ES细胞基因打靶技术制备基因修饰小鼠的改进方法

摘要

本发明公开了ES细胞基因打靶技术制备基因修饰小鼠的改进方法。本发明的目的在于提高囊胚前胚胎ES注射法获取100％ES来源基因修饰鼠的效率，着重在囊胚前胚胎的获取方法、显微注射方法、显微注射后胚胎的体外培养等方面进行改进和优化。本发明保证了100％ES来源小鼠的得率，同时大大缩减了周期和成本。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及生物基因技术领域，具体涉及ES细胞基因打靶技术制备基因修饰小鼠的改进方法。

背景技术

ES基因打靶是通过同源重组将外源基因定点整合入ES细胞基因组上某一确定的位点，从而实现定点修饰改造染色体上某一基因的技术。将基因打靶后的ES细胞用显微注射的办法导入胚胎中就可以生产出基因修饰小鼠。该技术是最早实现基因组定点修饰的技术，并在相当长的时间内是唯一可以在基因组水平上进行基因定点操作的技术，由于该方法建立时间久、技术成熟度高、没有脱靶效应等优势，目前仍被广泛认为是一种理想的修饰与改造生物体遗传物质的方法。但在各种基因修饰新技术不断出现的今天，与新诞生的CRISPR/Cas9等核酸酶基因修饰技术相比，基因修饰小鼠制备周期长成为该技术的最大不足。

ES基因打靶技术制备基因修饰小鼠可以分为ES基因打靶和ES胚胎显微注射获取基因修饰小鼠(以下简称ES显微注射)两个阶段。其周期长主要表现在ES显微注射阶段，因为通过传统ES显微注射获得的往往都是嵌合体(只有部分细胞来源于基因修饰的ES细胞)，不是真正意义上的基因修饰小鼠，需要再繁殖一代才能从后代中挑选出真正可稳定遗传的基因修饰小鼠，该过程至少增加了3个月的周期。虽然经过几十年的发展，ES显微注射技术也已经发展出一系列的不同方法，不仅可以产生嵌合体后代，也可以产生完全来自外源ES细胞的后代，但现有的方法都或多或少存在不同的问题。

目前常用的ES显微注射方法主要有以下几种：

(1)胚胎干细胞囊胚注射法(传统ES显微注射法)：从上世纪80年代出现至今已有30多年的历史，在相当长的一段时间内是基因敲除小鼠构建的主要方法；

(2)四倍体胚胎ES显微注射法：该法能够获得100％来源于外源ES细胞的后代小鼠；

(3)囊胚前胚胎的ES显微注射方法：该方法有获得100％来自外源ES后代的几率。由于其比传统四倍体胚胎ES显微注射法简单，且当ES来源于近交系小鼠时获得的后代也不容易致死，因此该法一诞生就受到广泛关注，并被不断优化。

上述方法虽然各有特色，但都存在不足：

(1)胚胎干细胞囊胚注射法的缺点是一般只能产生嵌合体，很难获得完全来源于外源ES细胞的小鼠，不是真正意义上的基因修饰小鼠，需要再繁殖一代才能从后代中挑选出真正可稳定遗传的基因修饰小鼠(且最多只占后代总数的50％)，这个传代过程会多耗时至少3个月，而且成功率较低(平均不足1/3)；

(2)四倍体胚胎ES显微注射法的缺点是操作比较复杂，出生率较低，且当ES来源于近交系小鼠时产生的后代往往死亡；

(3)现有囊胚前胚胎ES注射法的缺点是获得100％ES来源的小鼠效率较低，囊胚前胚胎获取难度比囊胚大。

发明内容

本发明目的在于提高囊胚前胚胎ES注射法获取100％ES来源基因修饰鼠的效率，着重在囊胚前胚胎的获取方法、显微注射方法、显微注射后胚胎的体外培养等方面进行改进和优化。本发明既能保证100％ES来源小鼠的得率，同时还大大缩减周期、降低成本。

本发明提供的ES细胞基因打靶技术制备基因修饰小鼠的改进方法，包括如下步骤：

(1)提供小鼠的2-细胞胚胎，

(2)将所述的2-细胞胚胎在清洗若干次后，在37℃下5％CO₂的条件下培养12-24小时；

(3)将步骤(2)培养的胚胎和准备好的ES细胞转移到同一注射皿中的液滴内，将所述注射皿放置在显微镜下进行显微注射；在高倍镜下，用斜口的注射针连续吸多个ES细胞到注射针里，挑选形态较好的胚胎，将注射针的针头插入胚胎的卵裂球间隙内，推动注射器，将注射针内的ES细胞推到胚胎内，最后拔出针；

(4)将注射后的胚胎转移至改良胚胎培养基中培养，在37℃，5％CO₂条件下培养24小时；

(5)选取前述步骤(4)中发育良好的胚胎，移植到2.5d的代孕鼠子宫内；

(6)当代孕鼠产下小仔F0后，对出生小鼠进行统计和鉴定。

优选的，所述步骤(2)中，将所述的2-细胞胚胎在M2培养液滴中清洗多遍，接着将2-细胞转移到微滴培养皿中，然后用平衡好的M16培养液清洗2-细胞胚胎多遍后，最后将2-细胞胚胎放置于一个干净液滴内。

优选的，所述步骤(3)显微注射具体包括如下步骤：

S1.在高倍镜下选择单个ES细胞，用斜口的注射针连续吸多个细胞到注射针里，挑选形态较好的胚胎，用固定针吹吸胚胎，旋转胚胎直至将一个较大间隙调节在3点方向。用固定针负压固定胚胎，调节显微镜确定胚胎的边缘，同时要确保胚胎固定牢固；

S2.将注射针的尖端与胚胎的中心点安排在同一聚焦平面上，用注射针尖轻轻地接触胚胎表面；

S3.将注射针的针头插入胚胎的卵裂球间隙内，缓慢推动油压注射器，将注射针内的ES细胞推到胚胎内，每个胚胎注射6-8个ES细胞；

S4.注射完毕后将注射针缓慢拔出。

优选的，所述步骤(3)中注射皿中的液滴为注射液，所述步骤(4)中的改良胚胎培养基；它们的组分相同，如下组成：

；其中NEAA(100×)的成分为：

成分浓度(g/100mL)脯氨酸0.01-0.1丙氨酸0.01-0.1丝氨酸0.01-0.1甘氨酸0.01-0.1天冬酰胺0.05-0.5天冬氨酸0.05-0.5谷氨酸0.05-0.5

；其中，所述小分子物质为C、H、F、N、O、S类化学成分组成的氨基芳香烃类，其范围在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。

优选的，所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341组分中的两种或两种以上。

优选的，所述步骤(3)中注射皿中的液滴为注射液，所述步骤(4)中的改良胚胎培养基；它们的组分相同，如下组成：

其中NEAA(100×)的成分为：

成分浓度(g/100mL)脯氨酸(L-Proline)0.05-0.1丙氨酸(L-Alanine)0.05-0.1丝氨酸(L-Serine)0.05-0.1甘氨酸(Glycine)0.05-0.1天冬酰胺(Asparagine monohydrate)0.05-0.4天冬氨酸(Aspartic acid)0.05-0.4谷氨酸(Glutamic acid)0.05-0.4

；其中，所述小分子物质为C、H、F、N、O、S类化学成分组成的氨基芳香烃类，其范围在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。

优选的，所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341组分中的两种或两种以上。

本发明中的胚胎培养基和注射液的组分中，NEAA(100×)，表示为NEAA为100×的母液，即其应用时最大稀释配倍数为100倍；其在配方中的最大添加量为0.1-10×，即在总体积为100ml培养试剂中，添加NEAA为0.1-10ml。

本发明中使用的显微注射针为自行拉制，使用SUTTER公司的P-97拉针仪，将内径1mm的薄壁毛细管拉制为细长的尖锥形，用锻针仪在毛细管内径为15-20μm处将尖锥的头部断开(确保断口整齐)，再用磨针仪将断口处的断面磨制为45°的角后备用。

目前使用最多的基因修饰动物模型制备技术是囊胚ES显微注射技术，该技术由于其获得的是嵌合体，不是真正意义上的基因修饰小鼠，需要再繁殖一代才能从后代中挑选出真正可稳定遗传的基因修饰小鼠(且最多只占后代总数的50％)，这个传代过程至少耗时3个月，而且成功率较低。

本发明的显微注射技术无论在小鼠出生率还是ES来源的小鼠比率上与传统方法的效率不相上下，另外还可以直接大量产生100％ES来源小鼠；节省了至少3个月的时间；由于减少了一个中间环节而简化了操作流程、增加了成功率。因此该技术具有省时、低成本、高效率的三大优势，是对现有技术的突破性改进。改进后的ES基因打靶技术在基因修饰小鼠制备效率上已经接近CRISPR/Cas9等最新的核酸酶基因修饰技术，可在基因修饰领域大大缓解CRISPR/Cas9基因修饰技术专利生效后对我国生物医药产业可能产生的冲击。

根据上述技术方案，可以得出本发明和现有技术的区别如表1所示，

表1发明和现有技术比较：

由此，可以得出本发明相对于现有技术中的优点：

1、本发明胚胎获取方法较传统方法的优点：降低了胚胎获得的难度，提高了特定发育阶段胚胎的得率。

2、本发明显微注射方法较传统方法的优点：降低了对设备的需求，只需要普通的显微注射设备就能够实现，无需采购价格昂贵的激光破膜仪和压电破膜仪。

3、本发明注射液配方较传统方法的优点：大幅提高了100％ES来源小鼠的比例，使得使用斜口针进行囊胚前胚胎注射获取高比例的100％ES来源小鼠成为可能。

4、本发明注射后培养方法较传统方法的优点：大幅提高了100％ES来源小鼠的产率，使得用囊胚前胚胎ES注射法完全取代传统的囊胚ES注射法成为可能。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1显微注射方法对比

1.1实验所需培养基：

本实验所需注射液和胚胎培养基，按照表2配制。

表2.注射液和胚胎培养基

试剂名称品牌货号添加量氯化钠NaCl上海展云化工7647-14-55.0g/L氯化钾KCl上海展云化工7447-40-70.4/L氯化钙CaCl₂·2H₂OSigmaC50800.5/L磷酸二氢钾KH₂PO₄上海展云化工7778-77-00.5g/L硫酸镁MgSO₄·7H₂O上海展云化工7487-88-90.2/L碳酸氢钠NaHCO₃上海展云化工144-55-820g/Lβ-巯基乙醇β-MercaptoethanolSigmaM31485 mL/L转铁蛋白TransferrinPeproTechAF-200-020.02g/L葡萄糖SigmaG70210.5g/L乳酸钠SigmaL70222.0 mL/L乳酸钙Sigmal20000.5g/L丙酮酸钠SigmaP52800.05g/L乙二胺四乙酸钠SigmaE16440.05g/L谷氨酰胺Sigma494190.1g/L牛血清白蛋白Amresco03320.05g/L胎牛血清BI04-002-1A7％HEPESSigmaH75233.5g/LNEAA(100×)Cyagen10201-1005×小分子物质0.25g/L

其中NEAA(100×)的成分为：

成分浓度(mg/L)脯氨酸(L-Proline)1150丙氨酸(L-Alanine)890丝氨酸(L-Serine)1050甘氨酸(Glycine)750天冬酰胺(Asparagine monohydrate)1320天冬氨酸(Aspartic acid)1330谷氨酸(Glutamic acid)1470

；其中，所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341组分中的两种或两种以上。

1.2实验分组：

X1组为压电破膜显微注射；X2组为斜口针显微注射

1.3实验步骤与结果

按照显微注射方法的不同分为2组，X1组使用压电破膜仪辅助显微操作，X2组使用斜口针显微操作，其他实验操作步骤及条件都相同，均按本实验流程最优方法进行，每组的统计数据如下：

表3统计数据结果

由上表可知在主要数据上用斜口针显微注射都取得更好的结果。

实施例2显微注射液效果对比

2.1实验所需培养基：

M2培养基：购买于SIGMA公司，货号为M7167；

本发明注射液：配方如表2所示。

2.2实验分组：

M组为M2培养基；N组为本发明的注射液，配方如表2所示。

2.3实验步骤

按照实验操作流程，胚胎获取和显微注射方法都按照本发明方案的最优方法进行，其它步骤条件都相同，区别仅为：M组的注射液为M2培养基；N组的注射液为本发明表2的注射液。

2.4实验结果：数据统计如表4：

表4数据统计结果

从结果可以看出，本发明的注射液比M2培养基的100％ES来源的小鼠出生率高出近20％。

实施例3.注射后的胚胎培养基对比试验

3.1实验所需培养基：

表5.NB培养基配方

试剂名称品牌货号添加比例Knockout DMEMGibco1082901870-95％N2(100×)Gibco175020480.1-10×B27(50×)Gibco175040440.1-10×NEAA(100×)^注Cyagen10201-1000.1-10×GlutaMAX(100×)Gibco350500610.1-10×青链霉素(1000×)吉诺GNM151400.1-10×β-巯基乙醇SigmaM75220.01-0.8mM白血病抑制因子LIF普欣123-071-20ng/mL

表6 KSR培养基配方

试剂名称品牌货号使用浓度Knockout DMEMGibco1082901875-90％KSRGibcoN108280285-20％NEAA(100×)^注Cyagen10201-1000.1-10×GlutaMAX(100×)Gibco350500610.1-10×青链霉素(100×)吉诺GNM151400.1-10×β-巯基乙醇SigmaM75220.01-0.8mM白血病抑制因子LIF普欣123-071-20ng/mL

注：NEAA(100×)成分如下：

成分浓度(mg/L)脯氨酸(L-Proline)1150丙氨酸(L-Alanine)890丝氨酸(L-Serine)1050甘氨酸(Glycine)750天冬酰胺(Asparagine monohydrate)1320天冬氨酸(Aspartic acid)1330谷氨酸(Glutamic acid)1470

M16培养基：购买于SIGMA公司，货号为M7292；

KSOM培养基：购买于Millipore公司，货号为MR-106-D；

本发明培养基：按照表2成分配置。

3.2实验分组：

A组：不培养；B组：M16培养基；C组：KSOM培养基；D组：KSR培养基；E组：NB培养基；F组：KSOM+4％NB；G组：本发明培养基。

3.3实验步骤与结果

按照实验操作流程，胚胎获取方法和显微注射方法均按照本方案的最优方法进行，其它步骤条件都相同，区别仅为各组胚胎培养基不同，根据上述各组进行试验，最终每组的统计数据如下：

表7统计数据结果

由上表可知注射后的胚胎若不经短暂培养，获得100％ES来源小鼠数量极少甚至没有；本方明与现有注射后的培养方法相比差异显著，其100％ES来源小鼠出生率提高了10％。

实施例4.本发明与传统囊胚显微操作效率对比

4.1实验分组：

Y1组：本发明的显微注射方法；Y2组：传统囊胚ES显微注射

4.2实验步骤与结果

本实验按照整个流程的最优方式进行，传统的囊胚ES显微注射则按照本领域技术人员所熟知的方式进行。当代孕鼠产下小仔(F0)后，对出生小鼠进行统计和鉴定。根据胚胎供体小鼠为白色体毛，ES来源小鼠为黑色体毛的区别，将F0小鼠按毛色分为三类：白色小鼠(胚胎供体来源小鼠)、黑白杂色小鼠(嵌合体小鼠)和纯黑色小鼠(100％ES来源小鼠)，分别进行统计。结果统计如表11所示。

表8统计数据结果

由于传统囊胚ES显微注射方式在F0代没有100％ES来源的小鼠，只能用>80％嵌合率嵌合体小鼠来进行比较，嵌合体不能稳定遗传若想获得真正的基因修饰小鼠必须再交配一代，既浪费了3-4个月的时间，又浪费了生产成本与人力资源，而且成功率也不高。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。