法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-09-13
授权
授权
2017-07-11
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/543 申请日:20150617
实质审查的生效
2017-05-31
公开
公开
发明的技术领域
本发明涉及能够在诊断自动装置上施行的用于检测针对甲状腺激素受体的自身抗体或自身免疫抗体的方法，和至少部分地由包含TSH受体的细胞外部分的蛋白质形成的且固定在顺磁性颗粒上的TSH受体嵌合体在桥式测定法中与另外一个TSH受体一起在这样的方法中的用途，以及经修饰的TSH受体嵌合体。
发明的技术背景
TSH受体(TSH-R)对于甲状腺细胞的生长和功能起着关键作用。该受体是G蛋白偶联糖蛋白受体亚家族的成员，该亚家族此外还包括关于黄体生成素/绒毛膜促性腺激素的受体(LH/CGR)和关于促卵泡激素的受体(FSHR)。该亚家族的受体具有大的N-末端细胞外结构域，其对于配体结合具有必要意义并且其已显示参与信号传递。TSHR信号的传递主要通过腺苷酸环化酶的激活来介导，这导致细胞内cAMP水平的升高。
对于TSH受体的巨大兴趣的一部分归因于其在伴随有针对TSH受体的自身抗体出现的甲状腺自身免疫疾病中作为首要自身抗原的作用。这样的甲状腺自身免疫疾病包括巴泽多病(一种导致甲状腺机能亢进的自身免疫疾病)，其总体而言属于最常见的人自身免疫疾病。巴泽多病是由于腺苷酸环化酶的激活和结果发生的cAMP上升而引起的。由此发生甲状腺机能亢进、甲状腺肿形成和可能地眼睛变化。但是针对TSH受体的自身抗体还可以具有阻断性特性，并因此阻碍腺苷酸环化酶和cAMP。在这种情况下，发生甲状腺机能减退。在所牵涉的患者中同时出现刺激性和阻断性自身抗体同样是可能的，其中刺激性自身抗体的份额通常占优势。
为了检测此类自身抗体，一段时间以来存在这样的生物测定法，其中测量cAMP-增加。该测量方法是非常耗时的。此外，该生物测定法是不可靠的，因为它可能提供假阳性结果。在本说明书的范围内，该类型的测量方法被称为生物测定法(Bioassay)以便与用于测定针对TSH受体的自身抗体的体外方法划清界限。在一种在市场上存在有的用于自身抗体的体外检测方法中，使用从猪甲状腺膜中提取的TSH受体(第一代体外方法)。在另一种用于检测针对TSH受体的自身抗体的测试中，在竞争性测试中使用人的完整的重组TSH受体蛋白(野生型)。
Thyroid,第7卷(1997)867-877描述了在TSH受体上的关于刺激性和阻断性自身抗体的表位。大多数关于刺激性自身抗体的功能性表位存在于受体蛋白的氨基酸8至168的区域内，和关于阻断性自身抗体的那些存在于受体蛋白的氨基酸261至370的区域内。对于活性测量，使用上面所描述的生物测定法。
通过WO 01/27634 A1，首次提供了用于并行地检测具有不同特异性的自身抗体的定量方法，其是快速地可重现的和能够以高精确性施行的。为此目的，使用TSH受体嵌合体，其与野生型受体的区别在于，自身抗体所结合的独个序列被替换为来自G蛋白偶联受体这一类别的另一受体的相应序列。除此之外，所述TSH受体嵌合体包含完整的TSH受体。然而，测量费用是高的。通过离心进行分离使得该方法对于常规使用来说过于烦琐。而且，该测试必须在冰浴中或在4℃下进行，这是因为所述TSH受体嵌合体不是非常稳定的。相应的技术指导存在于WO 01/63296 A1中，其中建议使用“夹心”技术用于进行检测。然而，已表明，通常在用在那里所建议的测试材料的情况下，非特异性结合是过于高的。基于上面所描述的这两个专利申请的知识的用于检测自身抗体的测试在市场上是不可得的。
WO 00/00590 A1描述了在C-末端处经截短的TSH受体，和一般而言，其用于诊断和疗法的适合性。WO 2007/036511 A1描述了用于检测针对TSH受体的自身抗体的所谓桥式测定法，其首次能够在自动装置上施行。为了进行该桥式测定法，使用两种TSH受体嵌合体，其中给出信号的受体嵌合体仅包含TSH受体的细胞外区域，而所谓的锚受体嵌合体是全酶。从2014年春天开始将会在世界范围内提供该方法以用于自动诊断针对甲状腺激素受体的自身抗体，并且该方法在所谓的
发明概述
值得期望的是，还在以顺磁性颗粒作为固相进行工作的全自动分析设备上应用WO2007/036511 A1的方法。用WO 2007/036511 A1的TSH受体嵌合体进行的测试和用仅包含TSH受体的细胞外结构域的两种TSH受体进行的测试，均不能使在以顺磁性颗粒进行工作的全自动装置(例如ADVIA Centaur自动装置或ARCHITECT自动装置)上施行检测方法成为可能。
使用两种细胞外TSH受体嵌合体(经截短的TSH受体嵌合体)作为锚受体和作为信号受体显示出对于施行在WO 2007/036511 A1中所描述的桥式测定法来说过低的用于检测针对TSH受体的自身抗体的灵敏度和特异性。用该TSH受体嵌合体群集进行的测量经证明是不可重现的，这显示在实施例3(比较实施例)中。
但是极其值得追求的是，提供这样的用于检测针对甲状腺激素受体的自身抗体的方法，其具有与在WO 2007/036511 A1中所描述的方法完全相同的精确性和效力，并且此外其在使用顺磁性颗粒作为固相的全自动装置上是可能的。
该任务通过能够在诊断自动装置上施行的用于检测针对TSH受体的刺激性自身抗体的方法而得到解决，在所述方法中使患者样品与结合在固相上的第一TSH受体嵌合体相接触以便使在所述患者样品中可能存在的针对TSH受体的刺激性自身抗体与所述第一TSH受体嵌合体相结合，让所获得的免疫复合物与第二TSH受体嵌合体进行反应以便使在所述患者样品中可能存在的针对TSH受体的自身抗体额外地与所述第二TSH受体嵌合相结合，并且进行用于检测包含所述自身抗体的免疫复合物的反应，其中使用顺磁性颗粒作为固相，所述第一和第二TSH受体嵌合体包含关于针对TSH受体的刺激性自身抗体(而非阻断性或中性自身抗体)的结合表位且在N-末端处与适合于使TSH受体分泌入细胞外空间中的蛋白质相融合，并且所述第二TSH受体嵌合体包含给出信号的氨基酸序列或其他给出信号的标记试剂以用于检测所形成的免疫复合物。
进一步地，本发明的目标为TSH受体嵌合体，其在N-末端处与适合于使TSH受体分泌入细胞外空间中的蛋白质相融合，包含关于针对TSH受体的刺激性自身抗体的结合表位，但不具有关于阻断性和中性自身抗体的结合表位。示例性的氨基酸序列为这样的氨基酸序列，其与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6具有至少85％，优选地至少90％，和特别优选地至少95％的同一性。
本发明的目标还为固定在顺磁性颗粒上的TSH受体嵌合体在诊断自动装置上的桥式测定法中与另外一个TSH受体嵌合体一起用于检测针对甲状腺激素受体(TSH受体)的自身抗体的用途，所述固定在顺磁性颗粒上的TSH受体嵌合体在N-末端处与适合于使TSH受体分泌入细胞外空间中的蛋白质相融合，并且包含关于针对TSH受体的刺激性自身抗体的结合表位(而不包含关于阻断性或中性自身抗体的结合表位)。示例性的氨基酸序列为这样的氨基酸序列，其与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6具有至少85％，优选地至少90％，和特别优选地至少95％的同一性。
进一步地，本发明的目标为野生型TSH受体的细胞外结构域在用于定量测定针对TSH受体的自身抗体的方法中的用途，所述野生型TSH受体的细胞外结构域在N-末端处与适合于使TSH受体分泌入细胞外空间中的蛋白质(例如，血清蛋白质)相融合。
最后，本发明的目标为固定在顺磁性颗粒上的融合蛋白在用于测定针对甲状腺激素受体(TSH受体)的自身抗体的桥式测定法中的用途，所述融合蛋白包含在N-末端或C-末端处与分泌型碱性磷酸酶(SEAP)或其他分泌型蛋白质(例如，血清白蛋白)相融合的野生型TSH受体的细胞外部分。
令人意外地，现在首次可以在用于检测针对TSH受体的自身抗体的桥式测定法中使用两种经截短的TSH受体嵌合体。因此，首次从完整的TSH受体或完整的TSH受体嵌合体中，在桥式测定法中基本上仅使用野生型受体或受体嵌合体的细胞外结构域。进一步地，令人意外地确定，为了检测针对TSH受体的自身抗体，固定在顺磁性颗粒上的经结合的由包含TSH受体的细胞外部分的蛋白质构成的第一TSH受体嵌合体适合作为关于自身抗体的锚受体，和由包含TSH受体的细胞外部分的蛋白质构成的第二TSH受体嵌合体适合作为信号受体，如果将受体的细胞外部分与适合于使TSH受体分泌入细胞外空间中的蛋白质相融合。根据本发明所使用的TSH受体嵌合体具有高的贮存稳定性、运输稳定性、储藏稳定性，和还具有高的检定稳定性。这些陈述也适用于由在N-末端处与适合于使TSH受体分泌入细胞外空间中的蛋白质相融合的野生型TSH受体的细胞外结构域构成的融合蛋白。
优选实施方案的描述
TSH受体从胞质通过细胞膜延伸入细胞外空间中。受体蛋白质的细胞外部分具有关于TSH和自身抗体的结合位点。
根据本发明的受体嵌合体从TSH受体蛋白质中基本上仅包含TSH受体的细胞外部分。基本上，这意味着，存在有TSH受体的膜部分的少于40个，优选地少于30或20个，特别优选地少于10个，和直至0个氨基酸。这不仅适用于所谓的第一的在根据本发明的方法中所使用的TSH受体嵌合体，而且也适用于所谓的第二的额外使用的TSH受体嵌合体。这还适用于使用具有野生型TSH受体的蛋白质的情况。所述TSH受体嵌合体可以例如包含从TSH受体的N-末端部分开始的氨基酸21至418，优选地氨基酸21至380，特别优选地所述TSH受体嵌合体的细胞外结构域的氨基酸21至350或330。但是，仅仅包含氨基酸21至260的TSH受体的细胞外结构域根据本发明也是可使用的。如果使用细胞外结构域的更少的氨基酸，那么表位的结合行为和TSH受体嵌合体的稳定性会发生变化。另一方面，这也适用于具有野生型TSH受体的细胞外结构域的蛋白质。在该情况下，“野生型”是指这样的TSH受体的细胞外结构域，其中用于结合刺激性、阻断性或中性自身抗体的氨基酸序列没有被替换。
如果根据本发明所使用的TSH受体嵌合体的氨基酸数目过高，那么在其获得过程中，TSH受体嵌合体从为了产生其而使用的重组细胞中向细胞外空间中的分泌就会变差。
所述第一TSH受体嵌合体和任选地所述第二TSH受体嵌合体另外还可以包含受体的胞质部分的氨基酸序列。为此，优选地考虑TSH受体的胞质部分的氨基酸698-725或其部分序列。它是高度免疫原性的氨基酸序列，其已证明对于将第一TSH受体嵌合体固定在顺磁性颗粒上来说是有利的。
已证明对于实施根据本发明的方法来说必要的是，使受体嵌合体的细胞外部分或野生型TSH受体的细胞外结构域与引起所述受体嵌合体分泌的蛋白质相融合。这样的蛋白质为例如哺乳动物的血清蛋白质。优选地，使用白蛋白。所述融合优选地在N-末端处发生。所述第一的根据本发明所使用的TSH受体嵌合体特别优选地包含血清蛋白质。优选地，使用白蛋白，其在与TSH受体的细胞外结构域相融合后使所述TSH受体嵌合体稳定化并且导致根据本发明所使用的TSH受体嵌合体从在其中产生所述受体嵌合体的细胞中分泌。这适用于由野生型TSH受体的细胞外结构域和血清蛋白质构成的融合蛋白。所述第一的根据本发明所使用的TSH受体嵌合体也可以仅包含血清蛋白质(特别是白蛋白)的部分序列，只要这些保证TSH受体嵌合体的稳定化和从细胞中的分泌。通过该措施，赋予所述TSH受体嵌合体以稳定性。
所述第二的根据本发明所使用的TSH受体嵌合体具有与所述第一的根据本发明所使用的TSH受体嵌合体基本上相同的构造。由于在根据本发明的方法中所述第二TSH受体嵌合体具有信号给出者的功能，因而它必须在这方面区别于所述第一TSH受体嵌合体(锚受体)。为此目的，它具有标记试剂。所述标记试剂可以在N-末端或C-末端处与所述第二TSH受体嵌合体相融合。优选地，所述标记试剂在C-末端处与所述第二TSH受体嵌合体相融合。根据本发明的一个优选的实施方案，所述信号TSH受体嵌合体在N-末端处具有分泌型碱性磷酸酶。所述分泌型碱性磷酸酶还可以用于检测反应。那么可以放弃用于检测的在所述第二TSH受体嵌合体的C-末端部分上的进一步的修饰。除非应当通过另一种反应来实现检测。
因此，优选地，根据本发明的TSH受体嵌合体是这样的TSH受体嵌合体，其完全地或部分地缺少TSH野生型受体的胞质部分和优选地完全缺少TSH野生型受体的膜部分。进一步优选地，可以修饰根据本发明的TSH受体嵌合体的细胞外部分，如下面所解释的那样。
如果要检测刺激性自身抗体，那么优选地使用这样的受体嵌合体，其中结合针对TSH受体的阻断性或中性自身抗体的序列被替换。
为了替换，优选地使用另一受体的相对等的序列，其基本上不具有对于各自两种其他类型的自身抗体的结合。这样的相对等的序列可以例如为大鼠LG-CG受体的序列。因此，在根据本发明所使用的TSH受体嵌合体的情况下，可以替换刺激性、中性和/或阻断性自身抗体所结合的表位。这些受体嵌合体可以根据Biochem.Biophys.Res.Comun.(1991),179:70-77或WO 01/27634 A2来进行构建。关于TSH受体嵌合体的产生，可参考这两篇文献。
在检测刺激性自身抗体的情况下，将在TSH受体蛋白质中的关于阻断性和中性抗体的结合序列替换为另一受体的不导致各自另一种类型的自身抗体的结合的序列。在用于检测刺激性自身抗体的嵌合体中，优选地可以将TSH受体氨基酸261至370基本上替代为大鼠LH-CGR的相应的氨基酸261至329。
对于根据本发明的TSH受体嵌合体和相应的具有野生型TSH受体蛋白质的细胞外结构域的融合蛋白来说特别有利的是，将它们与用于使TSH受体嵌合体从细胞中分泌的氨基酸序列相融合，并因此在其在重组细胞中的产生过程中它们被分泌入细胞外空间中。那么，为了获得TSH受体嵌合体的细胞裂解不再是必需的了。因此，能够以高的纯度且基本上没有被细胞成分污染地获得根据本发明待使用的TSH受体嵌合体，所述细胞成分在为了获得蛋白质的细胞裂解的情况下出现。
为了检测可以修饰根据本发明所使用的第二TSH受体嵌合体或相应的具有野生型TSH受体的细胞外结构域的融合蛋白(信号受体)，例如可以依照所希望的测定法设计将其与标记试剂相融合。所述标记试剂可以是这样的，即它直接地或间接地提供可检测信号。在本发明的范围内，直接标记为用直接提供用于检测免疫复合物的可检测信号的标记试剂对TSH受体嵌合体进行标记。在本发明的范围内，间接标记可以例如为将TSH受体嵌合体与免疫原性肽序列相融合，所述免疫原性肽序列被适合于检测的第二经标记的抗体所识别。
标记试剂可以通过融合或化学键合而与TSH受体嵌合体或相应的具有野生型TSH受体的细胞外结构域的融合蛋白或者第二抗体相连接。合适的标记例如通过酶(例如，碱性磷酸酶(AP)、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、萤火虫或Gaussia萤光素酶和过氧化物酶)或染料(例如，吖啶染料、荧光材料或生物/化学发光材料)来实现。在上面所描述的酶的情况下，优选地将编码所述酶的核苷酸序列与第二TSH受体嵌合体(信号受体)的核苷酸序列相融合。合适的标记例如进一步地通过异硫氰酸荧光素(FITC)、生物素化和链霉抗生物素蛋白来实现。在一个优选的实施方案中，可以将所述第二TSH受体嵌合体在N-末端处与分泌型碱性磷酸酶相融合以用于检测。
在另一个优选的实施方案中，将所述第二TSH受体嵌合体在C-末端处用吖啶染料直接进行标记。
在根据本发明的方法中，在免疫复合物形成期间，所谓的第一TSH受体嵌合体或相应的具有野生型TSH受体的细胞外结构域的融合蛋白结合在顺磁性固相上。所述TSH受体嵌合体与该固相的结合可以通过固定性抗体来进行，所述固定性抗体例如针对所述TSH受体嵌合体的C-末端表位。这样的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。例如，所述固定性抗体可以针对所述第一TSH受体嵌合体的胞质部分的氨基酸698-725。
为了检测自身抗体与TSH受体嵌合体的结合，还可以使用第二抗体。除了固定性抗体之外，可以存在第二抗体。它可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
合适的固相包括顺磁性颗粒，例如顺磁性小管、顺磁性小片和顺磁性微粒，但也可以是其他形态的顺磁性颗粒。这样的顺磁性颗粒是专业人员已知的，并且例如可以以商标
根据本发明的TSH受体嵌合体可以冻干贮存。它们可以以通过单克隆抗体或多克隆抗体结合在固相上的状态以冻干形式进行贮存。对于检测反应，通过溶解在检定缓冲液中来进行冻干组分的重构。
根据本发明的TSH受体嵌合体或相应的具有野生型TSH受体的细胞外结构域的融合蛋白(下面称为野生型变体)在溶解形式的情况下具有高的稳定性(检定稳定性和储藏稳定性)。它们在4℃下在六至七天的时间长度下保持稳定，并且可以在诊断自动装置的重新校准后在另外两至三周的时间长度下进行使用。在37℃的温度下，溶解的根据本发明的TSH受体嵌合体在六小时的时间长度下保持稳定。这些条件适合于在诊断自动装置上施行根据本发明的检测方法，在所述诊断自动装置上所述组分在4℃下进行贮存，而试验反应可以在37℃下无问题地进行，和因此特别地也在Advia Centaur自动装置上施行根据本发明的检测方法。与此相反，全TSH受体嵌合体在4℃下在直至六天的时间长度下保持稳定，在24℃下在直至48小时的时间长度下保持稳定，和在37℃下仅在三小时的时间长度下保持稳定。
为了施行根据本发明的方法，将患者样品各自用第一经固定的TSH受体嵌合体(锚受体)和第二TSH受体嵌合体(信号受体)或其野生型变体进行转化，并且就相应的自身抗体进行检验。
下面通过参考附图来描述根据本发明的方法的示例性实施方案。
图1和2以图解方式显示了固定在顺磁性颗粒上的免疫复合物，其作为根据本发明的方法的产物。
图3，特别是3.1和3.2，以图解方式显示了在根据本发明的方法中可使用的第一TSH受体嵌合体(锚受体)。它是与人白蛋白序列以及hTSHR锚表位相融合的相关于大鼠LH/CG受体进行了部分序列替换的hTSHR的部分序列的构建体。指明了切割位点。氨基酸的编号涉及全受体的各自的氨基酸或碱基。
图4显示了比较实施例的结果。在比较实施例中解释了所述结果。
图5显示了锚受体(其借助于锚抗体而固定在顺磁性颗粒上)于在37℃下和在4℃下无摇动地进行温育的情况下的检定稳定性。分别在3小时和3.75小时后，还有大约80％或更多的锚受体是完整的。
图6显示了具有66.5IU/L的患者血清的稀释系列的线性。通过根据本发明的方法来进行测量。在Y-轴上指明了相对光单位RLU，和在X-轴上指明了以“国际单位/升”表示的所测量的自身抗体的浓度。
图7显示了以用EP>
图8充当根据本发明的方法的功能灵敏度的确立。所述功能灵敏度在此相应于20％的测定法间差异限度。基于114份血清和17份血清汇集物的测定(多次测定，n＝3-7)，临时功能灵敏度位于大约1.9MB(磁珠)_U/L。考虑到由于测定法的手工实施而导致的增加的波动，所述功能灵敏度可以备选地用30％的测定法间差异限度来进行评估；在该情况下，所述值位于大约1.7MB_U/L。因此，根据本发明的方法具有非常好的灵敏度。
图9显示了在用磁珠测定法获得的结果(MB值)与sTRAb值(来自114份血清和17份血清汇集物的463个单值)之间的良好的相关性。
SEQ>显示了锚受体的核苷酸序列，所述锚受体具有TSH受体嵌合体的细胞外部分和TSH受体嵌合体的胞质氨基酸序列，其在N-末端处与人血清白蛋白(包括非翻译序列在内)相融合。
SEQ>显示了关于SEQ ID No.1的氨基酸序列。在SEQ ID No.1和2(第一TSH受体嵌合体或锚受体)中，核苷酸1至618(氨基酸1-206)表示HSA肽序列，核苷酸619至1553(氨基酸207-516)表示该嵌合体的氨基酸21至330的TSHR序列，核苷酸1345至1553(氨基酸446-516)表示该嵌合体的氨基酸261至330的LHR序列，核苷酸1554至1637(氨基酸516-543)表示来自TSH受体的胞质部分的高免疫原性表位(由TSH受体的核苷酸743-763所编码)。
SEQ>显示了TSH受体的细胞外部分的部分序列。在SEQ ID No.5中氨基酸1至240表示TSH受体的细胞外部分的氨基酸21至260(ECD260)。
SEQ>显示了TSH受体嵌合体的细胞外部分的另一个部分序列。在SEQ IDNo.4中，氨基酸1至310表示TSH受体的细胞外部分的氨基酸21至330，其中将氨基酸241至310替代为大鼠LH-CGR的相应的氨基酸261至330(ECD330)。
SEQ>显示了融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白由在N-末端处与人血清白蛋白(包括非翻译序列在内)相融合的野生型TSH受体的细胞外结构域和胞质氨基酸序列构成。
SEQ>显示了融合蛋白的氨基酸序列，所述融合蛋白由野生型TSH受体的细胞外部分和胞质氨基酸序列(其在N-末端处与人血清白蛋白(包括非翻译序列在内)相融合)构成。
下面描述了在微量滴定板上施行根据本发明的体外测定法以用于直接测定在作为基质的顺磁性微珠上的刺激性TSH-R自身抗体。
作为在作为固相的顺磁性微珠上的锚受体，通过用于产生融合蛋白的基因技术来制备如在图3中所显示的构建体，其在中央包含具有氨基酸(AA)21-330的TSHR-ECD(细胞外结构域)。这作为嵌合体存在，在所述嵌合体中AA 261-330被替代为相应的LH/CG-R序列，因此不会一同测量阻断性抗体。在C-末端处融合了AA 698-725的胞质TSHR序列，在其上结合单克隆抗体以为了锚定在顺磁性微珠上。在N-末端处融合了人血清白蛋白的部分序列(AA1-206)。该HSA-ECD330-Chim充当分泌型蛋白质以用于将整个融合蛋白从培养细胞中释放到培养基中。由此，更简单地产生用于结合自身抗体的锚受体是可能的。该分泌的受体嵌合体与完整的野生型嵌合体的区别在于其高的纯度，所述完整的野生型嵌合体在从细胞中提取后由于被细胞成分污染而变得不纯。除了分泌的优点之外，首次可以显示，当将它与顺磁性微珠相偶联时，该融合蛋白在缓冲液中和还在由缓冲液和患者血清组成的混合物中具有明显更高的稳定性。人血清白蛋白(HSA)令人惊讶地具有特别的意义，因为由顺磁性微珠和通过抗体而结合在其上的TSHR构建体所组成的偶联产物在自动装置上在4℃下以溶解形式在数天期间保持稳定(有功能)。这些是对于使用顺磁性微珠作为固相的测定法来说必不可少的先决条件。作为提取物存在的完整的嵌合野生型受体在这些溶解条件下非常快地丧失其功能性，并因此不适合于在自动装置上与在溶液中的顺磁性微珠相偶联。令人惊讶地，HSA对于融合构建体HSA-ECD330-Chim的稳定性负有责任。
在第二个测定法步骤中，将患者血清与所描述的偶联产物HSA-ECD330-Chim一起在缓冲溶液中进行温育。然后，将顺磁性微珠结合到磁体上，因此随后通过洗涤来去除影响测量灵敏度的因素。
在第三个测定法步骤中，在反应容器中添加同样重组地作为融合蛋白存在的检测受体。它在中央包含作为嵌合体的ECD，其中氨基酸261-266同样被替换为相应的LH/CG序列。所述检测受体在N-末端处与SEAP(AA 1-520)相融合。然后，所形成的免疫复合物可以看起来如在图1和2中以图解方式所显示的那样。然后，当应当从反应容器中去除流体(样品、试剂、洗涤缓冲液)时，总是激活磁体。可以通过经由SEAP-激活的化学发光来进行定量；备选地，可以用吖啶鎓酯来标记检测受体。
根据本发明的一个实施方案，也可以这样地实施刺激性自身抗体的测定，从而使得能够进行测量，其中作为用于结合刺激性自身抗体的TSH受体，使用具有野生型受体(而非TSH受体嵌合体)的细胞外结构域的TSH受体蛋白。可以从由此测得的测量值中减去在用TSH受体嵌合体进行的测量中对于刺激性自身抗体所测得的值。以该方式，还捕获了非刺激性自身抗体，例如阻断性和中性自身抗体。这对于临床诊断可以是重要的。
如果将根据本发明的方法用于分析可证明地具有需要治疗的严重的甲状腺机能减退的患者的具有阻断性自身抗体的血清，那么这些用根据本发明的方法是不可检测的。这也涉及根据本发明的方法的特异性。
通过下面的实施例来进一步阐明本发明。
实施例1(TSH受体嵌合体的获得)
材料
为了克隆TSH受体嵌合体，使用来自D.L.Segaloff博士(The University ofIowa,USA)的质粒pcDNA3-rLHR(B9)。
根据在Biochem Biophys Res Commun.(1991),179:70-77中的描述来构建其中部分序列被大鼠LH-CGR的相应序列替代的TSH受体嵌合体。在这种情况下，TSHR的氨基酸261至370被大鼠LH-CGR的相对等的氨基酸261至329替代。
根据常用的克隆方法用常用试剂来制备根据本发明的TSH受体嵌合体及其野生型变体。
作为细胞提取物的融合蛋白HSA2-TSHR-ECD-B-330-mAb1或TSHR/LH-CGR-SEAP的表达和获得
在平板中培养汇合的稳定的CHO-K1细胞或HEK293细胞。收集上清液(大约8mg/ml的总蛋白质)，并保存于-70℃。可以将如此获得的上清液在测定方法中分别作为HSA2-TSHR-ECD-B-330-mAb1、TSHR-SEAP或TSHR/LH-CGR-SEAP进行使用。
分泌型的细胞外融合TSHR嵌合体的获得
所述融合TSH-R嵌合体的截短的细胞外结构域由表达它们的细胞分泌入培养物上清液中。所分泌的受体蛋白质以在检定缓冲液中的确定稀释物的形式直接在该试验中进行使用。例如，每个测定使用10μl的细胞外SEAP-TSH-R嵌合体B，其来自5ml的以1:10的最终稀释度的培养物上清液。
将锚抗体偶联至顺磁性颗粒
取10mg(330μL)经甲苯磺酰化的
将第一TSH受体嵌合体(锚受体)偶联在顺磁性颗粒上
将30μL的包含有在缓冲液(PBS pH 7.4，0.1％BSA，0.1％Tween20)中的20mg/mL的与锚抗体相偶联的
实施例2(根据本发明的测试的施行)
在3小时之内从静脉血中获得血清样品或血浆样品。在4℃下贮存经过7天的时间段或在-20℃下贮存1至2年是可能的。将第二抗体(参见上面)保存于-20℃，并在用于该测试中之前在室温下进行融化。将TSH受体嵌合体在微量滴定板上冻干贮存，并在使用之前在具有蛋白质稳定剂的缓冲液中进行重构。
每个2mL的反应容器，将30μL的包含有在洗涤缓冲液(PBS pH7.4，0.1％BSA)中的20mg/mL的与锚受体相偶联的
经sTRAb-DERA校准的标准系列的行为
为了制成标准系列，使用具有经标准化的自身抗体浓度的标准溶液WHO 90/672。标准品的起始溶液包含100IU/l，将其进行稀释以为了制成标准曲线的目的。作为零值，使用在TXBW缓冲液中的没有自身抗体的受检者的血清。
将所使用的用于结合刺激性自身抗体的TSH受体嵌合体通过抗体固定在
将50μl样品溶液(标准品的稀释物和零样品)/孔用稀释缓冲液以1:2进行稀释，并在微量滴定板上在室温(大约22℃)下温育90分钟。将它每次用300μl TXWB洗涤四次。然后，进行10μl的1:100稀释物向90μl TXWB中的添加，所述1:100稀释物来自5ml的与酶SEAP相融合的细胞外TSH受体嵌合体的直径为10cm的培养皿的培养物上清液。然后，在摇动(300-400rpm)下在37℃下温育30分钟。然后，用300μl TXWB洗涤四次。通过使用AppliedBiosystems(Foster City,CA,USA)的
检测极限位于大约0.2IU/l。在延伸至至少40IU/l的范围内，关于刺激性自身抗体，在相对光单位(RLU＝Relative Light Unit)和标准品的浓度之间存在多项式函数。
实施例3(比较实施例)
在该实施例中，根据EP 1 929 311 B1，一方面使用两个经截短的TSH受体嵌合体，和另一方面使用全受体嵌合体作为锚受体和使用经截短的受体嵌合体(ECD)作为信号受体。将锚受体嵌合体固定在微量滴定板的塑料壁上。
在微量滴定板(MTP 96-孔)上，以10μg/ml，将锚抗体(10.75mM柠檬酸；69mMHEPES；50％甘油；pH 7.0)在碳酸盐缓冲液(100mM NaCO3/NaHCO3pH>蛋白酶抑制剂中)以500μg/ml(直至2000μg/ml，取决于受体嵌合体)的总蛋白质浓度进行使用。在依赖于克隆地限定的上清液产生后，将分泌型ECD-受体嵌合体作为细胞培养物上清液(在RPMI 1640；10％FCS；1％青霉素/链霉素[10,000U，10,000μg/ml]中)以在检定缓冲液中的10-100％的浓度进行使用。接着是用检定缓冲液来进行的四次洗涤(300μl/孔)。可选地，MTP的冻干干燥是可能的。为此，用检定缓冲液来进行在锚受体温育后的洗涤仅两次，随后是用冻干缓冲液(50mM HEPES-NaOH pH6.5；0.1％Triton X-100；5％奶粉；3％山梨糖醇)来进行两次洗涤。最后一个洗涤步骤以延长的MTP温育时间(5-10分钟)来进行。将MTP立刻在氮气相(-180℃至-130℃)中速冻(最少温育30分钟)，然后进行冻干(0.011mbar/-60℃，4-24小时，取决于MTP的数目)。
患者血清的温育(任选地在经干燥的MTP在检定缓冲液中重构5-10分钟之后)以在检定缓冲液中1:2稀释的形式在20-24℃下在摇动(300rpm)下进行90分钟。为了去除未结合的材料，用检定缓冲液洗涤四次。检测受体的温育在检定缓冲液中在摇动(300rpm)下进行30分钟，其中在分泌型ECD-受体嵌合体的情况下在37℃下进行和在全受体嵌合体的情况下在20-24℃下进行。所使用的浓度在全受体嵌合体的细胞提取物的情况下为1000μg/ml的总蛋白质(直至3000μg/ml，取决于受体嵌合体)，和在分泌型ECD-受体嵌合体的情况下为10-100％(取决于克隆)，在依赖于克隆地限定的上清液产生后。然后，每次用300μl检定缓冲液/孔洗涤四次。通过添加底物(135μΜ CDP-Star或备选地AP-底物，1:1.5[直至3]，在1.0M二乙醇胺pH 9.8；0.5mM MgCl2；0.0001％二甲苯腈蓝中)并且在20-24℃下在摇动(300rpm)下温育30分钟并随后在微量滴定板光度计中进行定量来进行检测。
检测受体嵌合体的稳定性测量通过预温育经过各种不同的时间段并随后在桥式测定法中使用来进行，其中将锚受体嵌合体如在作为本申请的基础的桥式测定法中那样进行处理，即以类似于亲和层析的方式结合在固相上。
所述比较的测量结果为微量滴定板试验。结果显示在图5中。将微量滴定板在4℃下用在其上结合锚受体嵌合体(全受体嵌合体或ECD-受体嵌合体(比较))的抗体进行包被。与患者血清一起进行的温育在室温下进行。
最后，在图4中的所测得的测量值曲线为两个校准曲线，其中使用描绘在纵坐标上的商“B/B0(结合的/未结合的)”，以便排除结果中的非特异性结合。在横坐标上，标出了经标准化的样品的自身抗体单位。
粗线印刷的曲线显示了具有结合在固相上的第一TSH受体嵌合体(全受体嵌合体)和仅包含全受体的细胞外部分的第二的经截短的TSH受体嵌合体(ECD-受体嵌合体)(作为信号受体)的实施方案。在细线印刷的曲线的情况下，作为锚受体嵌合体，同样也使用经截短的受体嵌合体(ECD-受体嵌合体)，以代替结合在固相上的第一TSH受体嵌合体(全受体嵌合体)。
这两个曲线线路的比较显示出在自身抗体与全受体嵌合体或经截短的受体嵌合体的结合行为方面的明显区别。采用两个ECD-受体嵌合体(锚受体和信号受体为ECD-受体嵌合体)的样品的测量值曲线是“锯齿状的”，是不可重现的，并且未提供所需要的灵敏度和特异性。它特别地不适合于宽的浓度范围。因此，使用一个作为锚受体的全受体嵌合体和另一个全受体嵌合体既不适合于微量滴定板试验，也不适合于在自动装置上的测定。
序列表
<110> Ulrich Loos
<120> 针对TSH受体的自身抗体的检测
<130> 111270EP
<160> 6
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 1728
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..1728
<223> /mol_type="未分配的DNA"
/note="序列1"
/organism="人工序列"
<400> 1
gatatcctag cttttctctt ctgtcaaccc cacacgcctt tggcacagat atcacaatga 60
agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc aggggtgtgt 120
ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg ggagaagaaa 180
atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt ccatttgaag 240
atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt gctgatgagt 300
cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta tgcacagttg 360
caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa gaacctgaga 420
gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga ttggtgagac 480
cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt ttgaaaaaat 540
acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc cttttctttg 600
ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa gctgcctgcc 660
tgttgccaaa gctcactagt ggaatggggt gttcgtctcc accctgcgag tgccatcagg 720
aggaggactt cagagtcacc tgcaaggata ttcaacgcat ccccagctta ccgcccagta 780
cgcagactct gaagcttatt gagactcacc tgagaactat tccaagtcat gcattttcta 840
atctgcccaa tatttccaga atctacgtat ctatagatgt gactctgcag cagctggaat 900
cacactcctt ctacaatttg agtaaagtga ctcacataga aattcggaat accaggaact 960
taacttacat agaccctgat gccctcaaag agctccccct cctaaagttc cttggcattt 1020
tcaacactgg acttaaaatg ttccctgacc tgaccaaagt ttattccact gatatattct 1080
ttatacttga aattacagac aacccttaca tgacgtcaat ccctgtgaat gcttttcagg 1140
gactatgcaa tgaaaccttg acactgaagc tgtacaacaa tggctttact tcagtccaag 1200
gatatgcttt caatgggaca aagctggatg ctgtttacct aaacaagaat aaatacctga 1260
cagttattga caaagatgca tttggaggag tatacagtgg accaagcttg ctggacgtgt 1320
ctcaaaccag tgtcactgcc cttccatcca aaggcctgga gcacctgaag gaactgatag 1380
caagaaacac ctggactctt aagaaaacac tgccctccaa agaaaaattc acgagcctcc 1440
tggtcgccac gctgacctac cccagccact gctgcgcctt caggaatttg ccgaagaaag 1500
aacagaattt ttcattttcc atttttgaaa acttctccaa acaatgcgaa agcacagtta 1560
gaaaagcaga taacgagacg ctttattccg ccatctttga ggagaatgaa gctagcatct 1620
gtaaacgcca ggctcaggca taccgggggc agagggttcc tccaaagaac agcactgata 1680
ttcaggttca aaaggttacc taaggatcca ctagtcagtg tgctggaa1728
<210> 2
<211> 1570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列2
<400> 2
Thr Tyr Arg Pro Arg Ser Glu Arg Pro His Glu Ser Glu Arg Leu Glu
1 5 1015
Leu Glu Ser Glu Arg Thr His Arg Pro Arg His Ile Ser Ala Leu Ala
202530
Pro His Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Thr
354045
His Arg Met Glu Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Pro Val Ala Leu Thr His
505560
Arg Pro His Glu Ile Leu Glu Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro His
65707580
Glu Leu Glu Pro His Glu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala Thr
859095
Tyr Arg Ser Glu Arg Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Val Ala Leu Pro His
100 105 110
Glu Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Ser Pro Ala Leu Ala His Ile Ser
115 120 125
Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala His Ile
130 135 140
Ser Ala Arg Gly Pro His Glu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Glu Gly
145 150 155 160
Leu Tyr Gly Leu Gly Leu Ala Ser Asn Pro His Glu Leu Tyr Ser Ala
165 170 175
Leu Ala Leu Glu Val Ala Leu Leu Glu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Pro
180 185 190
His Glu Ala Leu Ala Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Asn
195 200 205
Gly Leu Asn Cys Tyr Ser Pro Arg Pro His Glu Gly Leu Ala Ser Pro
210 215 220
His Ile Ser Val Ala Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser
225 230 235 240
Asn Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Pro His Glu Ala Leu
245 250 255
Ala Leu Tyr Ser Thr His Arg Cys Tyr Ser Val Ala Leu Ala Leu Ala
260 265 270
Ala Ser Pro Gly Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ser Asn
275 280 285
Cys Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Glu His Ile
290 295 300
Ser Thr His Arg Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Leu Glu Cys Tyr Ser Thr His Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala
325 330 335
Thr His Arg Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Thr His Arg Thr Tyr Arg
340 345 350
Gly Leu Tyr Gly Leu Met Glu Thr Ala Leu Ala Ala Ser Pro Cys Tyr
355 360 365
Ser Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gly Leu Pro
370 375 380
Arg Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Gly Leu Cys Tyr Ser Pro His
385 390 395 400
Glu Leu Glu Gly Leu Asn His Ile Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala
405 410 415
Ser Pro Ala Ser Asn Pro Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Arg
420 425 430
Gly Leu Glu Val Ala Leu Ala Arg Gly Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu
435 440 445
Ala Ser Pro Val Ala Leu Met Glu Thr Cys Tyr Ser Thr His Arg Ala
450 455 460
Leu Ala Pro His Glu His Ile Ser Ala Ser Pro Ala Ser Asn Gly Leu
465 470 475 480
Gly Leu Thr His Arg Pro His Glu Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser
485 490 495
Thr Tyr Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ile Leu Glu Ala Leu Ala
500 505 510
Ala Arg Gly Ala Arg Gly His Ile Ser Pro Arg Thr Tyr Arg Pro His
515 520 525
Glu Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Pro
530 535 540
His Glu Pro His Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Thr Tyr
545 550 555 560
Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro His Glu Thr His Arg
565 570 575
Gly Leu Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Gly Leu Asn Ala Leu Ala Ala Leu
580 585 590
Ala Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Leu Ala Cys Tyr Ser
595 600 605
Leu Glu Leu Glu Pro Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Ser Glu
610 615 620
Arg Gly Leu Tyr Met Glu Thr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg
625 630 635 640
Ser Glu Arg Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Cys Tyr Ser His
645 650 655
Ile Ser Gly Leu Asn Gly Leu Gly Leu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala
660 665 670
Arg Gly Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ser
675 680 685
Pro Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ile Leu Glu Pro Arg Ser
690 695 700
Glu Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu
705 710 715 720
Asn Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu
725 730 735
Thr His Arg His Ile Ser Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Ile Leu
740 745 750
Glu Pro Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Ala Leu Ala Pro His Glu Ser
755 760 765
Glu Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ser
770 775 780
Glu Arg Ala Arg Gly Ile Leu Glu Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ser Glu
785 790 795 800
Arg Ile Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Gly
805 810 815
Leu Asn Gly Leu Asn Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg His Ile Ser Ser
820 825 830
Glu Arg Pro His Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glu Arg
835 840 845
Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Gly
850 855 860
Leu Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly
865 870 875 880
Ala Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Ala Ser
885 890 895
Pro Pro Arg Ala Ser Pro Ala Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu
900 905 910
Leu Glu Pro Arg Leu Glu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu
915 920 925
Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Asn Thr His Arg Gly
930 935 940
Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala
945 950 955 960
Ser Pro Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr Tyr Arg
965 970 975
Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Pro His Glu Pro
980 985 990
His Glu Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Ala
995 10001005
Ser Pro Ala Ser Asn Pro Arg Thr Tyr Arg Met Glu Thr Thr His Arg
101010151020
Ser Glu Arg Ile Leu Glu Pro Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Leu
1025103010351040
Ala Pro His Glu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Leu Glu Cys Tyr Ser Ala
104510501055
Ser Asn Gly Leu Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr
106010651070
Ser Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Pro
107510801085
His Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Gly Leu
109010951100
Tyr Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Pro His Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr
1105111011151120
Thr His Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala
112511301135
Leu Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Leu
114011451150
Tyr Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu
115511601165
Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Gly
117011751180
Leu Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu
1185119011951200
Tyr Pro Arg Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu
120512101215
Ser Glu Arg Gly Leu Asn Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr
122012251230
His Arg Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly
123512401245
Leu Tyr Leu Glu Gly Leu His Ile Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu
125012551260
Leu Glu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His
1265127012751280
Arg Thr Arg Pro Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr
128512901295
His Arg Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Tyr
130013051310
Ser Pro His Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Val Ala
131513201325
Leu Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Pro
133013351340
Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Ala Leu Ala
1345135013551360
Pro His Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Leu Tyr Ser
136513701375
Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Ser Glu
138013851390
Arg Pro His Glu Ser Glu Arg Ile Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Ala
139514001405
Ser Asn Pro His Glu Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Cys Tyr
141014151420
Ser Gly Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Val Ala Leu Ala Arg Gly Leu
1425143014351440
Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ala Ser Asn Gly Leu Thr His Arg
144514501455
Leu Glu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ile Leu Glu Pro His
146014651470
Glu Gly Leu Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu Ala Leu Ala Ser Glu Arg
147514801485
Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Gly Leu Asn Ala
149014951500
Leu Ala Gly Leu Asn Ala Leu Ala Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Gly Leu
1505151015151520
Tyr Gly Leu Asn Ala Arg Gly Val Ala Leu Pro Arg Pro Arg Leu Tyr
152515301535
Ser Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu
154015451550
Gly Leu Asn Val Ala Leu Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr
155515601565
His Arg
1570
<210> 3
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列3
<400> 3
Gly Leu Tyr Met Glu Thr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ser
1 5 1015
Glu Arg Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Cys Tyr Ser His Ile
202530
Ser Gly Leu Asn Gly Leu Gly Leu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Arg
354045
Gly Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Pro
505560
Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ile Leu Glu Pro Arg Ser Glu
65707580
Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Asn
859095
Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu Thr
100 105 110
His Arg His Ile Ser Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Ile Leu Glu
115 120 125
Pro Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Ala Leu Ala Pro His Glu Ser Glu
130 135 140
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ser Glu
145 150 155 160
Arg Ala Arg Gly Ile Leu Glu Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg
165 170 175
Ile Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Gly Leu
180 185 190
Asn Gly Leu Asn Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu
195 200 205
Arg Pro His Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glu Arg Leu
210 215 220
Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Gly Leu
225 230 235 240
Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly Ala
245 250 255
Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Ala Ser Pro
260 265 270
Pro Arg Ala Ser Pro Ala Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Pro Arg Leu Glu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu Gly
290 295 300
Leu Tyr Ile Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Asn Thr His Arg Gly Leu
305 310 315 320
Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala Ser
325 330 335
Pro Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser
340 345 350
Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Pro His Glu Pro His
355 360 365
Glu Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Ala Ser
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Pro Arg Thr Tyr Arg Met Glu Thr Thr His Arg Ser
385 390 395 400
Glu Arg Ile Leu Glu Pro Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Leu Ala
405 410 415
Pro His Glu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser
420 425 430
Asn Gly Leu Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser
435 440 445
Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Pro His
450 455 460
Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr
465 470 475 480
Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Pro His Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr
485 490 495
His Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu
500 505 510
Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Tyr
515 520 525
Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu Ala
530 535 540
Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu
545 550 555 560
Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr
565 570 575
Pro Arg Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser
580 585 590
Glu Arg Gly Leu Asn Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His
595 600 605
Arg Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu
610 615 620
Tyr Leu Glu Gly Leu His Ile Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu
625 630 635 640
Glu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg
645 650 655
Thr Arg Pro Thr His Arg Leu Glu
660
<210> 4
<211> 857
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列4
<400> 4
Gly Leu Tyr Met Glu Thr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ser
1 5 1015
Glu Arg Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Cys Tyr Ser His Ile
202530
Ser Gly Leu Asn Gly Leu Gly Leu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Arg
354045
Gly Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Pro
505560
Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ile Leu Glu Pro Arg Ser Glu
65707580
Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Asn
859095
Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu Thr
100 105 110
His Arg His Ile Ser Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Ile Leu Glu
115 120 125
Pro Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Ala Leu Ala Pro His Glu Ser Glu
130 135 140
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ser Glu
145 150 155 160
Arg Ala Arg Gly Ile Leu Glu Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg
165 170 175
Ile Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Gly Leu
180 185 190
Asn Gly Leu Asn Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu
195 200 205
Arg Pro His Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glu Arg Leu
210 215 220
Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Gly Leu
225 230 235 240
Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly Ala
245 250 255
Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Ala Ser Pro
260 265 270
Pro Arg Ala Ser Pro Ala Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Pro Arg Leu Glu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu Gly
290 295 300
Leu Tyr Ile Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Asn Thr His Arg Gly Leu
305 310 315 320
Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala Ser
325 330 335
Pro Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser
340 345 350
Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Pro His Glu Pro His
355 360 365
Glu Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Ala Ser
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Pro Arg Thr Tyr Arg Met Glu Thr Thr His Arg Ser
385 390 395 400
Glu Arg Ile Leu Glu Pro Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Leu Ala
405 410 415
Pro His Glu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser
420 425 430
Asn Gly Leu Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser
435 440 445
Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Pro His
450 455 460
Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr
465 470 475 480
Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Pro His Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr
485 490 495
His Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu
500 505 510
Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Tyr
515 520 525
Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu Ala
530 535 540
Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu
545 550 555 560
Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr
565 570 575
Pro Arg Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser
580 585 590
Glu Arg Gly Leu Asn Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His
595 600 605
Arg Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu
610 615 620
Tyr Leu Glu Gly Leu His Ile Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu
625 630 635 640
Glu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg
645 650 655
Thr Arg Pro Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr His
660 665 670
Arg Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Tyr Ser
675 680 685
Pro His Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Val Ala Leu
690 695 700
Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Pro Arg
705 710 715 720
Ser Glu Arg His Ile Ser Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Pro
725 730 735
His Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Leu Tyr Ser Leu
740 745 750
Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Ser Glu Arg
755 760 765
Pro His Glu Ser Glu Arg Ile Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Ala Ser
770 775 780
Asn Pro His Glu Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Cys Tyr Ser
785 790 795 800
Gly Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Val Ala Leu Ala Arg Gly Leu Tyr
805 810 815
Ser Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ala Ser Asn Gly Leu Thr His Arg Leu
820 825 830
Glu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ile Leu Glu Pro His Glu
835 840 845
Gly Leu Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu
850 855
<210> 5
<211> 2012
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..2012
<223> /mol_type="未分配的DNA"
/note="序列"
/organism="人工序列"
<400> 5
gatatcctag cttttctctt ctgtcaaccc cacacgcctt tggcacagat atcacaatga 60
agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc aggggtgtgt 120
ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg ggagaagaaa 180
atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt ccatttgaag 240
atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt gctgatgagt 300
cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta tgcacagttg 360
caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa gaacctgaga 420
gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga ttggtgagac 480
cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt ttgaaaaaat 540
acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc cttttctttg 600
ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa gctgcctgcc 660
tgttgccaaa gctcatgagg ccggcggact tgctgcagct ggtgctgctg ctcgacctgc 720
ccagggacct gggcggaatg gggtgttcgt ctccaccctg cgagtgccat caggaggagg 780
acttcagagt cacctgcaag gatattcaac gcatccccag cttaccgccc agtacgcaga 840
ctctgaagct tattgagact cacctgagaa ctattccaag tcatgcattt tctaatctgc 900
ccaatatttc cagaatctac gtatctatag atgtgactct gcagcagctg gaatcacact 960
ccttctacaa tttgagtaaa gtgactcaca tagaaattcg gaataccagg aacttaactt 1020
acatagaccc tgatgccctc aaagagctcc ccctcctaaa gttccttggc attttcaaca 1080
ctggacttaa aatgttccct gacctgacca aagtttattc cactgatata ttctttatac 1140
ttgaaattac agacaaccct tacatgacgt caatccctgt gaatgctttt cagggactat 1200
gcaatgaaac cttgacactg aagctgtaca acaatggctt tacttcagtc caaggatatg 1260
ctttcaatgg gacaaagctg gatgctgttt acctaaacaa gaataaatac ctgacagtta 1320
ttgacaaaga tgcatttgga ggagtataca gtggaccaag cttgctggac gtgtctcaaa 1380
ccagtgtcac tgcccttcca tccaaaggcc tggagcacct gaaggaactg atagcaagaa 1440
acacctggac tcttaagaaa cttccacttt ccttgagttt ccttcacctc acacgggctg 1500
acctttctta cccaagccac tgctgtgctt ttaagaatca gaagaaaatc agaggaatcc 1560
ttgagtcctt gatgtgtaat gagagcagta tgcagagctt gcgccagaga aaatctgtga 1620
atgccttgaa tagccccctc caccaggaat atgaagagaa tctgggtgac agcattgttg 1680
ggtacaagga aaagtccaag ttccaggata ctcataacaa cgctcattat tacgtcttct 1740
ttgaagaaca agaggatgag atcattggtt ttggccagga gctcaaaaac ccccaggaag 1800
agactctaca agcttttgac agccattatg actacaccat atgtggggac agtgaagaca 1860
tggtgtgtac ccccaagtcc gatgagttca acccgtgtga agacataatg ggctacaagt 1920
tcctgagaat ctgtaaacgc caggctcagg cataccgggg gcagagggtt cctccaaaga 1980
acagcactga tattcaggtt caaaaggtta cc 2012
<210> 6
<211> 1802
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列6
<400> 6
Met Glu Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Pro Val Ala Leu Thr His Arg Pro
1 5 1015
His Glu Ile Leu Glu Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro His Glu Leu
202530
Glu Pro His Glu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala Thr Tyr Arg
354045
Ser Glu Arg Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Val Ala Leu Pro His Glu Ala
505560
Arg Gly Ala Arg Gly Ala Ser Pro Ala Leu Ala His Ile Ser Leu Tyr
65707580
Ser Ser Glu Arg Gly Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala His Ile Ser Ala
859095
Arg Gly Pro His Glu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Glu Gly Leu Tyr
100 105 110
Gly Leu Gly Leu Ala Ser Asn Pro His Glu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala
115 120 125
Leu Glu Val Ala Leu Leu Glu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Pro His Glu
130 135 140
Ala Leu Ala Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Asn Gly Leu
145 150 155 160
Asn Cys Tyr Ser Pro Arg Pro His Glu Gly Leu Ala Ser Pro His Ile
165 170 175
Ser Val Ala Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly
180 185 190
Leu Val Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Pro His Glu Ala Leu Ala Leu
195 200 205
Tyr Ser Thr His Arg Cys Tyr Ser Val Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ser
210 215 220
Pro Gly Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ser Asn Cys Tyr
225 230 235 240
Ser Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Glu His Ile Ser Thr
245 250 255
His Arg Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Leu Tyr Ser
260 265 270
Leu Glu Cys Tyr Ser Thr His Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala Thr His
275 280 285
Arg Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Thr His Arg Thr Tyr Arg Gly Leu
290 295 300
Tyr Gly Leu Met Glu Thr Ala Leu Ala Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Cys
305 310 315 320
Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gly Leu Pro Arg Gly
325 330 335
Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Gly Leu Cys Tyr Ser Pro His Glu Leu
340 345 350
Glu Gly Leu Asn His Ile Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Ser Pro
355 360 365
Ala Ser Asn Pro Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Arg Gly Leu
370 375 380
Glu Val Ala Leu Ala Arg Gly Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Ala Ser
385 390 395 400
Pro Val Ala Leu Met Glu Thr Cys Tyr Ser Thr His Arg Ala Leu Ala
405 410 415
Pro His Glu His Ile Ser Ala Ser Pro Ala Ser Asn Gly Leu Gly Leu
420 425 430
Thr His Arg Pro His Glu Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr Tyr
435 440 445
Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg
450 455 460
Gly Ala Arg Gly His Ile Ser Pro Arg Thr Tyr Arg Pro His Glu Thr
465 470 475 480
Tyr Arg Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Pro His Glu
485 490 495
Pro His Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Thr Tyr Arg Leu
500 505 510
Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro His Glu Thr His Arg Gly Leu
515 520 525
Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Gly Leu Asn Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala
530 535 540
Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Glu
545 550 555 560
Leu Glu Pro Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Met Glu Thr Ala Arg Gly Pro
565 570 575
Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro Leu Glu Leu Glu Gly Leu Asn Leu Glu
580 585 590
Val Ala Leu Leu Glu Leu Glu Leu Glu Ala Ser Pro Leu Glu Pro Arg
595 600 605
Ala Arg Gly Ala Ser Pro Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Met Glu
610 615 620
Thr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ser Glu Arg Pro Arg Pro
625 630 635 640
Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Cys Tyr Ser His Ile Ser Gly Leu Asn Gly
645 650 655
Leu Gly Leu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Arg Gly Val Ala Leu Thr
660 665 670
His Arg Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ile Leu Glu Gly Leu
675 680 685
Asn Ala Arg Gly Ile Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Glu Pro Arg
690 695 700
Pro Arg Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Thr His Arg Leu Glu
705 710 715 720
Leu Tyr Ser Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu Thr His Arg His Ile Ser
725 730 735
Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Ile Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg
740 745 750
His Ile Ser Ala Leu Ala Pro His Glu Ser Glu Arg Ala Ser Asn Leu
755 760 765
Glu Pro Arg Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ser Glu Arg Ala Arg Gly Ile
770 775 780
Leu Glu Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Ile Leu Glu Ala Ser
785 790 795 800
Pro Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Gly Leu Asn Gly Leu Asn Leu
805 810 815
Glu Gly Leu Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu Arg Pro His Glu Thr
820 825 830
Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu
835 840 845
Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Gly Leu Ile Leu Glu Ala Arg
850 855 860
Gly Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr
865 870 875 880
His Arg Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Ala Ser Pro Pro Arg Ala Ser Pro
885 890 895
Ala Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Glu Pro Arg Leu Glu
900 905 910
Leu Glu Leu Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Ile Leu Glu
915 920 925
Pro His Glu Ala Ser Asn Thr His Arg Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr
930 935 940
Ser Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala Ser Pro Leu Glu Thr His
945 950 955 960
Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Thr His Arg
965 970 975
Ala Ser Pro Ile Leu Glu Pro His Glu Pro His Glu Ile Leu Glu Leu
980 985 990
Glu Gly Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Ala Ser Pro Ala Ser Asn Pro
995 10001005
Arg Thr Tyr Arg Met Glu Thr Thr His Arg Ser Glu Arg Ile Leu Glu
101010151020
Pro Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu
1025103010351040
Asn Gly Leu Tyr Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Thr His
104510501055
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106010651070
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107510801085
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109010951100
Ala Pro His Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr His Arg Leu Tyr Ser
1105111011151120
Leu Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Tyr Arg Leu Glu
112511301135
Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Leu
114011451150
Glu Thr His Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser
115511601165
Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Val
117011751180
Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Pro Arg Ser Glu Arg
1185119011951200
Leu Glu Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser Glu Arg Gly Leu Asn
120512101215
Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His Arg Ala Leu Ala Leu
122012251230
Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Leu Glu Gly Leu
123512401245
His Ile Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Glu Ile Leu Glu Ala
125012551260
Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg Thr Arg Pro Thr His
1265127012751280
Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Glu Pro Arg Leu Glu Ser
128512901295
Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Pro His Glu Leu Glu His Ile Ser Leu
130013051310
Glu Thr His Arg Ala Arg Gly Ala Leu Ala Ala Ser Pro Leu Glu Ser
131513201325
Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Cys Tyr Ser
133013351340
Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Pro His Glu Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly
1345135013551360
Leu Asn Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu
136513701375
Tyr Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg Leu Glu Met Glu Thr
138013851390
Cys Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Met Glu
139514001405
Thr Gly Leu Asn Ser Glu Arg Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Asn Ala
141014151420
Arg Gly Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Leu
1425143014351440
Ala Leu Glu Ala Ser Asn Ser Glu Arg Pro Arg Leu Glu His Ile Ser
144514501455
Gly Leu Asn Gly Leu Thr Tyr Arg Gly Leu Gly Leu Ala Ser Asn Leu
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Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Ser Glu Arg Ile Leu Glu Val Ala Leu
147514801485
Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Tyr Ser Ser Glu
149014951500
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1505151015151520
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Arg Thr His Arg Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Ser Pro
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1745175017551760
Ala Leu Pro Arg Pro Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr
176517701775
His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Gly Leu Asn Val Ala Leu Gly Leu
178017851790
Asn Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg
17951800
机译： 一种通过选择性免疫沉淀，用于执行该方法的融合蛋白以及在该方法中使用标记的tsh-受体-嵌合体来确定各种针对tsh-受体的自身抗体的方法
机译： 针对TSH受体的自身抗体检测
机译： 检测和/或定量针对重组多肽和TSH受体的自身抗体的方法
