片钳技术进行诠释的。尽管人皮肤成纤维细胞被列为非兴奋性细胞，但是它能表达各种不同的离子通道的表型，包括电压门控外向延迟整流钾离子通道(IK),钙激活钾离子通道(IK(Ca))及A型瞬时外向钾离子通道(IA)。最近，Yun等人的研究表明三类功能性钙激活钾离子通道，大电导钙激活钾离子通道(BK)，中间电导钙激活钾离子通道(IK)及小电导钙激活钾离子通道(SK)，在人皮肤成纤维细胞中都有表达。然而，关于成纤维细胞拥有的离子通道类型、功能以及被调节的机制知之甚少。

在研究皮肤成纤维细胞上的钾离子通道时，意外发现，现有技术中公认的抗衰老化合物白藜芦醇能够浓度依赖性地开放成纤维细胞钾离子通道。同时，早期的研究结果表明，白藜芦醇能够促进成纤维细胞增殖，显示其抗衰老功效，在加入钾离子通道特异性的阻断剂时，白藜芦醇不再促进成纤维细胞的增殖。因此得出结论，白藜芦醇促进成纤维细胞的增殖与钾离子通道的开放有关，即抗衰老作用与成纤维细胞钾离子通道的开放有关。发明人通过检测皮肤成纤维细胞的钾离子通道开放的方法，证实其与抗衰老功效的关系。采用本发明的方法来评价产品的抗衰老功效快速、准确、敏感、直观。该方法能够给大规模抗衰老功效原料筛选研究提供一项快速有效的评估手段。

因此，本发明首次提出皮肤成纤维细胞的钾离子通道的开放与该细胞增殖相关，从而为抗衰老机理研究提供了一个新的方向。

发明内容

以下给出一个或多个方面的简要概述以提供对这些方面的基本理解。此概述不是所有构想到的方面的详尽综览，并且既非旨在指认出所有方面的关键性或决定性要素亦非试图界定任何或所有方面的范围。其唯一的目的是要以简化形式给出一个或多个方面的一些概念以为稍后给出的更加详细的描述之序。

本发明以现有技术公认的抗衰老化合物白藜芦醇为样品，来验证本方法的可靠性、准确性、可重复性。

白藜芦醇(Resveratrol,3,4',5-三羟基芪)是多酚类化合物，主要来源于葡萄、虎杖、花生等植物。白藜芦醇目前已经成为一个公认的具有抗衰老功效的物质，1998年美国艾尔·敏德尔编撰《抗衰老圣典》时，将白藜芦醇列为“100种最热门有效抗衰老物质”之一。大量证据证明白藜芦醇的抗衰老作用，它不仅可抑制脂质过氧化，还能抑制人体低密度脂蛋白(LDL)的氧化，减少H₂O₂的产生，起到抗氧化、抗自由基的作用。科学家们还发现白藜芦醇可以通过调节控制衰老基因的表达和模仿卡路里限制(Caloric>

经本发明人研究发现，白藜芦醇能够促进成纤维细胞的增殖，而本领域众所周知的是，促进成纤维细胞增殖与抗衰老相关。本发明意外地发现，白藜芦醇促进成纤维细胞增殖的作用是通过开放细胞膜的钾离子通道而产生的。

因此，本发明提供了一种对受试样品的抗衰老功效进行评价的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在细胞培养液中培养成纤维细胞，得到包含成纤维细胞的培养液；

b)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到基线电流；

c)将受试样品加入步骤a)的培养液中；

d)采用膜片钳技术检测成纤维细胞的钾离子通道电流，得到加入受试样品之后的电流；

e)将步骤b)的检测结果与步骤d)的检测结果进行比较，与基线电流相比电流升高则判定所述样品具有抗衰老功效。

本发明所述基线电流即为实施例2-3中阴性对照组对应的皮肤成纤维细胞钾离子通道电流。

在一个实施方式中，所述受试样品可以是任何样品，包括：食品、药品和/或化妆品。

在一个具体的实施方式中，所述步骤e)中的电流升高包括与基线电流相比电流升高至少大于100％。在一个具体的实施方式中，所述步骤e)中的电流升高包括与基线电流相比电流升高至少200％。在一个具体的实施方式中，所述步骤e)中的电流升高包括与基线电流相比电流升高至少300％。在一个具体的实施方式中，所述步骤e)中的电流升高包括与基线电流相比电流升高至少500％。

另一方面，本发明还提供了一种对受试样品的抗衰老功效进行评价的装置，包括：

细胞培养模块，在细胞培养条件下对成纤维细胞进行培养；

钾离子通道电流检测模块，检测成纤维细胞的钾离子通道电流以及加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流；

计算比较模块，将成纤维细胞的钾离子通道电流和加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流的结果进行计算和比较，以此作为判定受试样品的抗衰老功效的指标。

在一个实施方式中，所述受试样品可以是任何样品，包括：食品、药品和/或化妆品。

在一个具体的实施方式中，所述计算比较模块的判定指标是加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流的升高。在一个具体的实施方式中，所述计算比较模块的判定指标是加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流比成纤维细胞的钾离子通道电流升高至少大于100％。在一个具体的实施方式中，所述计算比较模块的判定指标是加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流比成纤维细胞的钾离子通道电流升高至少200％。在一个具体的实施方式中，所述计算比较模块的判定指标是加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流比成纤维细胞的钾离子通道电流升高至少300％。在一个具体的实施方式中，所述计算比较模块的判定指标是加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流比成纤维细胞的钾离子通道电流升高至少500％。

本发明所述判定指标是加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流的升高，判断受试样品是否具有抗衰老功效，计算比较模块的判定指标是加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流比成纤维细胞的钾离子通道电流升高至少大于100％。

本发明提供一种新的抗衰老机理研究方向，通过检测皮肤成纤维细胞钾离子通道的开放从而判断添加剂的抗衰老功效。

附图说明

图1显示了在不同浓度下，白藜芦醇增强皮肤成纤维细胞线粒体活性的结果。

图2显示了白藜芦醇促进皮肤成纤维细胞增殖的显微照片(放大倍数200倍)。

图3显示了白藜芦醇促进皮肤成纤维细胞钾通道电流升高的结果。

图4显示了钾离子通道阻断剂IBTX阻断白藜芦醇引起的钾离子通道电流的升高的结果。

图5显示了阻断剂IBTX抑制白藜芦醇引起的成纤维细胞增殖的结果。

具体实施方式

发明人通过研究意外地发现，白藜芦醇等具有抗衰老功效的活性剂促进成纤维细胞的增殖的作用是通过开放细胞膜的钾离子通道而产生的。也就是说，本发明意外发现，现有技术中公认的抗衰老化合物白藜芦醇能够浓度依赖性地开放成纤维细胞钾离子通道，由此实现抗衰老的目的。

因此，本发明提供了一种快速、准确、敏感、直观评价产品是否具有抗衰老功效的方法。

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。

以下实施例中使用的XTT购自sigma公司；白藜芦醇购自sigma公司；成纤维细胞从上海中西医结合医院获得；阻断剂IBTX购自sigma公司；TTX购自sigma公司；酶标仪的型号为MK3，购自Thermo Labsystems公司；显微镜的型号为OLYMPUS IX50，购自奥林巴斯公司；全细胞膜片钳记录放大器的型号为Axopatch 200B amplifier，购自Axopatch公司；手动转换器的型号为MSC-200，购自Bio-Logic-Science Instruments公司。

实施例1：白藜芦醇促进皮肤成纤维细胞增殖

一、实验原理

3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)是一种新合成的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲臜产物，当XTT与电子偶合剂共同使用时，甲臜的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。XTT法通过比色测定即可推算出活细胞数量，以酶联免疫检测仪测定其光密度，与对照组比较可得到实验组的增殖率，从而判断受试样品的细胞增殖效果。

二、实验方法

1、成纤维细胞培养及药物处理

将真皮成纤维细胞(fibroblast)接种于含DMEM培养液的培养瓶中，置于37℃、CO₂(CO₂体积分数为5％)恒温培养箱中培养5天。将细胞培养瓶取出，用胰蛋白酶消化，然后将细胞接种于96孔板，孵育24小时，对照组每孔加200μL细胞培养液，加药组每孔加200μL白藜芦醇，白藜芦醇的浓度采用2、10、20μM三个不同的浓度梯度，加药后培养箱中培养。48小时后进行第二次加样，每孔加入200μL溶液，方法同上，孵育72h后用作细胞增殖检测。

2、XTT法检测

加药处理结束后，配制质量浓度为0.2g·L-1 XTT水溶液及5mmol·L-1的PMS水溶液，PMS水溶液与XTT水溶液以体积比1:1000混合，将96孔板中的细胞培养液移除，每孔加入125μL XTT及PMS的混合液，于37℃细胞培养箱孵育2h；使用酶标仪在450nm处测定吸光度，吸光度越高，表明细胞线粒体活性越高。

三、实验结果

1、白藜芦醇增强皮肤成纤维细胞线粒体活性

如图1所示，XTT检测结果表明，白藜芦醇在浓度为10μM及20μM时能够促进皮肤成纤维细胞的线粒体活性，即促进成纤维细胞的增殖。实验结果显示，白藜芦醇可以促进成纤维细胞的增殖(与对照相比，其结果具有显著差异，*P<0.05)。

2、白藜芦醇促进成纤维细胞增殖

如图2所示，白藜芦醇能够促进成纤维细胞增殖。

实验结果显示，加药处理72h后，将96孔板直接在倒置显微镜下拍照，显微镜放大倍数为200倍。从图中可以明显看出，白藜芦醇在浓度为10μM时能够显著促进成纤维细胞的增殖，与阴性对照组相比，细胞数量明显增加。即白藜芦醇能够促进皮肤成纤维细胞的增殖，而成纤维细胞增殖能够证明白藜芦醇的抗衰老功效。

实施例2：皮肤成纤维细胞钾离子通道检测

一、膜片钳技术原理

膜片钳技术是在电压钳基础上发展而来的，它是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一(或多个)离子通道的分子活动，可以检测到1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率，为从细胞分子水平研究生物膜信息提供了直接手段。全细胞模式膜片钳是经热抛光的微管电极置于清洁，光滑的细胞膜表面形成高阻封接，在细胞膜表面吸出一小片膜，继续以负压抽吸，使电极管内细胞膜破裂，胞内液与电极内液直接相通而得到。此方式既可记录膜电流又可记录膜电位。全细胞记录的电流为整个细胞膜上所有离子通道电活动的总和。这种记录方式的优点在于能保持细胞及其反应性的完整性。全细胞记录可以在细胞水平上观察受药物的作用后细胞电活动的总体反应特点。

二、实验方法

1、成纤维细胞培养

同实施例1

2、全细胞膜片钳记录

取出培养好的人皮肤成纤维细胞，用膜片钳技术全细胞记录模式记录成纤维细胞钾离子电流。电流记录用Axopatch 200B amplifier和pClamp软件，钾离子电流的记录，培养基由细胞外液所取代。

1)细胞外液配制：含有140mM NaCl,2.5mM KCl,10mM HEPES,1mM>2,1mM>2以及0.001mM>

2)细胞外液pH值：用NaOH调节pH值至7.4

3)细胞内液配制：玻璃电极内充满了内液，其中含有135mM葡萄糖酸钾,10mM KCl,10mM HEPES,1mM>2及2mM>2。电极注入内液的阻值为5～7MΩ。

4)细胞内液pH值：用KOH将pH调至7.3

5)白藜芦醇溶液配制：将白藜芦醇分别配成浓度为1、5、10、50及100μM溶液

6)细胞在记录前将培养液更换为细胞外液

7)根据需要用白藜芦醇灌流液持续灌流

8)灌冲钾电流记录内液后，电极阻值为5～8MΩ

9)胞外用手动转换器(MSC-200Manual Solution Changer)重力给药，持续时间为60～90秒，流速为50μl/分钟

所有的记录都是在室温下进行(23～25℃)。

3、数据采集与分析

计算机连接到录音设备与digidata1440a模数接口使用。数字采样的电流未100μs(10kHz)。电流信号通过一个3-kHz三极贝塞尔滤波器过滤。电流纠正在线泄漏和剩余电容瞬态与磷/4协议。数据采集和分析是用pClamp10.2软件(Axon Instruments,Foster City,CA,USA)和Origin 8.0(Microcalanalysis software,Northampton,MA,USA)。统计分析采用t-检验检测不成对或成对的相关性比较。测试值用均值±S.E.M的方式表达，用n代表检测的细胞数量。P<0.05用来表示统计群体之间有显著性差异。多组间比较采用单向方差分析单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)检测。

三、实验结果

1、白藜芦醇能够促进皮肤成纤维细胞钙激活钾离子通道电流升高

如图3所示，白藜芦醇能够促进皮肤成纤维细胞钾离子通道电流。

实验结果显示，给药浓度从1至100μM白藜芦醇，电流幅度明显增加出现在10μM。当白藜芦醇浓度为10、50及100μM与阴性对照相比具有显著性差异(*P<0.05)。即，白藜芦醇与基线电流(阴性对照所对应的钾离子电流)相比，能够显著性引起皮肤成纤维细胞钾离子通道电流的升高(*p<0.05)。

实施例3钾离子通道阻断剂对皮肤成纤维细胞钾离子通道的影响检测

一、膜片钳技术原理

同实施例2

二、实验方法

1、成纤维细胞培养

同实施例1

2、全细胞膜片钳记录

取出培养好的人皮肤成纤维细胞，用膜片钳技术全细胞记录模式记录成纤维细胞钾离子电流。钾离子电流的记录，培养基由细胞外液所取代。

1)细胞外液配制：含有140mM NaCl,2.5mM KCl,10mM HEPES,1mM>2,1mM>2以及0.001mM>

2)细胞外液pH值：用NaOH调节pH值至7.4

3)细胞内液配制：玻璃电极内充满了内液，其中含有135mM葡萄糖酸钾,10mM KCl,10mM HEPES,1mM>2及2mM>2。电极注入内液的阻值为5～7MΩ。

4)细胞内液pH值：用KOH将pH调至7.3

5)阻断剂IBTX配制：100nM IBTX

6)细胞在记录前将培养液更换为细胞外液

7)根据需要用白藜芦醇及IBTX灌流液持续灌流

8)灌流钾电流记录内液后，电极阻值为5～8MΩ

9)胞外用手动转换器(MSC-200Manual Solution Changer)重力给药，持续时间为60～90秒，流速为50μl/分钟

所有的记录都是在室温下进行(23～25℃)。

2、数据采集与分析

同实施例2

三、实验结果

如图4所示，通过钾离子通道的特异性阻断剂IBTX对成纤维细胞进行干预，发现该阻断剂能够阻断白藜芦醇引起的细胞钾离子通道的开放，从而判断出该通道即为成纤维细胞上的钾离子通道。

实验结果显示，图4A表明，开始先在细胞外液中加入钾离子通道特异性阻断剂IBTX，检测钾离子通道电流，没有显著上升(图4A中标注1的部分)，再加入白藜芦醇同时检测钾离子通道电流发现，相比较阴性对照电流也不再升高(图4A标注2的部分)，之后将白藜芦醇去掉，也不再对钾离子通道电流大小产生任何影响(图4A标注3的部分)。图4B为直方图，为电流结果统计后，加入阻断剂IBTX不能引起细胞钾离子电流升高，该结果说明了阻断剂IBTX将钾离子通道阻断后，白藜芦醇不能引起通道开放，进一步验证了该通道为钾离子通道。即加入钾离子通道特异性阻断剂后白藜芦醇引起的升高的电流为钾离子通道电流。

实施例4：钾离子通道阻断剂对成纤维细胞增殖影响的检测

一、实验原理

同实施例1

二、实验方法

1、细胞培养及药物处理

将真皮成纤维细胞(fibroblast)接种于含DMEM培养液的培养瓶中，置于37℃、CO₂(CO₂体积分数为5％)恒温培养箱中培养5天。将细胞培养瓶取出，用胰蛋白酶消化，然后将细胞接种于96孔板，孵育24小时，对照组每孔加200μL细胞培养液，加药组每孔加200μL不同质量浓度白藜芦醇，以及白藜芦醇+钾离子通道阻断剂IBTX，于培养箱中培养。48小时后进行第二次加样，每孔加入200μL溶液，方法同上，孵育72h后用作细胞增殖检测。

2、XTT检测

同实施例1

三、实验结果

1、钾离子通道阻断剂IBTX抑制白藜芦醇引起的成纤维细胞增殖

如图5所示，仅10μM白藜芦醇加入时，能够引起成纤维细胞的增殖，而同时加入钾离子通道特异性阻断剂IBTX，且浓度达到20nM时，成纤维细胞没有增殖效果。

实验结果显示，白藜芦醇单独存在时可以促进成纤维细胞增殖(与阴性对照相比，其结果具有显著差异，*P<0.05。)在细胞中加入钾离子通道阻断剂IBTX同时孵育，当IBTX达到一定浓度(20nM)后白藜芦醇则不能引起成纤维细胞的增殖(P>0.05)，这说明钾离子通道阻断剂IBTX能够抑制白藜芦醇引起的成纤维细胞增殖，提示白藜芦醇促进成纤维细胞增殖的作用有可能通过它引起钾离子通道开放的作用。即加入了钾离子通道的特异性阻断剂后，白藜芦醇不能促进成纤维细胞增殖。

故，白藜芦醇能够引起皮肤成纤维细胞的增殖，验证其抗衰功效，并且抗衰老功效是通过显著性地提高(*p<0.05)成纤维细胞钾离子通道电流开放引起的。加入受试样品后成纤维细胞的钾离子通道电流比成纤维细胞的钾离子通道电流升高至少大于100％。