ZnO@（VI‑co‑PEGMA‑co‑FA）量子点纳米材料及其制备和应用

摘要

本发明提供了一种ZnO@(VI‑co‑PEGMA‑co‑FA) 量子点，是以亲水性的N‑乙烯基咪唑和聚乙二醇甲基丙烯酸酯为起始原料，通过RAFT聚合法制得具有与Zn2+配位作用的大分子RAFT试剂，再使大分子RAFT试剂与功能化的叶酸通过RAFT聚合得到具有肿瘤内叶酸受体靶向作用的聚合物外壳，然后与ZnO纳米颗粒通过配位形成以ZnO纳米颗粒为核的水溶性荧光量子点纳米材料，具有肿瘤主动靶向性和很高的pH敏感性，可主动靶向肿瘤细胞并在pH值小于5.5时分解释放负载的抗癌药物，从而实现智能释放药物。另外，载药量子点体现出良好的生物相容性，毒性小，减少对正常组织的伤害，作为药物载体具有潜在的应用价值。

说明书

技术领域

发明涉及一种靶向水溶性的ZnO量子点纳米材料，尤其涉及一种ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料及其制备方法；本发明同时涉及该ZnO量子点纳米材料为药物载体的应用在制备抗肿瘤药中的应用，属于纳米材料制备和生物医学领域。

背景技术

近年来，癌症类疾病已经成为严重威胁人类生命的重大疾病，癌症发病率呈逐年增高的态势。相对于传统小分子化疗药物在治疗过程中的弊端，使得高分子聚合物载体被应用在癌症的治疗中成为可能。制备可以选择性释放药物的载药载体不仅可以降低小分子药物的毒副作用，延长作用时间，而且可以通过EPR效应增加肿瘤细胞内药物累积，减少副作用，降低抗药性。尤其是连有靶向基团的智能高分子载体的出现，使得药物直接输送到癌细胞内，有倾向的在肿瘤部位累积，大大减少对正常细胞的毒害，减轻毒副作用。

由于量子点具有优越的光学性质：更尖锐的光谱，发光稳定性和高量子产率，使得发光半导体量子点（QDs）是生物和纳米医学领域有前途的候选人 。像CdS 和CdTe量子点纳米颗粒已经被广泛研究并用于体内生物成像。ZnO量子点，由于具有无毒性，良好生物相容性，价格低廉易制备，低成本，并对pH敏感等优点，作为新型纳米材料日益受到研究者的重视。据报道，肿瘤细胞外环境（pH 6.0~7.2）比血液和正常组织（pH 7.4）低而显酸性，内涵体及溶酶体中的pH甚至低达5.0~5.5，而氧化锌量子点在pH值为7.4时是稳定的，但当pH值小于5.5时分解，转换成可被人体吸收的锌离子。ZnO量子点溶解后会表现出显著的细胞低毒性和优先杀死的癌细胞的效应，所以负载抗癌药物药的ZnO量子点的可实现协同抗肿瘤活性。

PEG已被广泛认为其可以作为一种有效的可生物降解，生物相容性良好的药物运输载体，将其作为聚合物的亲水段可提高聚合物在水中的溶解性和稳定性，同时也减少内皮组织系统的非特异性摄取量；延长药物在体内的循环时间，增强在肿瘤靶点部位的滞留效率，已被作为肿瘤靶向药物载体应用于临床试验。

聚咪唑（PVI）是一类亲水性聚合物，其咪唑基团的氮原子通常与Cu²⁺，Co^{>，Ni2+，Cd2+>，Mn2+>}

由于叶酸受体在一部分肿瘤细胞表面过度表达，其能够通过内吞作用将叶酸摄入真核细胞中。已证实叶酸受体在多种肿瘤细胞内过度表达，当叶酸摄入量受限时，肿瘤细胞摄入叶酸的能力要强得多，因此叶酸可以作为靶向药物载体的配体。

因此，水溶性好的聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PEG）与乙烯基咪唑（VI）共聚后与ZnO量子点表面的锌离子配位，可以避免了量子点在水溶液中团聚，且消除表面缺陷，从而得到水溶性良好的且具有较高量子产率的量子点。另外叶酸的加入使抗肿瘤活性进一步得到提升，以促进聚合物对肿瘤的主动靶向抑制作用，同时体现出良好的生物相溶性，以减少对正常组织的伤害，有望为抗癌药物的制备提供更多的选择。

发明内容

本发明的目的是利用量子点ZnO、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)和乙烯基咪唑(VI)的性质，提供一种具有水溶性、高量子产率、肿瘤主动靶向性的ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料；

本发明的另一目的是提供一种上述具有水溶性、高量子产率、肿瘤主动靶向性的ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料的制备方法；

本发明更重要的目的，就是提供一种具有水溶性、高量子产率、肿瘤主动靶向性的ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料作为药物载体在制备抗肿瘤药中的应用。

一、ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料的结构

本发明的ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料的结构如下：

式中：x=60~63 mol%，y=25~28 mol%，c=6~9 mol%；数均分子Mn=6.3×10³~7.4×10³。

二、ZnO(VI-co-PEGMA-co-FA) 量子点纳米材料的制备

（1）ZnO量子点的制备：将二水醋酸锌溶于无水乙醇中，于70~80℃活化反应1.5~2小时，加入氢氧化钾反应5~7分钟；再在室温下搅拌反应2~3小时，然后依次用正己烷、石油醚沉淀、离心，得到白色固体即为ZnO量子点。

氢氧化钾的作用是首先形成ZnO量子点的核结构，然后继续生长形成具有一定尺寸的ZnO量子点。二水醋酸锌与氢氧化钾的摩尔比为1:1.5~1:2。

（2）Poly(VI-co-PEGMA)大分子RAFT试剂的制备：以N’N-二甲基甲酰胺为溶剂，乙烯基咪唑、聚乙二醇甲基丙烯酸酯为反应底物，偶氮二异丁腈为引发剂，在氮气保护、RAFT试剂作用下，于60~65℃搅拌反应24~26 小时；产物在无水乙醚中沉淀，干燥，得淡黄色油状液体即为Poly(VI-co-PEGMA)大分子RAFT试剂。

RAFT试剂为2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸（DMP），其结构式为：

乙烯基咪唑、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、RAFT试剂的摩尔比为20:9:1~22:12:1。

引发剂偶氮二异丁腈的用量为反应底物总摩尔量的5%~20%。

Poly(VI-co-PEGMA)大分子RAFT试剂的结构式如下：

。

（3）Poly(VI-co-PEGMA-co-FA)共聚物的制备：以步骤（2）所得Poly(VI-co-PEGMA)大分子RAFT试剂和功能化叶酸单体为反应底物，N’N-二甲基甲酰胺为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，在氮气保护下，于60~65℃搅拌反应24~26 小时；产物用无水乙醚沉淀，干燥，得淡黄色油状液体即为Poly(VI-co-PEGMA-co-FA)共聚物；

功能化叶酸单体为FA，即叶酸单体与烯丙基氨反应形成末端含有双键的叶酸，其结构式如下：

功能化叶酸与Poly(VI-co-PEGMA)大分子RAFT试剂摩尔比为1:2~1:3。

引发剂偶氮二异丁腈的用量为反应底物总摩尔量的5%~20%。

Poly(VI-co-PEGMA-co-FA) 共聚物的结构如下：

。

（4）ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点的制备：分别将步骤（1）所得ZnO量子点和步骤（3）所得Poly(VI-co-PEGMA-co-FA) 共聚物无水乙醇中，混合后搅拌配位20~24小时，滴加蒸馏水（为了形成在水溶液中稳定的量子点），搅拌20~24小时，最后转移到透析袋中，用蒸馏水透析48~72小时；透析后的溶液即为ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料。

ZnO量子点和Poly(VI-co-PEGMA-co-FA) 共聚物的摩尔比为1:1.5~1:2；

ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)的结构如下：

式中：x=60~63 mol%，y=25~28 mol%，c=6~9 mol%；数均分子Mn=6.3×10³~7.4×10³。

图1为步骤（2）制备Poly(VI-co-PEGMA)大分子RAFT试剂的核磁共振氢谱。通过核磁共振氢谱分析可以得出，化学位移在6.75 ppm和7.25 ppm左右会出现VI上的特征峰-CH-（五元环上和-NH相连）和-CH₂（五元环上和-CH-相连），在3.62>2-）的特征峰，在1.72>2-），0.75~1.0>3)。核磁共振氢谱说明成功合成了大分子Poly(VI-co-PEGMA)。

图2为步骤（3）制备Poly(VI-co-PEGMA-co-FA)共聚物的核磁共振氢谱。通过核磁共振氢谱分析可以得出，化学位移在6.69 ppm，7.61 ppm和8.63ppm左右为叶酸杂环上所连接的H原子的出峰位置；化学位移在4.46 ppm和4.67 ppm 为叶酸上烷基连上的H原子；在1.72>2-），0.75~1.2>3)和叶酸上甲基的出峰位置。核磁共振氢谱说明成功合成了大分子Poly(VI-co-PEGMA-co-FA)，即为量子点的亲水性外壳。

图3为本发明制备的ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点材料的透射电镜图。通过图3透射电镜观察量子点的形貌与大小，在水溶液中量子点呈现球状结构且均匀分布，显示出了良好的分散性，没有出现大的聚集体，粒径平均粒径约为4 nm。

三、ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点性能测试

1、荧光光谱测试

利用荧光光谱测试ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点水溶液（1 mg/mL）的荧光性能和纯ZnO的荧光性能，如图4所示：（a）为纯ZnO的荧光光谱，其激发光谱约为360 nm，荧光发射光谱约为520 nm，呈现黄色荧光，这是经典的氧化锌缺陷发光，表明该量子点荧光性能良好；（b）为ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点的荧光光谱，通过比较，发现ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)的发射峰蓝移，并且荧光强度增强，这是ZnO与咪唑发生配位的结果，说明ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点在水溶液中荧光性能良好，可以很好的用于肿瘤部位靶向失踪和给药系统。

2、ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点的载药性能

（1）载药ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点的制备

将ZnO量子点与阿霉素的乙醇溶液混合，避光并于室温下搅拌24 h，得到载药量子点。然后将载药量子点逐滴滴入Poly(VI-co-PEGMA-co-FA)的乙醇溶液中，避光并于室温下搅拌24 h，最后往混合溶液中滴加蒸馏水，继续避光搅拌24h。最后将混合溶液装入透析袋（MWCO=3000）置于蒸馏水中透析3天，得到载药量子点。量子点与蒸馏水的质量体积比为1.0~1.2 mg/mL，量子点和阿霉素的质量比为3.0:1~3.5:1。

（2）体外药物释放性能

通过紫外分光光度计测定阿霉素在480nm处的吸收强度并计算载药胶束的药物释放率。以水溶性的ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点为药物载体，选用小分子抗癌药物（盐酸阿霉素），考察了其体外药物释放性能。在人体温度（37℃）下，考察不同pH值下载药ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点的释放性能：取两份5mL载药量子点水溶液，分别置于100 mL的pH 7.4 （100 mM）的磷酸盐缓冲溶液 与pH 5.0（100 mM） 的醋酸缓冲溶液中透析48小时，按照一定的时间间隔取样，分别测试紫外吸收（见图5）。结果表明，pH 5.0时，在48 h内阿霉素的累积释放率高达90.5%，而pH 7.4 时，阿霉素的累计释放率仅为9.1 %（见图6），表明在酸性环境下会更好的释放出阿霉素，此ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点对pH具有高度敏感性。

综上所述，本发明以亲水性的聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PEGMA）和乙烯基咪唑（VI，乙烯基咪唑上N原子的孤对电子可以与Zn²⁺上的d轨道产生配位作用）为起始原料，在引发剂的作用下，通过RAFT聚合法制得具有与Zn²⁺配位作用的大分子RAFT试剂Poly(VI-co-PEGMA)，再使大分子RAFT试剂与功能化的叶酸单体通过RAFT聚合制得可肿瘤靶向的Poly(VI-co-PEGMA-co-FA)共聚物，然后加入ZnO量子点形成以聚乙烯基咪唑-co-聚聚乙二醇甲基丙烯酸酯-co-聚叶酸为外壳，ZnO纳米颗粒为核的水溶性量子点纳米材料，一方面可发挥ZnO量子点荧光产率高，安全载药等优点；而在ZnO量子点外表面修饰高分子聚合物，既能对ZnO量子点内核进行很好的保护，同时又能使ZnO量子点高分散，高荧光产率的稳定于水溶液中，并能靶向进入癌细胞；另一方面由于ZnO量子点在弱酸性条件下容易分解，从而实现智能释放药物，加上锌离子相对于其它量子点毒性较低，对细胞的杀伤力较小。因此，载药量子点体现出良好的生物相容性，减少对正常组织的伤害。另外，ZnO(VI-co-PEGMA-co-FA)纳米药物载体不仅降低了药物的毒副作用，还能在肿瘤细胞内智能释放抗肿瘤药物，提高药物的生物利用率，作为抗肿瘤药物载体具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点中Poly(VI-co-PEGMA)的核磁共振氢谱。

图2为ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点中Poly(VI-co-PEGMA-co-FA) 的核磁共振氢谱。

图3为ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料的透射电镜图。

图4为ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA) 量子点纳米材料的荧光-发射光谱图。

图5为ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料在pH=5.0和pH=7.4时对药物（盐酸阿霉素）的模拟体外释放紫外-可见光谱图。

图6为ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点在pH=5.0和pH=7.4时对药物（盐酸阿霉素）的累积释放率曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明具有水溶性ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点的制备和药物释放性能作进一步说明。

实施例1

（1）ZnO量子点的制备：将二水醋酸锌（0.3538g，2mmol）溶于35mL无水乙醇中，于80℃活化反应2小时，加入5mL氢氧化钾（0.5mol/L），反应5~7分钟；然后室温下搅拌反应3小时，最后用正己烷、石油醚沉淀、离心2~3次，得到白色固体，即为ZnO量子点，产率为78%。

（2）Poly(VI-co-PEGMA)大分子RAFT试剂的制备：在 Schlenk 瓶中，将80.35mg(1.0mmol) VI，137.4 mg（0.274 mmol）PEGMA，10.0 mg （0.075 mmol ）AIBN和10.0 mg（0.0 2mmol） DMP溶于2 mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时，产物于无水乙醚中沉淀三次，用透析袋（MWCO=3000）与蒸馏水中透析48小时，蒸发干燥水分，即得1.5 g淡黄色固体，即得产物，产率为80%。

¹H>6,>2-CH₂-CH₂-)，3.46(s，2H，->2-CH₂-)，3.65(s，2H，-COO-CH₂-CH-)，7.85(s，1H，-N=CH-)，6.85(s，1H，-CH-CH-)，1.40-2.08>H₂- of polymer backbone)，0.61–1.24>H₃)，1.73(s，6H，-C-CH₃)。

（3）Poly(VI-co-PEGMA-co-FA)共聚物的制备：在 Schlenk 瓶中，将256.0mg Poly(VI-co-PEGMA) （0.032mmol），36mg（0.08mmol）FA 和10.0 mg （0.075 mmol ） AIBN溶于4mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时，产物于无水乙醚中沉淀三次，用透析袋（MWCO=3000）与蒸馏水中透析48小时，蒸发干燥水分，即得1.8g淡黄色固体，即得产物，产率为73.8%。

¹H>6,>2-CH₂-CH₂-)，3.46(s，2H，->2-CH₂-)，3.65(s，2H，-COO-CH₂-CH-)，7.85(s，1H，-N=CH-)，6.85(s，1H，-CH-CH-)，6.69（d，2H，->6H₂H₂-NH），7.61（d，2H，->6H₂H₂-NH），8.63（s，H，->2-C₄N₂H-CON₂CH），4.67（s，2H，->H-CH2-C₄N₂H-），4.46（s，H，CH₂-CH₂-CH-COOH）。

（4）ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点的制备：分别取232mg ZnO量子点（0.232g）（3.15 mmol ）溶于3mL无水乙醇中和160mg（0.2 mmol ） Poly(VI-co-PEGMA-co-FA) 大分子溶于2mL无水乙醇中，然后把Poly(VI-co-PEGMA-co-FA) 乙醇溶液逐滴滴加到ZnO量子点的乙醇溶液中，室温下搅拌配位24小时，然后逐滴滴加4mL蒸馏水，搅拌24小时，最后转移到透析袋（MWCO=3000）中，用蒸馏水透析72小时，透析后的黄色溶液即为ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点纳米材料。

该量子点的结构式中，x=60 mol%，y=27 mol%，c=13mol%；数均分子Mn=5.6×10³。

实施例2

（1）ZnO量子点的制备：同实施例1；

（2）Poly(VI-co-PEGMA)大分子RAFT试剂的制备：在 Schlenk 瓶中，将154.5mg(1.9mmol) VI，356.0 mg（0.712 mmol）PEGMA，20.0 mg （1.50 mmol ）AIBN和2.0 mg（0.004mmol） DMP溶于4 mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时，产物于无水乙醚中沉淀三次，用透析袋（MWCO=3000）与蒸馏水中透析48小时，蒸发干燥水分，即得3.2 g淡黄色固体，即得产物，产率为85.8%；

（3）Poly(VI-co-PEGMA-co-FA)共聚物的制备：在 Schlenk 瓶中，将327.0mg Poly(VI-co-PEGMA) （0.1663mmol），62mg（0.0136mmol）FA 和20.0 mg （0.15 mmol ） AIBN溶于4 mLDMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时，产物于无水乙醚中沉淀三次，用透析袋（MWCO=3000）与蒸馏水中透析48小时，蒸发干燥水分，即得1.3 g淡黄色固体，即得产物，产率为79.8%；

（4）ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点的制备：同实施例1。

该量子点的结构式中，x=63 mol%，y=28 mol%，c=9 mol%；数均分子Mn=6.3×10³。

实施例3

（1）ZnO量子点的制备：同实施例1；

（2）Poly(VI-co-PEGMA)大分子RAFT试剂的制备：在 Schlenk 瓶中，将303.5mg(3.2mmol) VI，400.0 mg（0.989 mmol）PEGMA，30.0 mg （2.0 mmol ）AIBN和3.0 mg（0.007mmol） DMP溶于6 mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于

65℃搅拌反应24 小时，产物于无水乙醚中沉淀三次，用透析袋（MWCO=3000）与蒸馏水中透析48小时，蒸发干燥水分，即得4.7 g淡黄色固体，即得产物，产率为85.8%；

（3）Poly(VI-co-PEGMA-co-FA)共聚物的制备：在 Schlenk 瓶中，将425.0mg Poly(VI-co-PEGMA) （0.233mmol），122mg（0.0272mmol）FA 和30.0 mg （2.0 mmol ） AIBN溶于6 mLDMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时，产物于无水乙醚中沉淀三次，用透析袋（MWCO=3000）与蒸馏水中透析48小时，蒸发干燥水分，即得1.3 g淡黄色固体，即得产物，产率为85.9%；

（4）ZnO@(VI-co-PEGMA-co-FA)量子点的制备：同实施例1。

该量子点的结构式中，x=66 mol%，y=28 mol%，c=6 mol%；数均分子Mn=7.4×10³。