一种心欣舒胶囊的制备方法

摘要

本发明公开了一种心欣舒胶囊的制备方法，该方法将黄芪、地黄、五味子、丹参、赤芍、桂枝和人参总皂苷，经拣选、净制后提取，提取后的稠膏采用真空干燥，粉碎成细粉，加入人参茎叶总皂苷的细粉和淀粉适量，一步制粒，过筛，胶囊填充，制成1000粒，铝塑包装，即得。经主要有效成分含量测定及药效评价，证实通过上述方法制备的心欣舒胶囊，可以提高有效成分含量，降低产品服用量，同时提升产品疗效。

说明书

技术领域

本发明属于中成药的制备，涉及一种中成药的制备工艺，特别涉及一种对现有的药物心欣舒胶囊(国药准字Z20025709)采用有机溶剂提取制备的方法。

背景技术

随着社会经济的发展，人民生活方式与生活模式的改变，心绞痛冠心病的患病率逐年增加，从机制上分析，冠心病心绞痛是冠状动脉供血不足，心肌暂时性严重缺血与缺氧所引起的临床综合症。中医认为“风为百病之长”、“肺朝百脉”、外邪侵犯人体，从而引发一系列疾病。冠心病心绞痛乃本虚标实之证，本虚是气血阴阳的不足，其中气阴两虚是重要的环节，标实以气滞血瘀痰浊为主。

心欣舒胶囊(国药准字Z20025709)组分为黄芪、地黄、五味子、丹参、赤芍、桂枝和人参茎叶总皂苷；具有益气活血，滋阴荣心的功效，常用于气阴两虚所致的胸痹、心悸以及冠心病，心绞痛，心肌炎属上述症候者。其中主要成分黄芪、地黄等可增强红细胞免疫功能，清除沉积在心肌的循环免疫复合物，减少心肌损伤；可提高NK细胞活性，抑制病毒复制；有抗氧化及改善心功能作用。可扩张冠状动脉，改善血流循环，减少心肌耗氧量，且对心肌缺血损伤有保护作用，并且抗血小板和红细胞聚集等作用。

心欣舒胶囊原工艺是在中医药理论指导下，以中药材为原料，按照规定的处方、生产工艺和质量标准生产的制剂，是一个传统的中成药胶囊制剂工艺。心欣舒胶囊的原工艺如下：取赤芍处方量1/3粉碎成细粉，备用；丹参及剩余赤芍加乙醇回流提取1小时，动态回流提取2.5小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至稠膏，在60℃下，测量稠膏相对密度为1.2～1.3，真空干燥，粉碎成细粉，备用；醇提药渣与其余黄芪等四味，加水煎煮1小时，动态回流提取2小时，滤过，滤液减压浓缩至稠膏，在60℃下，测量稠膏相对密度为1.2～1.3，加入赤芍细粉，搅匀，真空干燥，粉碎成细粉，备用。人参茎叶总皂苷与上述两细粉混合均匀，加适量淀粉，于喷雾干燥制粒机内进行制粒，装入胶囊，制成1000粒，即得。

原工艺中的赤芍部分粉碎入药，不利于有效成分吸收，且制粒过程中对浸膏粉(包括原药材粉末)粒度和均匀度的要求较高，直接粉碎易造成分布不均及浸膏粉与原药材粉末的比重差异，这些均会增加制粒过程的难度。

经研究发现，原提取工艺不能保证有效成分的充分提取，转移率较低，进而导致药材用量的增加，同时不利于资源的合理利用，因此，需要对心欣舒胶囊组方中各药材进行充分研究，根据各个药材有效成分的性质探索一种新的制备方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于，提供一种新的心欣舒胶囊的制备方法，并考察其对有效成分含量及药效的影响。

一种心欣舒胶囊的制备方法，由以下各质量份的原料药按以下方法制成：黄芪50～65质量份，地黄30～45质量份，五味子13～25质量份，丹参13～25质量份，赤芍30～45质量份，桂枝13～25质量份，人参总皂苷0.5～1.5质量份；

步骤一：所述丹参用95％乙醇回流提取二次；合并提取液，滤过，滤液在-0.04Mpa，70℃下减压回收乙醇至无醇味，滤取沉淀，干燥，粉碎成细粉A，滤液备用；

步骤二：所述丹参95％乙醇提取药渣用60％乙醇回流提取二次，合并提取液，滤过，滤液在-0.04Mpa，70℃下减压回收乙醇并浓缩至稠膏，在60℃下，测量稠膏相对密度为1.2～1.3，与上述步骤一中的备有滤液合并，混匀，真空干燥成细粉B；

步骤三：所述赤芍用60％乙醇回流提取二次，合并提取液，滤过，滤液在-0.04Mpa，70℃下减压回收乙醇并浓缩至稠膏，在60℃下，测量稠膏相对密度为1.1～1.15，稠膏在-0.04Mpa，70℃下减压干燥，粉碎成细粉C，备用；

步骤四：所述黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材混合，用65％乙醇回流提取二次，合并提取液，滤过，滤液在-0.04Mpa，70℃下减压浓缩至稠膏，在60℃下，测量稠膏相对密度为1.08～1.12，静置72小时，滤过，沉淀，在-0.04Mpa，70℃下减压干燥、粉碎成细粉D；

步骤五：人参茎叶总皂苷与上述细粉A、B、C和D混合均匀，再加入辅料淀粉混匀，一步制粒，过筛，装入胶囊，制成1000粒，即得胶囊成品。

具体的，步骤一在丹参的二次回流提取中，第一次加入6倍量的乙醇提取1小时；第二次加入4倍量的乙醇提取1小时。

具体的，步骤二在对丹参药渣的二次回流提取中，第一次加8倍量的乙醇提取1小时；第二次加6倍量的乙醇提取1小时。

具体的，步骤三在对赤芍的二次回流提取中，第一次加入8倍量的乙醇提取2小时；第二次加入6倍量的乙醇提取2小时。

具体的，步骤四在对黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材混合的二次回流提取中，第一次加入8倍量的乙醇提取2小时；第二次加入6倍量的乙醇提取2小时。

具体的，步骤五中辅料淀粉的加入量占混合物总量的20％。

制粒后样品颗粒的休止角α为30°～35°。

具体的，步骤五中过筛目数为24目。

本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明采用分组提取工艺制备的心欣舒胶囊，可以富集有效成分，剔除部分无效物质，从而提升产品疗效。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图；

以下结合附图以及实验对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

通过查阅文献，对黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材的药物成分进行分析研究发现，水煎煮并不能完全提取出药材中的主要有效成分，尤其是其中的脂溶性成分，且蛋白质、淀粉、叶绿素等无效成分亦被提取出来，本发明选择醇提法提取四味药材，即以适宜浓度的乙醇提取药材成分，提取液回收乙醇后，静置一定时间，沉淀完全后滤除的方法。这样既可提取出生物碱及其盐、苷类、挥发油及有机酸类等有效成分，同时可避免淀粉、蛋白质、黏液质等成分的浸出；考虑到药材粉碎直接入药不利于有效成分吸收，因此，将原工艺的赤芍部分粉碎入药改为乙醇回流提取；丹参中主要药理活性成分既有脂溶性成分，又有水溶性成分，考虑将丹参高浓度乙醇提取后，丹参药渣再次进行低浓度乙醇提取，以保证其主要成分尽可能充分提取出来。

原工艺中丹参及赤芍药材乙醇提取后药渣同黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材混合加水煎煮提取，药材加水煎煮时，提取的成分比较复杂，不利于精制；此外含淀粉、粘液质、糖类成分较多的药材，加水煎煮后，其浸出液比较粘稠，过滤困难；其水提液浓缩消耗也大大高于醇提，且醇提时有效成分提取率也较高，故本发明中改为乙醇提取。原工艺中的赤芍部分粉碎入药，不利于有效成分吸收，且制粒过程中对浸膏粉(包括原药材粉末)粒度和均匀度的要求较高，直接粉碎易造成分布不均及浸膏粉与原药材粉末的比重差异，这些均会增加制粒过程的难度。通过原工艺与本发明新工艺的试验数据对比，发现本发明新工艺含量测定指标含量明显高于原工艺。

本发明公开了一种心欣舒胶囊制备方法，具体包括下列步骤：

1)组方：黄芪1000g，地黄600g，五味子300g，丹参300g，赤芍600g，桂枝300g，人参茎叶总皂苷16.7g；

2)将组方中黄芪、地黄等八味药材净选、净制后，分成三组进行。

①丹参用95％乙醇回流提取二次，第一次加6倍量乙醇，第二次加4倍量乙醇，每次各1小时，合并提取液，滤过，滤液在-0.04Mpa，70℃下减压回收乙醇至无醇味，滤取沉淀，干燥，粉碎成细粉A，滤液备用；丹参95％乙醇提取药渣用60％乙醇回流提取二次，第一次加8倍量乙醇，第二次加6倍量乙醇，每次各1小时，合并提取液，滤过，滤液在-0.04Mpa，70℃下减压回收乙醇，并浓缩至稠膏，在60℃下，测量稠膏相对密度为1.2～1.3，与上述滤液合并，混匀，真空干燥成细粉B；

②赤芍药材用60％乙醇回流提取二次，第一次加8倍量乙醇，第二次加6倍量乙醇，每次各2小时，合并提取液，滤过，滤液在-0.04Mpa，70℃下减压回收乙醇，并浓缩至稠膏，在60℃下，测量稠膏相对密度为1.1～1.15，稠膏在-0.04Mpa，70℃下减压干燥、粉碎成细粉C，备用；

③黄芪等四味药材，用65％乙醇回流提取二次，第一次加8倍量乙醇，第二次加6倍量乙醇，每次各2小时，合并提取液，滤过，滤液在-0.04Mpa，70℃下减压浓缩至稠膏，在60℃下，测量稠膏相对密度为1.08～1.12，静置72小时，滤过，沉淀，在-0.04Mpa，70℃下减压干燥、粉碎成细粉D；

3)合并上述细粉A、B、C和D，与人参茎叶总皂苷混匀，加适量辅料淀粉混匀，辅料淀粉的加入量占混合物总量的20％，一步制粒，过24目筛，装入胶囊，制成1000粒，即得。

根据心欣舒胶囊处方中药物有效成分的性质进行提取，并在各组药物中选择指标性成分采用高效液相色谱法进行含量测定，以保证临床疗效，同时，通过药理实验对该工艺制备的心欣舒胶囊进行药效评价。

一、心欣舒胶囊提取工艺研究

1、药物成分

黄芪：主要含有黄酮类、皂苷类和多糖等，其中黄酮类主要有黄酮、异黄酮、异黄烷和紫檀烷四大类，皂苷类化合物有黄芪皂苷及其大豆皂苷。另外尚含单糖、氨基酸、蛋白质、核黄素、叶酸、尼克酸、维生素D、驱油酸、亚麻酸、微量元素、香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、对羟苯基丙烯酸、咖啡酸、绿原酸、棕榈酸、β-谷甾醇、胡萝卜苷、羽扇豆醇，正十六醇等成分。

五味子：主要含有多种木脂素成分：五味子素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、戈米辛A等。另含有单萜类、含氧单萜类、倍半萜类、含氧倍半萜类和少量醇、原儿茶酸、奎尼酸、柠檬酸单甲酯、5-羟甲基-2-糠醛、2-甲基-5-异丙基-1，4-苯二酚-1-O-β-D-吡哺葡萄糖苷和胡萝氨基酸等化合物。

赤芍：主含芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药吉酮、芍药新苷，另含鞣质、挥发油、蛋白质等化学成分。

丹参：含脂溶性成分主要有丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、羟基丹参酮、丹参酸甲酯、丹参醌、次甲基丹参醌、紫丹参甲素、紫丹参乙素、丹参新酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参醇Ⅰ、丹参醇Ⅱ、丹参醇Ⅲ、羟基丹参酮ⅡA、降丹参酮、丹参酚、丹参醛等。含水溶性成分主要有丹参素、丹参酸甲、乙、丙、原儿茶酸、原儿茶醛等。

地黄：主要含为苷类、糖类及氨基酸，并以苷类为主，在苷类中又以环烯醚萜苷为主。目前已从地黄中分离出32种环烯醚萜苷类化合物，其中以梓醇含量最高，还含有地黄苷D、地黄苷A、麦角甾苷等。

桂枝：挥发油中其主要成分为桂皮醛，挥发油中尚含有苯甲醛、苯丙醛、反式桂皮醛、反式醋酸肉桂酷、匙叶按油烯醇、邻甲氧基桂皮醛等。除挥发油外，桂枝中还含有肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、1，4-二苯基-丁二酮、香豆素、β-谷甾醇、多聚体糖苷及多种二萜类化合物。3-苯基-2-丙烯醛和3-(2-甲氧苯基)-2-丙烯醛，此外还含有少量的酮、醇、酯、酚、饱和烷烃及苯系物类化合物。

人参茎叶总皂苷：主要成份有人参皂苷Rg1、Re、Rc、Rb2、Rd等。

2、根据心欣舒胶囊中药物有效成分及药理作用确定提取工艺的研究

2.1心欣舒药材正交实验

2.1.1丹参提取实验研究

根据工艺初步研究结果表明，丹参中既含脂溶性有效物质，又含有酚酸类有效成分，原工艺中采用醇、水结合方式提取。为了更多地提出丹参的主要有效成分，去除掉无效物质，因此，本实验采用不同浓度的乙醇提取工艺进行考察和验证研究，以期获得最佳的工艺参数。因此，按3/5处方量称取丹参81g，共9组，每组平行3份，采用正交实验设计进行乙醇的回流提取。选用正交表L₉(3⁴)安排实验，因素与水平表、验证结果分析表及方差分析表1～6。

表1 丹参高浓度乙醇提取实验因素水平表

表2 丹参高浓度乙醇提取药渣用低浓度乙醇提取实验因素水平表

表3 丹参高浓度乙醇提取正交实验设计及结果分析

表4 丹参高浓度乙醇提取优化工艺方差分析表

F_0.05(2,2)＝19>0.01(2,2)＝99

表5 丹参低浓度乙醇正交实验结果统计

表6 丹参低浓度乙醇提取优化工艺方差分析表

F_0.05(2,2)＝19>0.01(2,2)＝99

综合上述实验结果，结合生产实际，丹参最佳提取工艺为95％乙醇回流提取2次，第一次加入6倍量的乙醇提取1小时；第二次加入4倍量的乙醇提取1小时；对丹参药渣的二次回流提取中，用60％乙醇回流提取二次，第一次加8倍量的乙醇提取1小时；第二次加6倍量的乙醇提取1小时。

2.1.2赤芍乙醇提取实验研究

赤芍中主要有效成分为水溶性，但水提取杂质较多，原工艺中采用醇、水结合方式提取。为了更多地提出赤芍的主要有效成分，去除掉无效物质，因此，本实验采用不同浓度的乙醇提取工艺进行考察和验证研究，以期获得最佳的工艺参数。按1/3处方量称取赤芍120g，共9组，每组平行3份，采用正交实验设计进行乙醇的回流提取。选用正交表L₉(3⁴)安排实验，因素与水平表、验证结果分析表及方差分析表7～9。

表7 赤芍乙醇提取实验因素水平表

表8 赤芍乙醇提取正交实验设计及结果分析

表9 赤芍乙醇提取优化工艺方差分析表

F_0.05(2,2)＝19>0.01(2,2)＝99

实验结果显示:赤芍提取的最佳工艺为60％乙醇回流提取2次，第一次加入8倍量的乙醇提取2小时；第二次加入6倍量的乙醇提取2小时。

2.1.3对黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材醇提取实验研究

根据工艺初步研究及初步动物实验结果表明，药材中的有效成分主要溶解于乙醇中，因此，采用正交实验设计进行乙醇的回流提取优选。按1/15处方量称取黄芪40g、地黄24g、五味子12g、桂枝12g，共9组，每组平行3份，采用正交实验设计进行乙醇的回流提取。选用正交表L₉(3⁴)安排实验，因素与水平表、验证结果分析表及方差分析表10～12。

表10 黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材醇提取实验因素水平表

表11 黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材醇提取正交实验设计及结果分析

表12 黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材乙醇提取优化工艺方差分析表

F_0.05(2,2)＝19>0.01(2,2)＝99

实验结果显示:在对黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材混合的二次回流提取中，最佳工艺为第一次加入8倍量的乙醇提取2小时；第二次加入6倍量的乙醇提取2小时。

2.2心欣舒药材提取验证实验

2.2.1丹参乙醇提取验证实验

按1个处方量称取丹参180g，平行3份，随机编为1～3个处方，按正交试验优选的参数安排实验,乙醇提取，合并提取液，滤过，收集滤液，各取适量进行丹参酮IIA成分含量测定，收干膏量测定，统计。实验结果如表13。

按1个原处方量称取丹参180g，平行3份，随机编为1～3个实验号，按高浓度乙醇提取优选的条件进行实验，收集药渣，再按低浓度乙醇提取优选的条件进行实验，收集提取液，各取适量进行丹酚酸B成分含量测定，收干膏量测定，统计。实验结果见表14。

表13 丹参高浓度乙醇提取验证实验结果

实验结果显示：丹参高浓度乙醇提取最佳工艺为95％乙醇回流提取2次，第一次加入6倍量的乙醇提取1小时；第二次加入4倍量的乙醇提取1小时。按此工艺提取基本稳定、可行。

表14 丹参高浓度乙醇提取药渣再用低浓度乙醇提取验证实验结果

实验结果显示：丹参高浓度乙醇提取药渣的乙醇提取最佳工艺为60％乙醇回流提取2次，第一次加入8倍量的乙醇提取1小时；第二次加入6倍量的乙醇提取1小时。按此工艺提取基本稳定、可行。

2.2.2赤芍乙醇提取验证实验

按1个处方量称取赤芍360g，平行3份，随机编为1～3个处方，按上述优选的参数安排实验，乙醇提取，合并提取液，滤过，收集滤液，各取适量进行芍药苷成分含量测定，收干膏量测定，统计。实验结果如表15。

表15 赤芍乙醇提取验证实验结果

实验结果显示：赤芍最佳工提取艺为60％乙醇回流提取2次，第一次加入8倍量的乙醇提取2小时；第二次加入6倍量的乙醇提取2小时。按此工艺提取基本稳定、可行。

2.2.3黄芪等药材乙醇提取验证实验

按0.4处方量称取黄芪240g、地黄144g、五味子72g、桂枝72g，各3份，随机编为1～3个处方，按上述优选的条件进行回流提取实验，收集提取液，测定干膏含量、五味子醇甲、毛蕊异黄酮成分的含量，统计。实验结果如表16。

表16 黄芪等药材醇提取验证结果统计表

实验结果显示：黄芪、地黄、五味子和桂枝四味药材混合的二次回流提取中最佳提取工艺为65％乙醇回流提取2次，第一次加入8倍量的乙醇提取2小时；第二次加入6倍量的乙醇提取2小时。按此工艺提取基本稳定、可行。

3、心欣舒胶囊制剂成型工艺研究

经过对药材提取工艺进行详尽的实验研究与考察，确定了丹参药材高浓度醇及低浓度醇提取、赤芍低浓度醇提取、黄芪等四味药材的乙醇提取最佳条件，为保证成品的质量，须对其制剂成型工艺进行试验研究。药材提取物在放置后会有一定的吸湿现象，因此，考虑加入适量的辅料以解决其吸潮和成品药的崩解等问题。

3.1辅料用量的选择

3.1.1一个处方药物收得量

丹参醇提取干膏总收率约26.95％，赤芍提取干膏总收率约25.64％，黄芪等四味药材醇提取的干膏收率约为6.14％，提取干膏粉总收量约221.86g。因出现轻度吸潮现象，仍加辅料淀粉以解决之。

3.1.2淀粉用量的选择

为了预防药品吸潮，同时又要考虑尽量缩小辅料用量，因此，对淀粉用量进行选择研究。于提取干膏粉中加入不同比例的淀粉，混匀，制粒，干燥后，置于25℃、RH80％条件下(硫酸铵饱和溶液)放置3天，分别取样，按烘干法(中国药典2015年版四部0832第二法)测定水分，以观察放置过程中的吸潮现象。结果见表17。

表17 药物颗粒吸湿现象的考察

结果表明：淀粉加入比例约为20％以上时，制得半成品颗粒在25℃、RH80％条件下(硫酸铵饱和溶液)放置3天，水分增加不明显，说明吸潮现象不明显。故辅料淀粉配比确定至少约为20％时为宜。

3.2颗粒流动性考察

流动性是颗粒的重要性质之一，其决定了胶囊剂分装时剂量的准确性。因此，我们对药物颗粒的流动性进行考察。随机取3份颗粒放在固定漏斗中，使之自然从漏斗中流出，直到漏斗下形成的圆锥体尖接触漏斗中为止，测量锥高为h，底部半径为r，按tanα＝h/r计算，α即为休止角，结果见表18。

表18 颗粒流动性考察

休止角大小可以间接反映出粉粒的流动性大小，休止角越大，流动性越差，休止角越小，流动性越好。一般认为休止角小于30°者流动性最好，大于40°者流动性差，上表数据表明，制粒后样品的休止角30°<α°<35°，说明本品颗粒具有较好的流动性。

4、心欣舒胶囊含量对比研究

4.1心欣舒胶囊芍药苷含量测定方法

照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版第四部通则0104)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(12：88)为流动相；检测波长为230mn；理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每lml中含80μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品装量差异项下内容物，研细，混匀，取约0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30分钟(250W，25kHz)，放冷，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，离心(3000转/分)，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

4.2心欣舒胶囊丹酚酸B含量测定方法

按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版第四部通则0104)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-磷酸(25：74.2：0.8)为流动相；检测波长为286mn；理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每lml中含0.2mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品装量差异项下内容物，研细，混匀，取约0.3g，精密称定，置50ml量瓶中，加60％甲醇适量，超声处理30分钟(250W，25kHz)，放冷，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

4.3心欣舒胶囊含量测定

分别对三批新工艺、原工艺心欣舒胶囊进行含量测定，结果见表19。

表19 心欣舒胶囊含量测定结果

实验结果显示：新工艺心欣舒胶囊的含测指标芍药苷、丹酚酸B的含量明显高于原工艺心欣舒胶囊，达到了提高含量，降低服用量的目的。每日服用量(以药材量计)降低了约40％。

二、心欣舒胶囊药效试验研究

(一)心肌梗死药效实验研究

1材料

1.1实验动物

健康SPF级8周龄SD大鼠，120只，雄性，体重200～250g，由西安交通大学实验动物中心提供。

1.2药物与试剂

药物：心欣舒胶囊由黄芪、地黄、五味子、赤芍等7味中药组成，由陕西东科制药有限责任公司提供；麝香保心丸(上海和黄药业)；肝素钠注射液(上海第一生化药业有限公司)；贝复济(珠海亿胜生物制药有限公司)。

试剂：VEGF，bFGF，VIII因子试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)

2实验方法

2.1动物造模

大鼠用乙醚麻醉，在左胸第4～5肋骨间作横切口，从左侧第4肋间钝性分离打开胸腔，轻轻挤压胸腔，暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1～2mm处用无创性缝线结扎左侧冠状动脉，然后逐层缝合胸壁，以结扎部位以下心肌变白搏动减弱且心电图出现ST段弓背向上明显抬高为造模成功。造模当天始每天肌注青霉素1次(20万u)，共3d。

2.2分组及给药

130只大鼠(心肌梗死模型死亡率约40％)，共分6组：心欣舒胶囊原工艺组小剂量组(1组)、心欣舒胶囊原工艺组大剂量组(2组)、心欣舒胶囊新工艺组小剂量组(3组)、心欣舒胶囊新工艺组大剂量组(4组)、阳性对照组(贝复剂肝素组，5组)，阳性对照组(中药麝香保心丸组，6组)，模型组(7组)、假手术对照组(8组)，每组8～12只，分别按下述方法给药。1、2、3、4组在心梗造模后始每天予心欣舒0.625g·kg^-1，1.25g·kg^-1，0.312g·kg^-1，，0.625g·kg^-1(加入生理盐水制成2mL悬浊液)灌胃给药，持续4周。5组开胸结扎冠脉后当时立即结扎处周围予贝复济喷洒1揿(125AU)，术后始皮下注射肝素1250U·kg^-1共5天。6组中药麝香保心丸组(0.03g·kg^-1)每天灌胃，共4周。7组在心梗造模后始每天生理盐水2mL灌胃，共4周。8组在开胸后不结扎冠脉，而仅在相应部位用无创缝针空穿1次即缝合胸壁。4周后处死动物，取出心脏，将心脏短轴水平横切，在梗死边缘区切取组织标本，放入15％福尔马林固定。

2.3检测指标及方法

2.3.1心肌梗塞面积检测

固定后的心脏经常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色，Mallory‘s染色，光镜下观察心肌坏死情况及胶原形成。用细胞图像分析系统在10倍物镜显微镜下进行测试，分别检测心肌梗死面积和心室面积，梗塞面积用心肌梗死面积/总面积×100％表示。

2.3.2梗塞边缘区心肌血管面密度检测

心肌组织VIII因子免疫组化染色后的切片，经细胞图像分析系统处理，测量左室梗塞边缘区显示有VIII因子阳性染色的血管(×100)数目，微血管密度(MVD)计数参照Weidner法，先用20倍光镜扫视整个切片，选择梗死区周围5个血管密度最高的区域作为“热点”。再在200倍光镜视野下计数热点区染成棕黄色的血管数目，相互分离的内皮细胞、内皮细胞簇、内皮细胞条索均按1个血管计数，不考虑管腔或有无红细胞存在，管腔内径大于20μm或有较厚肌层(3层以上)的血管则不予计数。每份标本均选5个高倍视野(200×)计数微血管数目，取计数的平均值为该份标本的平均微血管数(MMVC)，以MMVC/mm²表示MVD(200×/高倍视野等于0.0426mm²)。

2.3.3梗塞边缘区VEGF，bFGF及VIII因子的表达量

心肌组织常规脱水、透明、包埋和切片(厚度4)，按标准技术进行免疫组化切片染色操作。染色后切片在细胞图像分析系统中用免疫组化定量软件进行VEGF，bFGF及VIII因子的定量分析。每张切片在梗塞边缘区左室心肌组织采样测量3处，计算阳性区域所占总面积。

2.4统计学处理方法

采用SPSS13.0软件统计，方差分析。

3结果

3.1心欣舒对心肌梗死区梗死范围的影响

HE染色可见在心肌梗死大鼠左心室可见到一定范围的梗死区，镜下可见心肌纤维肿胀，横纹消失，伊红浓染，核溶解消失(呈片状或点状凝固性坏死)，心肌细胞原纤维及部分心肌核溶解消失(液化性肌溶解)，可见有轻度炎性细胞浸润，缺血区心肌纤维溶解并断裂，有心肌纤维化形成，梗死区内外两侧尚有部分存活心肌。Mallorya’s染色可见心肌胶原形成增加。各分组对心肌梗死范围的影响见表20。

表20 心欣舒对心肌梗死大鼠左室梗死面积的影响

a与模型组比较；b与贝复济肝素组比较；c与心欣舒胶囊原工艺组小剂量组比较；e与心欣舒胶囊原工艺组大剂量组比较；f与心欣舒胶囊新工艺组小剂量组比较，均P﹤0.05。d与心欣舒胶囊原工艺组小剂量组比较，无显著性差异。

表20显示，与模型组比较，各给药组心肌梗死面积均有显著性差异(P﹤0.05)，说明心欣舒胶囊、阳性对照组梗死面积均明显低于模型组。另大剂量组与小剂量组比较有显著性差异(P﹤0.05)，说明心欣舒胶囊大、小剂量组有一定的剂量依赖性。心欣舒胶囊新工艺组大剂量组与心欣舒胶囊原工艺组大剂量组比较有显著性差异(P﹤0.05)，说明新工艺心欣舒胶囊在大、小剂量组均降低50％给药量情况下，针对心肌梗死效果较原工艺心欣舒胶囊依旧有显著性提升。

3.2梗塞边缘区心肌血管面密度检测

表21 心欣舒对心肌梗死边缘区血管面密度的影响

a与模型组比较；b与心欣舒胶囊原工艺组小剂量组比较；c与贝复济肝素组比较，均P﹤0.01。d与心欣舒胶囊原工艺组大剂量组比较，无显著性差异。e与心欣舒胶囊新工艺组小剂量组比较，P﹤0.05。

表21显示，与模型组比较，各给药组心肌梗死边缘区血管面密度明显增多(P﹤0.01)，心欣舒胶囊大、小剂量组比较亦有统计学差异(P﹤0.01)，心欣舒胶囊新工艺各剂量组与心欣舒胶囊原工艺各剂量组比较，有显著性差异(P﹤0.05)，说明新工艺心欣舒胶囊在大、小剂量组均降低50％给药量情况下，其增加梗死边缘区的血管面积密度作用较原工艺作用显著增加，且作用随药物剂量的增加有加强趋势。

3.3心肌梗死大鼠左室梗死边缘区VEGF，bFGF，VIII因子表达量

结果见表22。

表22 心欣舒对左室梗死边缘区VEGF，bFGF，VIII因子表达量的影响(μm²，)

a与模型组比较P﹤0.01；b与心欣舒胶囊原工艺组小剂量组比较P﹤0.05；c与心欣舒胶囊原工艺组大剂量组比较P﹤0.05；d与心欣舒胶囊新工艺组小剂量组比较，P﹤0.05。

表22显示，与模型组比较，各给药组心肌梗死边缘区VEGF，bFGF，VIII因子表达量均明显增多(P﹤0.01)，心欣舒胶囊大、小剂量组比较亦有统计学差异(P﹤0.05)，心欣舒胶囊新工艺各剂量组分别与心欣舒胶囊原工艺各剂量组比较，均有显著性差异(P﹤0.05)。新工艺心欣舒胶囊在大、小剂量组均降低50％给药量情况下，其心肌梗死边缘区各因子表达量较原工艺均明显增多。

心欣舒胶囊可减少心肌梗死面积，能显著增加梗死边缘区的血管面密度，且能明显增加心肌梗死边缘区多种因子表达，提示心欣舒胶囊可能有促进心肌缺血区血管生成的作用，并通过此作用保护缺血心肌，从而减少心肌梗死面积。实验证明新工艺心欣舒胶囊在降低50％给药量前提下，治疗心肌梗死效果依旧优于原工艺，能达到降低服用量的目的，与药学部分降低40％服用量相对应。

(二)抗心肌缺血药效实验研究

1材料

1.1实验动物

健康SPF级8周龄SD大鼠，120只，雄性，体重200～250g，由西安交通大学实验动物中心提供。

1.2药物与试剂

药物：心欣舒胶囊胶由黄芪、地黄、五味子、赤芍等7味中药组成，由陕西东科制药有限责任公司提供；地奥心血康胶囊(成都地奥制药集团有限公司)。

试剂：硝基四氮唑蓝(NBT)，南京奥多福尼生物科技有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)检测试剂，上海执城生物科技有限公司；乙醚，天津市天力化学试剂有限公司。

2实验方法

2.1分组及给药

将120只大鼠(死亡率约40％)随机分为7组，(1)假手术蒸馏水对照组(2ml/100g)；(2)模型蒸馏水对照组(2ml/100g)；(3)模型+心欣舒胶囊原工艺组大剂量组(1.5g/kg)；(4)模型+心欣舒胶囊原工艺组小剂量组(0.38g/kg)；(5)模型+心欣舒胶囊新工艺组大剂量组(0.75g/kg)；(6)模型+心欣舒胶囊新工艺组小剂量组(0.19g/kg)(7)模型+地奥心血康胶囊组(0.054g/kg)，均采用灌胃给药，每日一次，灌胃容积为20ml/kg，连用3天。

2.2方法

实验时，将大鼠用乙醚麻醉，仰位固定，记录正常心电图(ECG)后，在无菌条件下切开左胸皮肤，于第四肋间隙钝性分离肌肉，挤出心脏，于距冠脉根部2～5mm处结扎冠脉前降枝。缝合伤口，用7.6万u青霉素静脉注射防止感染。假手术组，在相同部位放线不结扎冠脉。记录扎后15min时的ECG，术后次日开始给药，连续3日。末次给药后4小时，乙醚麻醉动物，记录ECG后，腹主动脉采血，用ACE型生化全自动分析仪，测定血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)水平。然后，开胸取出心脏，挤净残血，剪去周围大血管，称湿重，切成均匀厚度5片，置0.5％NBT溶液中，37℃水浴15min染色。切下未染区称湿重，计算心肌梗死区占心室重量的百分比。

2.3结果

试验结果见表23～表26。

表23 心欣舒胶囊对结扎冠脉大鼠心电图T波的影响

a与结扎前比较；b与模型水对照组比较，均P﹤0.01。c与心欣舒胶囊原工艺组大剂量组比较，P﹤0.05。d与心欣舒胶囊原工艺组小剂量组比较，无显著性差异。e与心欣舒胶囊新工艺组大剂量组比较，P﹤0.05。

表23显示，各组动物结扎冠脉后，其心电图T波明显抬高(P﹤0.01)。给药三天后，地奥心血康组与心欣舒胶囊各给药组心电图T波均明显降低(P﹤0.01)，结果有明显统计学差异。新工艺心欣舒胶囊降低50％给药量情况下，与原工艺比较，大剂量组有显著性差异。

表24 心欣舒胶囊对结扎冠脉大鼠心电图ST波的影响

a与结扎前比较，P﹤0.01；b与模型水对照组比较，P﹤0.05；c与心欣舒胶囊原工艺组大剂量组比较，无显著性差异。d与心欣舒胶囊原工艺组小剂量组比较，无显著性差异。e与心欣舒胶囊新工艺组大剂量组比较，无显著性差异。

表24显示，结扎冠脉后15min，大鼠心电图ST段明显抬高(P﹤0.01)，地奥心血康组与心欣舒胶囊各给药组均明显降低ST段值(P﹤0.05)，与表23同时说明，心欣舒胶囊在一定的剂量范围内具有抗心肌缺血作用。新工艺心欣舒胶囊降低50％给药量情况下，抗心肌缺血作用与原工艺比较，无显著性差异，均能明显降低ST波值。

表25 心欣舒胶囊对结扎冠脉大鼠心肌梗塞范围的影响

a与模型水对照组比较，P﹤0.01；b与模型水对照组比较，P﹤0.05；c与心欣舒胶囊原工艺组大剂量组比较，P﹤0.05；d与心欣舒胶囊原工艺组小剂量组比较，无显著性差异，e与心欣舒胶囊新工艺组大剂量组比较，P﹤0.05。

表25显示，与模型水对照组比较，地奥心血康组与心欣舒胶囊各给药组心肌梗死区明显减小(P﹤0.01，P﹤0.05)，说明心欣舒胶囊在一定剂量范围内有抗心肌梗塞作用。新工艺心欣舒胶囊降低50％给药量情况下，大剂量组抗心肌梗塞作用与原工艺比较，有显著提升。

表26 心欣舒胶囊对结扎冠脉大鼠心肌酶谱的影响

a与假手术组比较，P﹤0.01；b与模型水对照组比较，P﹤0.01；c与模型水对照组比较，P﹤0.05；d与心欣舒胶囊原工艺组大剂量组比较，P﹤0.05；e与心欣舒胶囊新工艺组大剂量组比较，P﹤0.05。

表26显示，模型水组的CK、LDH和α-HBDH的血清水平明显高于正常蒸馏水对照组(P﹤0.01)，心欣舒胶囊各给药组的CK、LDH和α-HBDH均低于模型蒸馏水对照组(P﹤0.01，P﹤0.05)，说明心欣舒胶囊在一定剂量范围内对缺血心肌酶谱有明显改善作用。新工艺心欣舒胶囊降低50％给药量情况下，其改善缺血心肌酶谱作用与原工艺比较，有显著提升。

心欣舒胶囊可明显降低结扎冠脉心肌缺血模型大鼠心电图T波和ST段抬高值，可明显减少心肌梗死范围，可明显改善心肌缺血大鼠的心肌酶谱，具有明显的抗心肌缺血作用。实验证明新工艺心欣舒胶囊在降低50％给药量前提下，其治疗心肌缺血效果依旧优于原工艺。