离子交换和硅胶柱层析法分离制备汉防己甲、乙素的方法

摘要

离子交换和硅胶柱层析法分离制备汉防己甲、乙素的方法。汉防己是防己科千金藤属植物粉防己的干燥块根，其有效成分为汉防己碱，其中主要有效成分为汉防己甲素和乙素，汉防己碱具有抗心肌缺血、抗心率失常、降压、抗炎、抗矽肺、抗癌及镇痛等作用。药用时，对其纯度要求达到99%以上，提取纯化为限制二者药用的重要原因。当前，提取纯化汉防己甲素和乙素工艺，大量运用到剧毒且昂贵的氯仿，以及强碱等，氯仿对人和环境均有很大的毒害作用，另外对放大生产的设备腐蚀性强。此外，样品纯度不高，工艺过程复杂。在此现状上，本发明开发了，运用离子交换树脂和C18键合硅胶柱层析法，快速分离纯化制得高纯度的汉防己甲素和乙素，同时公开了一种利用乙醇进行重结晶纯化汉防己甲素和乙素的方法。本制备工艺没有运用任何有毒试剂，柱层析填料可重复利用，所用乙醇可回收利用。

说明书

技术领域

本发明涉及的是从中药中分离制备有效成分的方法，属于中药领域。为一种利用离子交换树脂和反相C₁₈键合硅胶柱层析法同时快速制备汉防己甲素和汉防己乙素的方法。

背景技术

汉防己甲素是从中药防己中提取分离而出的一种生物碱。近年来的药理研究表明汉防己甲素具有抗心肌缺血、抗心率失常、降压、抗炎、抗矽肺、抗癌及镇痛等作用，目前以之为原料生产的注射液、粉针、片剂已广泛用于临床。但汉防己甲素作为药用时，尤其是作为注射液使用时，必须具有较高的纯度，一般要求达到99%以上，并且不能含有苯、氯仿等其它杂质，这就使得高纯度汉防己甲素原料非常紧俏，远远不能满足制剂生产需要。目前国内汉防己甲素提取工艺主要有两种：一种是冷苯法，其基本工艺过程是用乙醇为溶剂回流提取，提取液浓缩后加石灰沉淀，沉淀用苯冷浸提取，回收苯后，用乙醇重结晶，该方法使用的苯毒性极大，容易残留，对人体危害大，不能适应大生产，很难得出符合药用要求的汉防己甲素；另一种是氯仿萃取法，其基本工艺过程是用乙醇为溶剂回流提取，提取液浓缩后酸沉，酸液过滤后加氨水碱化，碱液加氯仿萃取，回收氯仿后用丙酮重结晶，该方法使用的氯仿成本高、毒性大、对设备的密封圈腐蚀大、容易泄漏，回收的氯仿很难处理，废液中的氯仿难分离，对环境污染大，生产的汉防己甲素含量低、颜色深、熔点低、成本高、有机残留严重。上述两种方法提取的汉防己甲素均用苯及氯仿为提取溶剂，并用丙酮进行重结晶，这样的提取方法均残留有毒性较大的有机溶剂，并且在提取过程中难以与汉防己乙素分离，从而影响了汉防己甲素的纯度。此外，目前国内外还未见不用苯及氯仿为溶剂的汉防己甲素提取方法，及不含苯及氯仿的汉防己甲素的报道。

发明内容

本发明提供了一种利用易实现产业化生产的离子交换树脂和反相C₁₈键合硅胶制备汉防己甲素和汉防己乙素的方法，此制备方法未使用苯及氯仿，并且同时制备出了高纯度汉防己甲素和汉防己乙素。

取适量防己药材，利用5-8倍体积的80-95%乙醇，回流提取5-8小时，调整pH值至1-7，滤过，取滤液加于阳离子交换树脂柱上，先以水洗脱除杂，再用乙醇洗脱，依次使用不同浓度的乙醇洗脱，最后用无水乙醇洗脱至无色，除去色素以及其他非离子状态等杂质；然后，首先以0.5-1.5 mol/L 的氨水和50%-70%乙醇洗脱，再以1.6-2.5 mol/L 的氨水和70%-100%乙醇洗脱，收集该部分洗脱液，经脱盐处理。浓缩得流浸膏，用50%乙醇混悬，上反相C18键合硅胶柱，利用70%-90%乙醇冲洗柱子，利用紫外检测器监测，监测波长为230nm，按照色谱峰进行接收，然后利用乙醇对得到粉防己甲素和粉防己乙素进行重结晶。重结晶一次，即可得到高纯度的产品。

上述工艺基于如下原理，首先，分离对象的碱性，汉防己甲素和汉防己乙素分子结构中均有两个处于叔胺状态的氮原子，碱性较强。其次，分离对象的亲脂性，汉防己甲素和汉防己乙素亲脂性较强，具有脂溶性生物碱的一般溶解性。再次，分离对象之间极性差异，由于两者分子结构中取代基的差异，前者为甲氧基，后者为酚羟基，故汉防己甲素的极性较小。

在上述工艺过程中，将提取液调至合适的pH值，使生物碱充分电离成为阳离子，而非碱性物质不被电离。提取液经过阳离子交换树脂柱后，生物碱离子与树脂柱上的氢离子发生离子交换，使得生物碱吸附于树脂柱上。这里提取液的pH值不宜过高或过低，如果过高，提取液呈中性或碱性，生物碱不能被电离，也就无法完成树脂上的交换过程；如果过低，提取液中的氢离子浓度太高，阻碍了树脂柱上的氢离子解离，同样不能顺利地完成树脂交换过程；因而，实验中发现调整提取液的pH值为1-7是比较合适的。以水洗脱树脂柱时，选择使用去离子水，以确保不引入新的离子干扰。在洗脱过程中，那些没有被树脂吸附的非碱性物质很容易被水洗脱下来，从而与被吸附在树脂柱上的生物碱离子分离开来。

阳离子的交换洗脱方法有如下几种，利用碱性溶剂洗脱，其原理为将生物碱离子转化为游离化合物，然后被有机溶剂洗脱下来；另外，利用高浓度的盐将吸附物从树脂上置换下来，阳离子会竞争性地与树脂相结合，从而将吸附在树脂柱上的生物碱离子交换下来。生物碱会在高浓度的盐溶液中析出来，因此需要往洗脱液中加适量的酸或醇，使交换下来的生物碱溶解。

本发明通过对多种离子交换树脂包括凝胶树脂和大孔树脂进行筛选，获得001×4和001×7阳离子交换树脂属于大孔树脂，具有永存的微孔，表面积大，交换速度快等优点。更有利于生物碱由树脂上被洗脱下来。

本发明使用碱性洗脱剂洗脱树脂上的生物碱，而在碱性环境下，生物碱多以游离态的形式存在，生物碱在水中的溶解度就会大大降低，导致洗脱效率降低。基于此，本发明筛选了不同浓度的乙醇作为助溶剂，以提高生物碱在洗脱剂中的溶解度，提高洗脱效率。同时一些杂质由于同树脂结合能力不同，而其在乙醇中溶解性较好，本发明设计了几种不同浓度乙醇和氨水进行洗脱，起到除杂作用，从而提高氨醇洗脱液中汉防己甲素和乙素的含量。

本发明的技术方案如下：

1、取防己1重量份粉碎成粗粉，加6-10重量份的80-95%乙醇进行热回流提取，提取液过滤，滤液减压浓缩至无醇味稠膏备用；

2、用5倍体积的去离子水混悬步骤1中的稠膏，然后用盐酸调pH值至1-7，静置10-24小时，滤过，滤液重复2-4遍上阳离子交换树脂；

3、依次使用去离子纯水和10%-90%乙醇溶液进行洗脱，进行除杂；

3、再以下程序洗脱纯化：首先以0.5-1.5 mol/L 的氨水乙醇溶液（乙醇浓度为50%-70%）洗脱，再以1.6-2.5 mol/L 的氨水乙醇溶液（乙醇浓度为70%-100%）洗脱，收集该部分洗脱液（每种洗脱液5BV至10BV），经脱盐处理；

4、将上述洗脱液，减压回收乙醇，用水混悬，过滤，滤渣用去离子水洗净，得汉防己甲素和汉防己乙素粗提物；

5、取上述总生物碱粗提物1重量份，加柱层析用反相C18键合硅胶0.5-2重量份，搅拌均匀，置盛有5-15重量份柱层析用反相C18键合硅胶层析柱中，用0.01%-0.03%三乙胺水溶液和乙醇洗脱，二者比例为1:3至1:4，利用紫外检测器，在230nm处，按峰收集汉防己甲素和汉防己乙素；

6、将上述汉防己甲素和汉防己乙素粗品用占粗品重量的10-30倍乙醇溶液溶解，过滤，滤液浓缩到原粗品重量的4-10倍，静置放冷即析出汉防己甲素和乙素；过滤，烘干，即分别得汉防己甲素和汉防己乙素。

本发明，利用阳离子交换树脂和反相C18反相键合硅胶，制备出的汉防己甲素及汉防己乙素，汉防己甲素和汉防己乙素的提取率均达到70%以上，纯度达99.0%~99.8%，熔点216~221℃，符合药品标准要求。相比于当下汉防己甲素提取工艺，本发明的优点有；

1、本发明制备过程，未使用氯仿，氯仿对生产设备腐蚀巨大，对生产设备此外，氯仿在机体内不能被代谢而被蓄积，有强致癌性；

2、本发明制备过程使用的有机溶剂乙醇均得到了回收循环利用；

3、本发明制备过程的离子交换树脂和反相柱层析填料均能反复利用；

4、本发明相对于当前生产工艺，只需要一次重结晶即可获得高纯度的产品；

5、本发明通过热乙醇溶液代替了丙酮溶解样品进行重结晶，一方面降低了生产成本，另一方面避免了有毒溶剂的使用。

本发明工艺，流程简单，效率高，能耗低，污染物少，特别利于放大生产。

具体实施方式

实施例1

1、取防己1 kg粉碎成粗粉，加4L 85%乙醇进行热回流提取，提取液过滤，滤液减压浓缩至无醇味，得流浸膏备用；

2、将步骤1得浸膏用9L 0.5mol/L盐酸溶液溶解，调pH值为3，静置24小时，滤过，滤液过处理好的阳离子交换001×7（阳离子交换树脂用量体积：浸膏重量=30毫升：1g），反复上样3次；

3、依次使用5BV去离子纯水、5BV 60%乙醇、5BV 0.5 mol/L 氨水75%乙醇溶液、5BV 2.0 mol/L 氨水90%乙醇溶液，收集2.0 mol/L 氨水90%乙醇溶液洗脱液；

4、将步骤3中上述洗脱液，减压回收乙醇，用水混悬，过滤，滤渣用去离子水洗净，得生物碱粗提物；

5、取上述总生物碱粗提物20g，加柱层析用反相C₁₈键合硅胶20g，搅拌均匀，置盛有400g柱层析用反相C₁₈键合硅胶层析柱中，用0.02%三乙胺水溶液和乙醇洗脱，二者比例为1:3，利用紫外检测器，在230nm处，按峰收集汉防己甲素和汉防己乙素，得汉防己甲素粗品7.1g，汉防己乙素粗品4.7g；

6、将上述汉防己甲素粗品用200ml 85%溶解，加热至60℃，过滤，滤液浓缩到50ml左右，静置放冷即析出汉防己甲素，过滤，烘干，称重得6.3g。汉防己甲素提取率为71.5%，利用HPLC测得纯度为99.2%；

7、将上述汉防己乙素150ml 78% 溶解，加热至65℃，过滤，滤液浓缩到30ml左右，静置放冷即析出汉防己乙素，过滤，烘干，称重得4.1g。汉防己乙素提取率为71.9%，利用HPLC测得纯度为99.1%。

实施例2

1、取防己1 kg粉碎成粗粉，加4L 85%乙醇进行热回流提取，提取液过滤，滤液减压浓缩至无醇味，得流浸膏备用；

2、将步骤1得浸膏用9L 0.5mol/L盐酸溶液溶解，调pH值为3，静置24小时，滤过，滤液过处理好的阳离子交换001×4（阳离子交换树脂用量体积：浸膏重量=30毫升：1g），反复上样3次；

3、依次使用5BV去离子纯水、5BV 60%乙醇、5BV 0.5 mol/L 氨水75%乙醇溶液、5BV 2.0 mol/L 氨水90%乙醇溶液，收集2.0 mol/L 氨水90%乙醇溶液洗脱液；

4、将步骤3中上述洗脱液，减压回收乙醇，用水混悬，过滤，滤渣用去离子水洗净，得生物碱粗提物；

5、取上述总生物碱粗提物20g，加柱层析用反相C₁₈键合硅胶20g，搅拌均匀，置盛有400g柱层析用反相C₁₈键合硅胶层析柱中，用0.02%三乙胺水溶液和乙醇洗脱，二者比例为1:3，利用紫外检测器，在230nm处，按峰收集汉防己甲素和汉防己乙素，得汉防己甲素粗品7.1g，汉防己乙素粗品4.7g；

6、将上述汉防己甲素粗品200ml 85%溶解，加热至60℃，过滤，滤液浓缩到50ml左右，静置放冷即析出汉防己甲素，过滤，烘干，称重得6.3g。汉防己甲素提取率为71.5%，利用HPLC测得纯度为99.2%；

7、将上述汉防己乙素150ml78% 溶解，加热至65℃，过滤，滤液浓缩到30ml左右，静置放冷即析出汉防己乙素，过滤，烘干，称重得4.1g。汉防己乙素提取率为71.9%，利用HPLC测得纯度为99.1%。

实施例3

1、取防己1 kg粉碎成粗粉，加4L 85%乙醇进行热回流提取，提取液过滤，滤液减压浓缩至无醇味，得流浸膏备用；

2、将步骤1得浸膏用9L 0.5mol/L盐酸溶液溶解，调pH值为3，静置24小时，滤过，滤液过处理好的阳离子交换D001（阳离子交换树脂用量体积:浸膏重量=30毫升：1g），反复上样3次；

3、依次使用5BV去离子纯水、5BV 60%乙醇、5BV 0.5 mol/L 氨水75%乙醇，溶液、5BV 2.0 mol/L 氨水90%乙醇溶液，收集2.0 mol/L 氨水90%乙醇溶液洗脱液；

4、将步骤3中上述洗脱液，减压回收乙醇，用水混悬，过滤，滤渣用去离子水洗净，得生物碱粗提物；

5、取上述总生物碱粗提物20g，加柱层析用反相C₁₈键合硅胶20g，搅拌均匀，置盛有400g柱层析用反相C₁₈键合硅胶层析柱中，用0.02%三乙胺水溶液和乙醇洗脱，二者比例为1:3，利用紫外检测器，在230nm处，按峰收集汉防己甲素和汉防己乙素，得汉防己甲素粗品4.1g，汉防己乙素粗品2.7g；

6、将上述汉防己甲素粗品200ml 85%溶解，加热至60℃，过滤，滤液浓缩到50ml左右，静置放冷即析出汉防己甲素，过滤，烘干，称重得2.3g。汉防己甲素的提取率为26%，利用HPLC测得纯度为88.9%；

7、将上述汉防己乙素150ml 78% 溶解，加热至65℃，过滤，滤液浓缩到30ml左右，静置放冷即析出汉防己乙素，过滤，烘干，称重得1.1g。汉防己乙素的提取率为19%，利用HPLC测得纯度为90.1%。