用于斑海豹亲子鉴定的SSR标记引物组及其应用

摘要

本发明公开了用于斑海豹亲子鉴定的SSR标记引物组及应用，本发明成功筛选并合成15对荧光标记微卫星引物组，该引物组可以用于建立斑海豹亲子鉴定技术，并且公开了所使用的亲子鉴定的试剂盒。本发明所述鉴定方法具有准确、高效、可靠等特点，可以指导斑海豹的人工繁育和野外放流工作，并在斑海豹家系管理和种质鉴定进行推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于海洋哺乳动物亲子鉴定技术领域，具体涉及用于斑海豹亲子鉴定的SSR引物组及应用。

背景技术

斑海豹(Phoca largha)属食肉目(Carnivora)犬形亚目(Caniformia)海豹科(Phocidae)、斑海豹属(Phoca)，是我国二级保护动物，主要分布于北太平洋的北部和西部海域及其沿岸和岛屿，在我国主要分布于渤海和黄海，偶见于南海。斑海豹是唯一能在我国海域进行繁殖的鳍足类动物，而渤海辽东湾结冰区是斑海豹8个繁殖区中最南的一个。斑海豹野外种群正在遭受威胁，人工繁殖成为保护该物种的重要手段，以大连圣亚旅游控股股份有限公司(以下简称“大连圣亚”)为例，自开展斑海豹人工繁殖工作以来，共成功繁育斑海豹44头，现每年有8～10头个体在人工条件下出生，到目前为止F1代个体已占整个饲养群体的60％，许多F1代已达性成熟。随着时间增长，诸多的F1代将会不可避免参与繁殖，遗憾的是这些F1代的父权关系尚不明确，类似的情况也在其他有斑海豹的水族馆存在。

亲权鉴定又称亲子鉴定，微卫星亲子鉴定是近年来流行的一种亲子鉴定技术，其在人类法医鉴定、重要经济动物和濒危动物的遗传谱系鉴定中得到了广泛应用。然而，目前该技术在海洋哺乳动物中仅见于瓶鼻海豚(Tursiops spp)、长江江豚(Neophocaenaasiaeorientalisasiaeorientalis)等少数鲸类动物。近年来，斑海豹等海豹科物种的基因组、转录组序列的挖掘工作取得了一些突破，从而给该物种微卫星亲子鉴定技术的研发和应用提供了契机。

目前，还没有将微卫星分子标记应用到斑海豹的亲子鉴定和遗传管理的报道。本发明旨在利用发明的微卫星引物组，采用荧光标记毛细管电泳技术建立斑海豹亲子鉴定技术，为斑海豹繁殖群体遗传谱系的构建、各水族馆间斑海豹的交换、交流提供依据，以期合理的指导斑海豹人工繁殖。

发明内容

本发明旨在提供用于斑海豹亲子鉴定的SSR标记引物组，该引物可用于斑海豹亲子鉴定，含有15对引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30所示。

本发明的另一个目的在于提供了用于斑海豹亲子鉴定的SSR荧光标记引物组的应用。包括利用该引物组制备成用于斑海豹亲子鉴定的试剂盒，或利用该引物组对斑海豹进行亲子鉴定，或利用其进行家系管理。

所述的试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30所示的全部/部分引物组，以及10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、Ex>

本发明还公开一种斑海豹亲子鉴定的方法，其包括以下操作步骤：提取待鉴定亲本及子代样品DNA，对上文所述的引物组的正向引物，标记FAM、HEX、TAM或ROX的荧光染料；再利用标记荧光染料后的全部/部分引物组对提取的样品DNA进行扩增，进行毛细管电泳，依据电泳峰图结果进行基因分型，应用GeneMapper软件进行基因分型，将分析结果输出在Excel表格中。使用Cervus软件统计等位基因数(Na)、平均期望值杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、累积第一排除率(CE-1P)、累积第二排除率(CE-2P)和双亲累积排除率(CE-PP)，根据Parentage模块计算出来的LOD的值以及Delta值标准，结果显示为“+”(即80％的置信度水平下)为其可能亲本；结果显示为“*”(即95％的置信度水平下)为其最可能亲本。具体的，本发明实施例3中列举了亲子关系判定方法，有力证明了本发明提供的SSR分子标记引物组，可用于斑海豹家系管理和种质鉴定，从而合理预期，本发明所述的SSR分子标记引物组及其应用方法，能够有效指导斑海豹的人工繁殖，保护我国斑海豹的遗传多样性和种质资源。

附图说明

本发明附图15幅，为发明的引物组在亲子鉴定中的部分测序图，显示了设计引物的正确性，分别是：

图1为引物PLMS10测序图，从左至右依次为母本59368(275bp,278bp)，子代87492(278bp)，父本59347(275bp,278bp)。

图2为引物PLMS12测序图，从左至右依次为母本59368(280bp)，子代87492(277bp,280bp)，父本59347(277bp)。

图3为引物PLMS17测序图，从左至右依次为母本59368(261bp)，子代87492(258bp,261bp)，父本59347(258bp,261bp)。

图4为引物PLMS24测序图，从左至右依次为母本59368(223bp)，子代87492(223bp)，父本59347(223bp)。

图5为引物PLMS28测序图，从左至右依次为母本59368(263bp)，子代87492(263bp)，父本59347(263bp)。

图6为引物PLMS44测序图，从左至右依次为母本59368(226bp)，子代87492(226bp)，父本59347(226bp)。

图7为引物PLMS45测序图，从左至右依次为母本59368(189bp)，子代87492(189bp)，父本59347(189bp)。

图8为引物PLMS68测序图，从左至右依次为母本59368(250bp,258bp)，子代87492(250bp,258bp)，父本59347(247bp,258bp)。

图9为引物PLMS55测序图，从左至右依次为母本59368(211bp,223bp)，子代87492(211bp)，父本59347(211bp)。

图10为引物PLMS58测序图，从左至右依次为母本59368(231bp)，子代87492(231bp)，父本59347(231bp)。

图11为引物PLMS71测序图，从左至右依次为母本59368(248bp)，子代87492(248bp,295bp)，父本59347(248bp,295bp)。

图12为引物PLMS76测序图，从左至右依次为母本59368(264bp,280bp)，子代87492(264bp,280bp)，父本59347(280bp)。

图13为引物PLMS79测序图，从左至右依次为母本59368(314bp,318bp)，子代87492(314bp,316bp)，父本59347(316bp)。

图14为引物PLMS83测序图，从左至右依次为母本59368(217bp)，子代87492(217bp)，父本59347(217bp)。

图15为引物PLMS90测序图，从左至右依次为母本59368(287bp)，子代87492(287bp)，父本59347(287bp)。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

样品采集：发明申请人于2014年至2016年对大连圣亚豢养的53头斑海豹进行血样的采集工作，其中10头待鉴定的海豹幼仔的母子关系都有记录均为已知，候选待鉴定父本17头。本发明在斑海豹体检时，由兽医或训练员用一次性注射器从尾部静脉血管采取约5ml血液，装于医用血常规管中(EDTA-K2抗凝)，4℃保存，带回实验室后长期保存于-20℃。DNA提取采用天根公司的血液基因组DNA提纯试剂盒，具体步骤参考操作手册。

实施例1

斑海豹亲子鉴定微卫星标记的引物组筛选及荧光标记引物组在斑海豹亲子鉴定中的应用，包括如下步骤：

(一)引物组筛选

由于已公布的斑海豹的基因组信息很少，发明人通过仅有的转录组数据，使用MISA软件对Unigenes序列进行SSR位点搜索，所述搜索的标准为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸最少重复次数分别为14、9、6、4、4，将所的含有EST-SSR的序列利用Primer Premier 5.0软件设计微卫星引物195对，引物设计原则如下：引物长度：18-21bp，引物序列GC含量：33-72％，引物对Tm值在53-61.5℃之间(上下游引物Tm值差在5℃之内)，扩增片段大小在185-315bp之间，避免出现发卡结构、二聚体、错配和引物二聚体等引物二级结构出现。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。首先用随机选出的20头斑海豹的DNA进行引物扩增，用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行初筛，根据电泳结果，排除无扩增产物、无多态性、条带弱、不能重复扩增的引物后，初步获得扩增稳定且多态性的引物组；利用初步筛选的引物对随机2头斑海豹个体进行PCR扩增，并将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司克隆测序。

同时将初步筛选得到的引物组的上游引物用不同的荧光染料FAM、HEX、TAM和ROX进行随机的标记，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(二)引物组筛选结果

引物初步筛选的PCR反应体系为25μl，其中模板DNA 50ng，混合dNTP 0.2mM，上下游引物各200nM，1×PCR buffer，1.5mM MgCl₂，Ex>

荧光引物的PCR反应体系和反应条件如下表1、表2所示，经毛细管电泳检测后，并结合克隆测序结果，最终获得15对多态性高并且能稳定扩增的微卫星标记(SEQ ID NO.1～SEQID NO.30所示)。

表1荧光引物反应体系

模板(10ng/μl)1μl引物F(10mmol/μl)0.5μl引物R(10mmol/μl)0.5μldNTP 10mM0.5μl10×PCR Buffer2.5μl2.0μlEx Taq酶(5U/μl)0.2水(μl)17.8

表2荧光引物反应条件

实施例2

(一)微卫星基因型分析

对提取的大连圣亚斑海豹群体(53头个体)DNA，利用筛选得到的15对荧光标记引物组进行扩增，PCR产物由1％琼脂糖凝胶检测后进行3730XL测序仪(美国ABI公司)毛细管电泳检测，应用GeneMapper软件进行基因分型，将分析结果输出在Excel表格中。

(二)各微卫星基因座的特征

将53头个体的15对荧光标记引物的毛细管电泳峰图利用GeneMapper软件进行基因分型，将分型结果输出在Excel表格中，并导入Cervus 3.0软件，结果如表3所示。各微卫星基因座等位基因数目为2～8个，平均等位基因数为4.1，基因杂合度的平均期望值(He)为0.3669，多态信息含量(PIC)的平均值为0.3206。

表3各微卫星的序列、退火温度、基因频率分布和亲子鉴定排除率

实施例3

(一)亲子关系判定

用Cervus 3.0软件，统计各微卫星位点等位基因数(Na)、平均期望值杂合度(He)、多态信息含量(PIC)。并在此基础上计算出各基因座的排除率等参数。

在本发明中，父亲鉴定的排除概率存在两种情况：

情况一：所有可疑个体的基因型都已经列出，但母—子关系不清楚。在此情况下，每一个微卫星位点的排除概率E_x按照Jamieson(1965，1994)的下面公式的算法，P_i和P_j为每个座位等位基因的基因频率:

E_x＝∑P_i²(1-P_i)²-∑(P_iP_j)[4-3(P_i+P_j)]

情况二：在母亲已知，父亲未知的情况下，每一个位点在母亲已知，父亲未知的情况下，每一个位点父亲鉴定的排除概率Ex按照Gaber等下面公式的算法计算：

E_x＝∑P_i²(1-P_i)²+∑2(P_iP_j)(1-P_i-P_j)²

多个位点的联合排除率E按照Jamieson等下面公式的方法计算，i为采用的微卫星位点数目：

E＝1-(1-E_x1)(1-E_x2)(1-E_x3)…(1-E_xi)

在本发明中，均为母亲已知，父亲未知。应用Cervus 3.0软件判定亲子关系：根据可疑父亲的基因型计算其LOD值(似然率的自然对数值)。按照LOD评分高低判定亲子关系：求Δ值：

n≥2，Δ＝LOD₁-LOD₂

n＝1，Δ＝LOD₁

n＝0，Δ值无定义。

式中，LOD₁和LOD₂为最可能是真父的两只斑海豹的LOD值。

为保证本发明所用的微卫星引物组能够同时为国内其他水族馆斑海豹亲子鉴定提供指导，在计算各微卫星位点的排除率时，按照采集到的所有斑海豹的数据进行统计。

(二)鉴定结果：

根据采集到的斑海豹各微卫星位点等位基因情况，得到了各样品的基因型，计算了所有位点的排除率(表3)，经计算，累积第一排除率(CE-1P)为0.8214，累积第二排除率(CE-2P)和双亲累积排除率(CE-PP)分别为0.9713、0.9977，由于需鉴定的海豹母亲均为已知，表明所用的微卫星标记能有效用于斑海豹的父亲鉴定。

运行Cervus3.0软件的模拟(Simulation)模块，模拟候选亲本17个，循环10000次(子代设为10000个)，分别计算已知一个亲本与不知道亲本的Δ分布，在运行软件中的Parentage模块检测亲子关系。本方案中的实验群体为豢养的斑海豹，10只待鉴定的海豹幼仔的母子关系都有记录均为已知，待鉴定的候选父本有17头，根据Parentage模块计算出来的LOD的值以及Delta值标准，鉴定结果可知：80％的置信度水平下，所有10头待鉴定的海豹都找到了最似父亲，其中有9头的置信度超过95％，他们的亲缘关系详见表4。从表中可以看出编号为59361和20946的子代海豹有一共同的父亲：59331，他们为兄妹关系；而父本海豹59347有4个后代，分别是：59365、87400、87492和59351。

表4亲权鉴定结果

注：表中“*”表示亲子关系极显著，置信度超过95％；“+”表示亲子关系较显著，置信度超过80％。