苹果砧木青砧1号母树的高效组培快繁方法

摘要

本发明属于植物栽培领域，具体涉及苹果砧木青砧1号母树的高效组培快繁方法，包括取材及外植体消毒处理；将经无菌处理的材料接种于启动培养基；选取启动培养基中生长一致的芽苗，接种至继代增殖培养基中；经继代增殖后，以远轴面接触培养基的方式分两行整齐排列于同一瓶中，暗培养处理上述接种叶片，处理结束后取出置于16/8h光下培养选取长势一致的无根组培苗，接种到生根培养基；将经过生根处理的组培苗移栽至栽培基质上进行移栽驯化。利用该方法最终移栽成活率达80％以上。

说明书

技术领域

本发明属于植物繁殖领域，具体涉及苹果砧木青砧1号母树的高效组培快繁体系的建立方法。

背景技术

优良的苹果砧木是苹果优质高产的基础。组培技术可有效降低苹果病害，短时间内供应大量优良苗木满足市场需求。苹果属植物组织培养技术较难，影响了组培苗在生产推广中的应用。组培苗高效离体再生与生根是组培快繁技术的关键步骤，能否生根以及生根好坏直接影响成苗。生长素的种类和浓度配比、无机盐浓度、光照等均为组培快繁的关键影响因素。苹果砧木青砧1号是青岛市农业科学研究院以平邑甜茶为母本，柱型苹果CO为父本进行杂交育成的苹果矮化砧木新品系。其无融合生殖种子饱满，发芽和出苗率高，实生繁殖的苗木粗壮、整齐一致，当年可以达到嫁接高度，2014年获得国家农业植物新品种保护权。虽然有关于青砧1号苹果砧木组培体系的报道，其采用青砧1号种子播种的实生苗叶片作为外植体，且离体再生体系尚未成熟，存在试管苗增殖系数低、生根培养根原基启动时间晚以及组培苗移栽成活率低等问题，本技术采用青砧1号母树当年新梢为外植体，有利于采种母树的大量快速繁殖，将有利于青砧1号种源的大量获得，促进其推广应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

苹果砧木青砧1号母树的高效组培快繁体系的建立方法，包括以下步骤：

(1)取材及外植体消毒处理：

每年4-6月份取材，剪取砧木当年萌发的健壮新梢15cm左右，剥去芽外部鳞片，洗衣粉液浸泡10分钟，流水冲洗干净，再用多菌灵800倍液浸泡15分钟，最后用无菌水冲洗干净备用；

将处理干净的材料放入烧杯中，在超净工作台上用体积浓度70％乙醇消毒30s，然后用质量浓度0.1％HgCl2溶液消毒处理，经HgCl2溶液消毒处理后，用无菌水冲洗4～5次；

(2)将经无菌处理的材料接种于启动培养基；

(3)选取启动培养基中生长一致的芽苗，接种至继代增殖培养基中；

(4)取步骤(3)中得到的生长一致的青砧1号组培苗，统一转接至同一批次继代增殖培养基中，20d后，取完全展开、颜色深绿的叶片，沿主脉垂直方向划伤叶片，保证不断开，以远轴面接触再生培养基的方式分两行整齐排列于同一瓶中；

(5)暗培养处理上述接种叶片，处理结束后取出置于16/8h光下培养

(6)经继代增殖后，选取长势一致的无根组培苗，接种到生根培养基；

(7)将经过生根处理的组培苗移栽至栽培基质上进行移栽驯化。

所述HgCl₂溶液消毒处理的时间为8min。

其中所述的启动培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L。

其中所述的继代增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L。

其中所述的再生培养基为MS+TDZ2.0mg/L+IBA0.3mg/L。

其中所述的暗培养处理为3d。

其中所述的生根培养基为1/4MS+IBA0.5mg/L+2％蔗糖。

其中所述的栽培基质为质量比草炭∶蛭石∶珍珠岩＝2∶1∶1的混合物。

其中步骤(2)-(4)、(6)的培养条件以MS为基本培养基，添加蔗糖、琼脂，PH值调整为5.8，培养温度为25℃，光照强度为20001x，光照时间为16h/d。

本发明的有益效果是：本发明首次深入研究了苹果砧木青砧1号母树的高效组培快繁体系，首次提供了一整套完整的适合于青砧1号母树的组培体系，通过系统研究和试验，创造性地确定出最合适的组培条件，相对于现有技术，极大地提高了增殖系数、生根系数和移栽成活率，为转基因技术的应用打下良好的前期基础，有利于青砧1号种源的大量获得，促进其推广应用。

附图说明

图1是本发明外植体的图；

图2是继代增殖培养的图；

图3为叶片远轴面或近轴面接触培养基对叶片不定芽再生数的影响图；

图4为是本发明暗处理不同时间后的图；

图5是生根培养的图；

图6是移栽成活单株的图。

具体实施方式

下面更详细地描述本发明的具体实施例。应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例：

1材料与方法

1.1供试材料

试验材料为青岛市农业科学研究院自主选育的苹果矮化砧木青砧1号母树。

1.2试验方法

1.2.1培养条件

以MS为基本培养基，添加蔗糖、琼脂，PH值调整为5.8，培养温度为25℃，光照强度为20001x，光照时间为16h/d。

1.2.2取材时间及外植体消毒处理

2016年4月28日，5月9日，6月2日，分别取材，剪取砧木当年萌发的健壮新梢15cm左右，剥去芽外部鳞片，洗衣粉浸泡10分钟，流水冲洗干净，再用多菌灵800倍液浸泡15分钟，最后用无菌水冲洗干净备用。

将处理干净的材料放入烧杯中，在超净工作台上用70％乙醇消毒30s，然后用0.1％Hg Cl₂溶液消毒处理。以4月28日取的青砧1号砧木筛选适宜的HgCl₂溶液消毒处理时间，共设6min、8min和10min共3个处理。试材经HgCl₂溶液消毒处理后，用无菌水冲洗4～5次，接种于不同的启动培养基上。一周后统计污染率，20d后统计成活率。对于灭菌处理后褐化严重的砧木材料，统计褐化率，并每隔1d更换一次培养基。

由表1可以看出，苹果砧木青砧1号用0.1％HgCl₂消毒6min的茎段的污染率最高，达53.3％，而消毒8min和10min的污染率均不足20％。消毒8min的成活率为63.3％，高于消毒10min的成活率(53.3％)。升汞消毒时间与外植体的污染率和成活率存在一个此消彼长的过程，消毒时间短，污染率必然高，消毒时间长，成活率势必受到影响，再者，消毒时间与处理效果也会因材料的基因型、材料的类型而不同，因此，综合污染率与成活率，将8min>2确定为本试验中所涉及苹果砧木材料较适宜的消毒时间。

表1、Hg Cl₂消毒处理时间对外植体成活率的影响

1.2.3茎段萌芽诱导

萌芽启动培养基以Ms为基本培养基(附加蔗糖30g.L^-1，琼脂6g.L^-1)，NAA浓度为0.01mg.L^-1，6-BA浓度设0.5、1.0、1.5和2.0mg.L^-14个处理，编号依次为NY1、NY2、NY3、NY4，pH值为5.8。材料经无菌处理接种至上述萌芽启动培养基，每个处理5瓶，每瓶接种6株。接种25d后，统计诱导率。

诱导率＝萌芽外植体数/接种外植体数×100％。

青砧1号母树茎段接种四种启动培养基，其上萌芽诱导率差异明显，最高为NY2，萌芽诱导率高达70％。在NY2培养基上培养20d时茎段萌发出的新芽可达3、4片新叶且生长旺盛(如图1所示)。其次为NY1和NY3，萌芽率分别为50％和46.7％，NY4培养基上的诱导率最低仅为23.3％(如表2)。

表2.启动培养基对茎段萌芽诱导的影响

1.2.4继代增殖培养

继代增殖培养基以Ms为基本培养基(附加蔗糖30g·L-1和琼脂8g·L-1)，6-BA浓度分别为0.5、1.0、1.5和2.0mg·L^-1，NAA浓度分别为0.05mg·L^-1，培养基编号依次为zzh1、zzh2、zzh3和zzh4，以现有技术中中常用的ck：MS+1.0mg·L^-1>-1>-1蔗糖为增殖培养基对照，选取启动培养基中生长一致的芽苗，分别接种至上述培养基中。每瓶接种4株，每处理接种5瓶。接种30d后，调查增殖芽的生长状况，统计增殖倍数。

增殖倍数＝增殖芽数/接种芽数×100％。

在四种增殖培养基上，青砧1号组培苗的增殖倍数与生长状况差异明显，如表3，zzh2上增殖倍数最高达4.28，植株叶片生长正常，丛生芽较多，分化最多的一株其上丛生芽数可达8，而对照培养基ck上的增殖倍数仅为2.7，其上植株叶片生长正常，丛生芽较zzh2少。其次为zzh1和zzh3，其上增殖倍数约为2，分化出的丛生芽较少且开始有玻璃化苗出现，而zzh4的增殖倍数最低，虽然其上有大量增殖芽，但大多不能正常生长，玻璃化严重。如图2，为正常增殖的青砧1号组培苗。

表3.青砧1号组培苗在四种增殖培养基上的生长状况

1.2.5叶片离体再生培养

叶片离体再生培养基以Ms为基本培养基(附加蔗糖30g·L-1和琼脂8g·L-1)，TDZ浓度分别为0.5、2.0和5.0mg·L^-1，IBA浓度分别为0.3mg·L^-1，培养基编号依次为A1、A2和A3，以现有技术已用配方为CK：MS+5.0mg·L^-1>-1>-1蔗糖，选取继代增殖培养基中生长一致的芽苗(20d)，取完全展开、颜色深绿的叶片，沿主脉垂直方向划伤叶片(不断开)，以远轴面接触上述不同再生培养基，每瓶接种8片叶子，每处理接种5瓶。20d后统计叶片再生不定芽数和生长情况。

再生率＝再生叶片数/接种叶片数×100％。

再生系数＝再生芽数/接种叶片数。

在四种叶片再生培养基中，青砧1号叶片再生情况差异显著，如表4，A2培养基上的叶片不定芽再生效率和再生系数均最高，与CK相比达到显著水平；A1培养基上的叶片再生效率和再生系数高于CK，差异不显著，再生缓慢；A3培养基上的叶片再生率和再生系数均高于CK，但再生不定芽有畸形和生长缓慢的现象。A2培养基再生快速、不定芽生长正常、再生率和再生系数高，显著优于CK及其他配方。

表4激素种类和浓度对青砧1号叶片不定芽再生的影响

1.2.6暗培养时间和接种方式对叶片再生的影响

取生长一致的青砧1号组培苗，统一转接至同一批次继代增殖培养基中。20d后，取完全展开、颜色深绿的叶片，沿主脉垂直方向划伤叶片(不断开)，以远轴面或近轴面接触再生培养基(A2)的方式分两行整齐排列于同一瓶中，远轴面和近轴面接触培养基的叶片各4片。同时，以不同暗培养时间0d、3d、7d、14d处理以上接种叶片，每个处理3瓶，取出后置于16h/d光下培养，20d后(含暗培养时间)观察叶片不定芽再生的情况，并统计再生不定芽数和生长情况。

以叶片远轴面或近轴面接触培养基均能够影响青砧1号的叶片不定芽再生数(图3)。尽管暗培养时间不同，叶片近轴面接触培养基的叶片不定芽再生数均低于叶片远轴面接触培养基的处理。如图3所示，叶片近轴面接触培养基时，脱分化形成愈伤组织的时间较叶片远轴面接触培养基的处理；但后期分化阶段生长较为缓慢。

如图4所示，不同暗培养时间对青砧1号的叶片不定芽再生有重要的影响。随着暗培养时间的延长，叶片不定芽再生数有先增高再降低的趋势。当暗培养时间为0或14d时，叶片不定芽再生数均最低，几乎为0；暗培养时间为3d时，叶片不定芽再生数最高，均值可达到12以上(远轴面接触培养基时)；暗培养时间为7d时，叶片不定芽再生数低于暗培养3d的处理。同时，随着暗培养时间的延长，叶片的颜色逐渐减淡，愈伤组织颜色由深红到乳白(图4).

1.2.7生根培养

选取长势一致的无根组培苗，分别接种到不同生根培养基，sg1：1/2MS+IBA 0.6mg/L+1.5％蔗糖；sg2：1/2MS+IBA 0.6mg/L；sg3：1/2MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.3mg/L；sg4：1/2MS+NAA 0.1mg/L；sg5：1/4MS+IBA 0.5mg/L+2％蔗糖；sg6：1/4MS+IBA 0.5mg/L+3％蔗糖；sg7：1/2MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L，基本培养基为Ms(附加蔗糖30g·L-1，琼脂8g·L^-1)，同时以ck：1/2MS+1.0mg·L^-1>-1蔗糖为生根培养基对照，每个处理18株，重复3次，接种20d后统计生根率、生根数和生根长度。

生根率＝诱导生根茎段数/接种茎段数×100％。

以1/2MS和1/4MS培养基为基础附加不同浓度的NAA和IBA，7种诱导生根培养基对青砧1号组培苗的生根诱导效果不同，由表4可以看出，1/4MS培养基附加2％的蔗糖(sg5)对于青砧1号的生根诱导效果最佳，培养一周左右，茎段基部开始膨大，10d时开始有白色根原基形成，室温条件下培养15天的生根率达100％。而在对照培养基ck上，虽然其上生根率也达100％，但30d后根原基才开始形成，50d后根系方可均匀分散分布。青砧1号在sg5上的生根启动时间明显早于对照ck和其他几种培养基，平均生根数为6.09，亦高于对照ck上的平均生根数5.7，且茎段基部的根系向四周生长健壮。其次为sg2和sg6，二者对青砧1号组培苗的生根诱导率均为72.1％，且平均生根数与根长亦相当。生根诱导效果最差的是sg1，其上平均生根率仅为20.7％。青砧1号组培苗的生根诱导培养基宜采用1/4MS+IBA 0.5mg/L+2％蔗糖(如表4所示)。图5为青砧1号组培苗在sg5培养基上的生根情况。

表4.七种培养基对青砧1号组培苗生根的影响

1.2.8移栽驯化

生根处理的组培苗移栽至栽培基质上进行移栽驯化。

青砧1号组培苗的温室移栽时间，春季以3月中上旬、秋季以10月中下旬为宜，其他时期温度过高或过低都不利于组培苗的成活。

青砧1号生根组培苗于温室内炼苗一周，清水洗去根部培养基，移栽至草炭∶蛭石∶珍珠岩＝2∶1∶1的栽培基质穴盘上，遮荫保湿10d左右，待新根新叶长出逐渐移去遮荫，成活率达80％以上。而在以珍珠岩、蛭石、草炭等体积混合的对照栽培基质中，20d后移栽成活率仅为60％。30d时将穴盘移栽成活的单株定植于大田(如图6)，并加强肥水、病虫害管理。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。