一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂

摘要

本发明公开了一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂，所述方法包括：(a)使用探针对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中所述探针是双链寡核苷酸，所述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；(b)使用针对所述待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增。本方法解决了现有检测技术针对含有大量外源DNA污染的复杂样本检测灵敏度低的技术问题。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA检测技术领域，尤其涉及一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂。

背景技术

在科研、临床或健康体检等领域中进行基因检测时经常需要进行非伤害性取样，即通过获取人的毛发、指甲、粪便(含有肠道脱落细胞)、尿液、唾液、食物残渣(含有口腔脱落细胞)、呕吐物(含有消化道脱落细胞)、霉变生菌的组织或体液等复杂样本中对某一物种(通常是人)的特定DNA区域进行检测；在法医、刑侦等领域也时有发生样本保存不善或特定环境下取样的情况。这些样本成分往往及其复杂。从这些样本中提取的DNA往往含有大量的非目标物种DNA。例如，从粪便样本中提取的DNA是很多种DNA的混合物。其中大约60％的DNA来源于肠道细菌，剩余的绝大部分DNA来源于动物或植物食物残渣，可用于检测的结肠黏膜脱落细胞的DNA占总DNA的千分之一甚至更少。目前实验室常用的DNA检测方案如QPCR、时间飞行质谱、一代测序、高通量测序等都基于PCR(聚合酶链式反应)技术。而在大量的非目标物种DNA干扰存在的情况下，基于引物结合模板并延伸的PCR技术特异性会很差。从而导致以上常用的DNA检测方案会受到不同程度的影响。尤其在使用高通量测序技术对掺有大量混合物种DNA的痕量目标DNA进行目标区域测序时，需要投入大量的DNA样本，以保证痕量目标DNA有足够的拷贝数以对其准确检测。这时无用的其它物种DNA也越多，干扰作用也就越强。因此如何有效去除大量的非目标物种DNA的干扰并进行灵敏准确的特定DNA目标区域富集检测成为科研技术人员要解决的技术难题。

目前现有的技术解决方案为在DNA抽提的过程中针对细菌等原核细胞和真核细胞的特性不同进行一定程度的区分。细菌等原核细胞较真核细胞不容易裂解，所以在抽提DNA时不进行加热裂解，而采用比较温和的裂解方案就可以减少总DNA中细菌DNA的含量。但实际自然环境下细菌自身就会裂解死亡并释放DNA，并且这种技术方案针对其它真核细胞DNA没有筛选去除作用，所以该方案效果往往不是很好。

发明内容

本发明提供一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂，解决了现有检测技术针对含有大量外源DNA污染的复杂样本检测灵敏度低的技术问题。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法，包括：

(a)使用探针对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中上述探针是双链寡核苷酸，上述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；

(b)使用针对上述待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增。

进一步地，上述探针是通过PCR扩增得到的一对或多对覆盖待检测位点或待检测区域的双链寡核苷酸。

进一步地，上述探针带有亲和标记；优选地，上述亲和标记是位于上述探针两条链的5’端的生物素标记。

进一步地，上述步骤(b)使用多条上述上游特异性引物组成的引物组和多条上述下游特异性引物组成的引物组。

进一步地，上述探针长度为150-200bp。

进一步地，每一个上述上游特异性引物和下游特异性引物距离上述待检测位点或待检测区域的距离为1-20个碱基，优选1-5个碱基。

进一步地，上述待检测位点或待检测区域包括点突变、插入、缺失和基因融合中的至少一种。

进一步地，上述方法还包括：

(c)对上述步骤(b)的扩增产物进行测序，以检测上述待检测位点或待检测区域。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的试剂，包括：

(a)探针，上述探针是双链寡核苷酸，用于对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中，上述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；

(b)上游特异性引物和下游特异性引物，以及通用引物，用于对探针预富集产物进行特异性富集，以及对特异性富集产物进行通用引物扩增。

进一步地，上述探针是通过PCR扩增得到的一对或多对覆盖待检测位点或待检测区域的双链寡核苷酸。

本发明的方法使用目标区域探针对DNA进行预富集，去除了绝大部分外源DNA和非目标区域DNA。该方法允许尽可能多地加入总DNA，进而增加目标痕量DNA的拷贝数。本发明使用双链探针对待检测目标区域的两条链都进行捕获，增加了痕量DNA的利用率。本发明还使用上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增，进一步降低了外源DNA和非目标区域DNA的含量，提高了痕量DNA的含量，解决了现有检测技术针对含有大量外源DNA污染的复杂样本检测灵敏度低的技术问题。

附图说明

图1为本发明实施例中使用PCR的方法进行探针制作的原理示意图；

图2为本发明实施例中使用双链DNA探针进行杂交预富集的原理示意图；

图3为本发明实施例中对探针预富集产物进行特异性PCR富集及终文库构建的过程。

图4为本发明实施例中构建的文库的电泳检测结果图，其中Library表示文库电泳结果，M表示Takara 100bp Marker。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

目前传统的商业化探针制作为基因合成方法，该方法对探针长度有限制(一般100nt以上的探针合成准确度较差)，而且价格昂贵。而本发明使用PCR方法进行探针制作，不仅使探针成本极大降低，而且能够制作更长的特异性更好的探针。使用双链DNA探针进行杂交预富集，相较于传统的单链探针而言，可以同时富集目标区域的两条链，使富集效率和灵敏度更高。

使用PCR的方法进行探针制作的原理，如图1所示，探针长度一般为150-200bp。探针两条链的5’端有生物素标记，以便使用亲和素进行捕获。探针是双链寡核苷酸，覆盖待检测位点或待检测区域。在具体应用中，针对待检测位点或待检测区域的个数，可以使用一对或多对这样的双链寡核苷酸探针。

使用双链DNA探针进行杂交预富集的原理，如图2所示，样本中含有大量外源物种DNA和其它非目标区域DNA，以及痕量的目标区域DNA(即含有待检测位点或待检测区域的DNA)。使用探针包含目标区域DNA的接头连接产物进行探针预富集，即可提高目标区域DNA在样本中的相对含量。由于探针仍可能有非特异性结合，故会产生非特异性预富集产物。这就需要下一步使用特异性引物进行特异性扩增。

对探针预富集产物进行特异性PCR富集及终文库构建，如图3所示，使用针对待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增，即得到终文库。对终文库进行测序，即可检测待检测位点或待检测区域的突变情况，本发明中，待检测位点或待检测区域突变情况包括点突变、插入、缺失和基因融合中的至少一种。探针预富集的非特异性产物由于只有通用引物与之结合，而并无特异性引物与之结合，所以无法进行PCR富集。

如图3所示，上游特异性引物和下游特异性引物可以分别是多条引物组成的引物组，即上游特异性引物组和下游特异性引物组，也就是多个待检测位点或待检测区域特异性引物的混合物。引物组中的每条引物可以分别针对特定的一种待检测位点或待检测区域。特异性引物组分为上游组和下游组，分别对待检测DNA的两条链进行扩增。

在本发明优选实施例中，每一个上游特异性引物和下游特异性引物距离待检测位点或待检测区域的距离一般为1-20个碱基，优选1-5个碱基。

对应于本发明实施例的方法，本发明实施例还提供一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的试剂，包括：

(a)探针，上述探针是双链寡核苷酸，用于对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中，上述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；

(b)上游特异性引物和下游特异性引物，以及通用引物，用于对探针预富集产物进行特异性富集，以及对特异性富集产物进行通用引物扩增。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。实施例中使用的试剂，在没有特别说明的情况下，均为市售的常规试剂。

实施例

本实施例对样本进行文库构建并对NRAS、KRAS、PI3KA、EGFR 4个基因的7个位点进行检测，具体如下：

1.含有随机单分子标签的接头设计

IDX1-S：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNggaattaGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：1)；

IDX2-S：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNatccggcGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：2)；

IDX3-S：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNcaggccgGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：3)；

ADT-AS：pGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO：4)；ADT-AS序列5’端磷酸基团修饰。

IDX1-S、IDX2-S、IDX3-S(均为接头的第一链)分别与ADT-AS序列退火成双链，构成三个接头ADT1、ADT2、ADT3。

2.本实施例针对NRAS、KRAS、PIK3CA、EGFR这4个基因的常见7个突变点进行检测。

针对NRAS的Q61K设计用于制作探针的引物：

NRAS-Q61K-F:CCTTACCCTCCACACCCCCA(SEQ ID NO：5)；

NRAS-Q61K-R:GTTAATATCCGCAAAT(SEQ ID NO：6)。

针对KRAS的G12D设计用于制作探针的引物：

KRAS-G12D-F:GTGACATGTTCTAATATAGTC(SEQ ID NO：7)；

KRAS-G12D-R:TAATATGCATATTAAAACAAG(SEQ ID NO：8)。

针对PIK3CA的E545K设计用于制作探针的引物：

PIK3CA-E545K-F:TATTTTACAGAGTAACAGAC(SEQ ID NO：9)；

PIK3CA-E545K-R:AGATCAGCCAAATTCAGTTA(SEQ ID NO：10)。

针对EGFR的E746-A750设计用于制作探针的引物：

EGFR-E746-A750-F:ACAATTGCCAGTTAACGTCT(SEQ ID NO：11)；

EGFR-E746-A750-R:CAGACATGAGAAAAGGTGGG(SEQ ID NO：12)。

针对EGFR的V769_D770insASV设计用于制作探针的引物：

EGFR-V769_D770insASV-F:AGCTTTTCCTCCATGAGTAC(SEQ ID NO：13)；

EGFR-V769_D770insASV-R:GATGCCCAGCAGGCGGCA(SEQ ID NO：14)。

针对EGFR的T790M设计用于制作探针的引物：

EGFR-T790M-F:TCCACCGTGCAGCTCATC(SEQ ID NO：15)；

EGFR-T790M-R:ATCTCCCCTCCCCGTATCTC(SEQ ID NO：16)。

针对EGFR的L858R设计用于制作探针的引物：

EGFR-L858R-F:ACTTGGAGGACCGTCGCTTG(SEQ ID NO：17)；

EGFR-L858R-R:AGTGGGAAGGCAGCCTGGT(SEQ ID NO：18)。

所有用于制作探针的引物5’端使用生物素标记修饰。

用于制作探针的DNA模板为健康人的基因组DNA。

探针制作实验体系(表1)及PCR程序如下：

表1

PCR程序如下：

a)98℃1分钟；

b)15个循环程序如下：

98℃30秒

60℃30秒

72℃30秒

c)72℃1分钟

d)4℃保存。

使用60μl Ampure XP beads进行纯化后所有探针等物质的量混合。

3.本实施例针对NRAS、KRAS、PIK3CA、EGFR这4个基因的常见7个突变点设计PCR上下游特异性富集引物。

针对NRAS的Q61K设计PCR特异性富集引物：

上游U-NRAS-Q61K-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTCTCATGGCACTGTACTC(SEQ ID NO：19)。

下游D-NRAS-Q61K-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGACATACTGGATACAGCT(SEQ ID NO：20)。

针对KRAS的G12D设计PCR特异性富集引物：

上游U-KRAS-G12D-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTATCGTCAAGGCACTCTTGCC(SEQ ID NO：21)。

下游D-KRAS-G12D-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAACTTGTGGTAGTTGGAG(SEQ ID NO：22)。

针对PIK3CA的E545K设计PCR特异性富集引物,

上游U-PIK3CA-E545K-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTGTGACTCCATAGAAAATCT(SEQ ID NO：23)。

下游D-PIK3CA-E545K-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGATTTCTACACGAGATCCT(SEQ ID NO：24)。

针对EGFR的E746-A750设计PCR特异性富集引物,

上游U-EGFR-E746-A750-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTTCCTTGTTGGCTTTCGGAG(SEQ ID NO：25)。

下游D-EGFR-E746-A750-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTAAAATTCCCGTCGC(SEQ ID NO：26)。

针对EGFR的V769_D770insASV设计PCR特异性富集引物：

上游U-EGFR-V769_D770insASV-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCTCCAGGAAGCCTACGTG(SEQ ID NO：27)。

下游D-EGFR-V769_D770insASV-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGATGCCCAGCAGGCGGCA(SEQ ID NO：28)。

针对EGFR的T790M设计PCR特异性富集引物：

上游U-EGFR-T790M-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGAGGCAGCCGAAGG GCATG(SEQ ID NO：29)。

下游D-EGFR-T790M-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGGAAGCCTACGTGATGGC(SEQ ID NO：30)。

针对EGFR的L858R设计PCR特异性富集引物：

上游U-EGFR-L858R-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTATTCTTTCTCTTCCGCAC(SEQ ID NO：31)。

下游D-EGFR-L858R-TN:

CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTCAAGATCACAGATTTTGG(SEQ ID NO：32)。

各个待检测位点的PCR上游特异性富集引物等物质的量混合构成PCR上游特异性富集引物组。PCR下游特异性富集引物等物质的量混合构成PCR下游特异性富集引物组。

4.最终PCR引物序列如下：

UQ-P1:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO：33)；

UQ-P2:

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：34)。

5.用于本实施例的背景样本为一名健康人粪便中提取出的混合DNA(人粪便中提取出的DNA为混合DNA，其中大约60％的DNA来源于肠道细菌，剩余的绝大部分DNA来源于动物或植物食物残渣，可用于检测的结肠黏膜脱落细胞的DNA占总DNA的千分之一甚至更少。使用STRATEC Molecular品牌PSP Spin Stool DNA Plus Kit(Catalogue#:1038110300)进行粪便样本DNA抽提。

用于本实施例的突变掺和样本来自HORIZON DISCOVERY公司的商业化标准品MultiplexI cfDNA ReferenceStandardSet(Catalogue#:HD780)，取该产品5％MultiplexI(每个待检位点实际突变频率见下表2)的DNA样本与健康背景DNA片段按照1：999进行掺和。

掺和后的样本均分为两份，一份用来进行本发明的实验，另一份进行数字微滴PCR检测(对照实验)。

5％Multiplex I各位点实际突变频率：

表2

NRAS-Q61K6.3％KRAS-G12D6.3％PIK3CA-E545K6.3％EGFR-E746-A7505％EGFR-V769_D770insASV5％EGFR-T790M5％EGFR-L858R5％

6.粪便基因组DNA片段化

粪便基因组DNA取50ug，使用Covaris S220，超声波DNA破碎仪片段化至平均250bp大小。

7.片段化DNA末端修复

反应体系如下表3：

表3

金属浴上20℃温浴30分钟。

使用120μl Ampure XP beads进行纯化，100μl洗脱缓冲液洗脱。

8.DNA掺和

5％MultiplexI DNA与片段化DNA按照1：999进行掺和。取20ug掺和DNA进行本发明的如下实验。剩余掺和DNA进行数字微滴PCR实验(对照实验)。

9.3’端加多聚腺嘌呤尾

反应体系如下表4：

表4

末端修复的DNA溶液20ugKlenow酶缓冲液5μldATP10μlKlenow exo-酶3μl总体积50μl

金属浴上37℃温浴30分钟。

使用60μl Ampure XP beads进行纯化，100μl洗脱缓冲液洗脱。

10.连接接头

反应体系如下表5：

表5

3’加A的DNA溶液10ugT4DNA连接酶缓冲液25μl2μM DNA接头1μlT4DNA连接酶5μl总体积50μl

DNA接头为ADT1或ADT2或ADT3。

金属浴上20℃温浴15分钟。

使用60μl Ampure XP beads进行纯化，34.8μl去离子水洗脱。

11.探针杂交预富集

配制如下表6反应1：

表6

蒸发浓缩至7ul。

PCR仪上95℃5分钟，66℃5分钟。

反应体系如下表7：

表7

PCR仪上66℃杂交16小时。

漂洗后使用Dynabeads^TMM-270Streptavidin(Catalog>

12.PCR特异性富集

将步骤11的产物均分两份，分别使用上游特异性引物组和下游特异性引物组进行PCR特异性富集。

反应体系如下表8：

表8

探针杂交预富集产物100ngAmplitaq Gold360Master Mix25μlPCR特异性富集引物组(25uM)1μlGC-增强剂1μlUQ-P1(25uM)1μl总体积50μl

PCR程序如下：

e)95℃10分钟；

f)20个循环程序如下：

95℃30秒

62℃30秒

72℃1分钟

g)72℃7分钟

h)4℃保存。

使用60μl Ampure XP beads进行纯化，20μl洗脱缓冲液洗脱。

13.终文库扩增

反应体系如下表9：

表9

PCR特异性富集产物20μlHIFI Ready Mix(KAPA BIOSYSTEMS)25μlUQ-P1+UQ-P2(各5uM)5μl总体积50μl

PCR程序如下：

a)98℃45秒；

b)10循环程序如下：

98℃15秒

60℃30秒

72℃30秒

c)72℃1分钟

d)4℃保存。

取其中5μl产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。

使用60μl Ampure XP beads进行纯化，30μl洗脱缓冲液洗脱。

14.最终文库经过荧光定量PCR质控后，利用Illumina公司NextSeq500进行75bp双端测序。

15.将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，计算目标位点的突变频率，结果见下表10：

表10

实验结果证明，应用本发明的实验方法能够从多种复杂混合DNA中准确检测出痕量目标DNA突变。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司

<120> 一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂

<130> 16I23775

<160> 34

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 73

<212> DNA

<213> 接头序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnggaattag tgactggagt tcagacgtgt 60

gctcttccga tct73

<210> 2

<211> 73

<212> DNA

<213> 接头序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnatccggcg tgactggagt tcagacgtgt 60

gctcttccga tct73

<210> 3

<211> 73

<212> DNA

<213> 接头序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nncaggccgg tgactggagt tcagacgtgt 60

gctcttccga tct73

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 接头序列

<400> 4

gatcggaaga gc 12

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 5

ccttaccctc cacaccccca 20

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 6

gttaatatcc gcaaat 16

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 7

gtgacatgtt ctaatatagt c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 8

taatatgcat attaaaacaa g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 9

tattttacag agtaacagac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 10

agatcagcca aattcagtta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 11

acaattgcca gttaacgtct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 12

cagacatgag aaaaggtggg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 13

agcttttcct ccatgagtac 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 14

gatgcccagc aggcggca 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 15

tccaccgtgc agctcatc 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 16

atctcccctc cccgtatctc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 17

acttggagga ccgtcgcttg 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 18

agtgggaagg cagcctggt19

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 19

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agtctcatgg cactgtactc50

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 20

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agggacatac tggatacagc t51

<210> 21

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 21

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac aggtatcgtc aaggcactct tgcc 54

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 22

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agaacttgtg gtagttggag50

<210> 23

<211> 52

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 23

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agtgtgactc catagaaaat ct 52

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 24

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agatttctac acgagatcct50

<210> 25

<211> 52

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 25

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agttccttgt tggctttcgg ag 52

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 26

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agaagttaaa attcccgtcg c51

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 27

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agctccagga agcctacgtg50

<210> 28

<211> 51

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 28

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agagatgccc agcaggcggc a51

<210> 29

<211> 52

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 29

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agggaggcag ccgaagggca tg 52

<210> 30

<211> 51

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 30

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac agaggaagcc tacgtgatgg c51

<210> 31

<211> 52

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 31

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac aggtattctt tctcttccgc ac 52

<210> 32

<211> 52

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 32

cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac aggtcaagat cacagatttt gg 52

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 33

caagcagaag acggcatacg a 21

<210> 34

<211> 62

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 34

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60

ag62