用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂与方法

摘要

本发明公开了用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂与方法。本发明公开的成套试剂为成套试剂1和成套试剂2，成套试剂1由成套试剂A与降低hsp基因表达的核酸分子组成，成套试剂A由pDE3dBH.qa载体、粗糙脉孢菌dcl‑1

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂与方法。

背景技术

松材线虫是国内外检疫性病原物，随着其大范围的传播，对我国松林造成严重威胁。RNA干扰技术(RNAi)在植物寄生线虫基因功能的研究中得到广泛应用，在应用RNAi技术研究松材线虫基因功能时以浸泡法较为普遍，但其成本昂贵，且不能连续干扰。目前急需一种简单的干扰松材线虫基因表达的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何降低松材线虫靶标基因的表达以及如何降低松材线虫高温敏感性和抑制松材线虫运动活性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了可用于降低松材线虫高温敏感性或降低松材线虫hsp基因的表达的成套试剂，将该成套试剂命名为成套试剂1。

本发明所提供的成套试剂1，由成套试剂A与hsp基因片段组成；所述成套试剂A包括pDE3dBH.qa载体和粗糙脉孢菌；所述hsp基因片段为名称为hsp-AC和/或hsp-BC的核酸分子；

所述hsp-AC为如下a1)-a3)中任一种：

a1)序列表中序列1的第7-425位所示的cDNA分子或DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

所述hsp-BC为如下b1)-b3)中任一种：

b1)序列表中序列2的第7-285位所示的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。

上述成套试剂1中，所述成套试剂A还可包括pBT6质粒。

上述成套试剂1中，所述成套试剂A可仅由所述pDE3dBH.qa载体和所述粗糙脉孢菌组成，也可由所述pDE3dBH.qa载体、所述粗糙脉孢菌和所述pBT6质粒组成。

上述成套试剂1中，所述粗糙脉孢菌可为粗糙脉孢菌株dcl-1^-/dcl-2^-。

为解决上述技术问题，本发明还提供了可用于抑制松材线虫运动活性或降低松材线虫cyc基因或tmy基因的表达的成套试剂，将该成套试剂命名为成套试剂2。

本发明所提供的成套试剂2，为成套试剂甲或成套试剂乙；所述成套试剂甲由所述成套试剂A与cyc基因片段组成；

所述cyc基因片段为名称为cyc-AC和/或cyc-BC的核酸分子；

所述cyc-AC为如下c1)-c3)中任一种：

c1)序列表中序列3的第7-334位所示的cDNA分子或DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

所述cyc-BC为如下d1)-d3)中任一种：

d1)序列表中序列4的第7-224位所示的cDNA分子或DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

所述成套试剂乙由所述成套试剂A与tmy基因片段组成；

所述tmy基因片段为名称为cyc-AC和/或cyc-BC的核酸分子；

所述tmy-AC为如下e1)-e3)中任一种：

e1)序列表中序列5的第7-377位所示的cDNA分子或DNA分子；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

e3)在严格条件下与e1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

所述tmy-BC为如下f1)-f3)中任一种：

f1)序列表中序列6的第7-236位所示的cDNA分子或DNA分子；

f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；

f3)在严格条件下与f1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂A或所述hsp基因片段或所述cyc基因片段或所述tmy基因片段。所述成套试剂A可用于降低松材线虫靶标基因的表达。

为解决上述技术问题，本发明还提供了抑制松材线虫靶标基因表达的方法。

本发明所提供的抑制松材线虫靶标基因表达的方法，包括：将降低靶标基因表达的核酸分子导入所述pDE3dBH.qa载体，得到重组载体，将所述重组载体导入所述粗糙脉孢菌，得到重组菌；利用所述重组菌处理松材线虫，得到所述靶标基因表达降低的松材线虫。

上述方法中，所述重组菌还可含有pBT6质粒。

上述方法中，所述降低靶标基因表达的核酸分子可为所述靶标基因的全长或任意片段或其两个任意片段的组合。

上述方法中，所述靶标基因为hsp基因；所述降低靶标基因表达的核酸分子可为所述hsp基因片段。

所述靶标基因为cyc基因；所述降低靶标基因表达的核酸分子可为所述cyc基因片段。

所述靶标基因为tmy基因；所述降低靶标基因表达的核酸分子可为所述tmy基因片段。

上述方法中，所述利用所述重组菌处理松材线虫可为通过喂食所述松材线虫所述重组菌实现。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

X1、所述成套试剂A或所述成套试剂1或所述成套试剂2在抑制松材线虫基因表达中的应用；

X2、所述成套试剂1在降低松材线虫高温敏感性中的应用；

X3、所述成套试剂2在抑制松材线虫运动活性中的应用。

本发明中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1的第7-425位、序列2的第7-285位、序列3的第7-334位、序列4的第7-224位、序列5的第7-377位和序列6的第7-236位的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

实验证明，利用本发明的成套试剂与方法可以成功抑制松材线虫靶标基因(hsp、tmy和cyc基因)的表达，进一步可以降低其抗高温敏感性和抑制其运动活性：喂食通过pDE3dBH.qa载体导入hsp基因片段得到的重组粗糙脉孢菌(dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp)的松材线虫中hsp基因的表达量、喂食通过pDE3dBH.qa载体导入cyc基因片段得到的重组粗糙脉孢菌(dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-cyc)的松材线虫中cyc基因的表达量和喂食通过pDE3dBH.qa载体导入tmy基因片段得到的重组粗糙脉孢菌(dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-tmy)的松材线虫中tmy基因的表达量均显著低于对照粗糙脉孢菌；喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫在高温条件下培养两天后松材线虫平均总量为58条，与喂食对照菌相比下降了38.30％，表明利用本发明的成套试剂与方法可以降低松材线虫抗高温敏感性；喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-cyc和dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-tmy的松材线虫的平均运动活性显著低于喂食对照菌的松材线虫，表明利用本发明的成套试剂与方法可以抑制松材线虫的运动活性。

附图说明

图1为重组菌中各基因的目的片段表达的检测。其中，CK表示对照菌，M表示分子量标准。

图2为松材线虫喂食重组菌后体内相应基因的表达水平。其中，A为tmy基因的表达水平，tmy表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-tmy的松材线虫；B为hsp基因的表达水平，hsp表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫；C为cyc基因的表达水平，cyc表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-cyc的松材线虫；CK表示喂食对照菌的松材线虫，GFP表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-GFP的松材线虫。

图3为喂食不同重组菌后的松材线虫在PDA灰葡萄孢平板培养基上37℃培养两天后的总量。其中，CK表示喂食对照菌的松材线虫，GFP表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-GFP的松材线虫，hsp表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫。

图4为喂食不同重组菌的松材线虫的运动轨迹。其中，tmy表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-tmy的松材线虫，hsp表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫，cyc表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-cyc的松材线虫，CK表示喂食对照菌的松材线虫，GFP表示喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-GFP的松材线虫。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pDE3dBH.qa载体(Cheng et al.,Regulation of theNeurospora circadian clock by an RNA helicase,GENES&DEVELOPMENT,2005,19:234–241)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pBT6质粒(Li et al.,A reporter for dsRNA response inNeurospora crassa,FEBS Letters 585(2011)906–912)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)菌株dcl-1^-/dcl-2^-(CaterinaCatalanotto>

下述实施例中的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(林世锋等，松材线虫体前端特异cDNA文库的构建及细胞壁松弛蛋白基因的克隆与初步分析,植物病理学报,38(3):283-291(2008))公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)(林世锋等，松材线虫体前端特异cDNA文库的构建及细胞壁松弛蛋白基因的克隆与初步分析,植物病理学报,38(3):283-291(2008))公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂及其在降低松材线虫高温敏感性和运动活性中的应用

本实施例所提供的用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂由pDE3dBH.qa载体、pBT6质粒与粗糙脉孢菌株dcl-1^-/dcl-2^-组成，本实施例利用pDE3dBH.qa载体、pBT6质粒与粗糙脉孢菌株dcl-1^-/dcl-2^-抑制了松材线虫靶标基因的表达，所选靶标基因为hsp基因、cyc基因和tmy基因。具体步骤如下：

1、dsRNA表达载体的构建

合成用于抑制hsp基因表达的AC片段(hsp-AC)和BC片段(hsp-BC)，hsp-AC和hsp-BC的从5′端至3′端序列分别为序列表中序列1和序列2。其中，序列1的第1-6位为EcoRI的识别序列，第7-425位为hsp基因片段的序列，第426-431位为BamHI的识别序列；序列2的第1-6位为XmaI的识别序列，第7-285位为hsp基因片段的序列，第286-291位为BamHI的识别序列。

合成用于抑制cyc基因表达的AC片段(cyc-AC)和BC片段(cyc-BC)，cyc-AC和cyc-BC的从5′端至3′端序列分别为序列表中序列3和序列4。其中，序列3的第1-6位为EcoRI的识别序列，第7-334位为cyc基因片段的序列，第335-340位为BamHI的识别序列；序列4的第1-6位为XmaI的识别序列，第7-224位为cyc基因片段的序列，第225-230位为BamHI的识别序列。

合成用于抑制tmy基因表达的AC片段(tmy-AC)和BC片段(tmy-BC)，tmy-AC和tmy-BC的从5′端至3′端序列分别为序列表中序列5和序列6。其中，序列5的第1-6位为EcoRI的识别序列，第7-377位为tmy基因片段的序列，第378-383位为BamHI的识别序列；序列6的第1-6位为XmaI的识别序列，第7-236位为tmy基因片段的序列，第237-242位为BamHI的识别序列。

利用EcoRI和BamHI酶切hsp-AC得到hsp-AC酶切后片段，利用XmaI和BamHI酶切hsp-BC得到hsp-BC酶切后片段，利用EcoRI和XmaI酶切pDE3dBH.qa载体得到载体骨架，连接hsp-AC酶切后片段、hsp-BC酶切后片段与载体骨架，得到在pDE3dBH.qa载体的XmaI和BamHI识别序列间插入hsp-AC和hsp-BC的dsRNA表达重组载体，将该重组载体命名为pDE3dBH.qa-hsp。

利用EcoRI和BamHI酶切cyc-AC得到cyc-AC酶切后片段，利用XmaI和BamHI酶切cyc-BC得到cyc-BC酶切后片段，利用EcoRI和XmaI酶切pDE3dBH.qa载体得到载体骨架，连接cyc-AC酶切后片段、cyc-BC酶切后片段与载体骨架，得到在pDE3dBH.qa载体的XmaI和BamHI识别序列间插入cyc-AC和cyc-BC的dsRNA表达重组载体，将该重组载体命名为pDE3dBH.qa-cyc。

利用EcoRI和BamHI酶切tmy-AC得到tmy-AC酶切后片段，利用XmaI和BamHI酶切tmy-BC得到tmy-BC酶切后片段，利用EcoRI和XmaI酶切pDE3dBH.qa载体得到载体骨架，连接tmy-AC酶切后片段、tmy-BC酶切后片段与载体骨架，得到在pDE3dBH.qa载体的XmaI和BamHI识别序列间插入tmy-AC和tmy-BC的dsRNA表达重组载体，将该重组载体命名为pDE3dBH.qa-tmy。

将pDE3dBH.qa载体的EcoRI和XmaI识别序列间的DNA片段替换为GFP基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pDE3dBH.qa-GFP，pDE3dBH.qa-GFP表达GFP。

2、粗糙脉孢菌阳性转化子的获得

将步骤1的pDE3dBH.qa-hsp与pBT6质粒导入粗糙脉孢菌株dcl-1^-/dcl-2^-中，得到重组菌，将该重组菌命名为dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp。

将步骤1的pDE3dBH.qa-cyc与pBT6质粒导入粗糙脉孢菌株dcl-1^-/dcl-2^-中，得到重组菌，将该重组菌命名为dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-cyc。

将步骤1的pDE3dBH.qa-tmy与pBT6质粒导入粗糙脉孢菌株dcl-1^-/dcl-2^-中，得到重组菌，将该重组菌命名为dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-tmy。

将pDE3dBH.qa载体与pBT6质粒导入粗糙脉孢菌株dcl-1^-/dcl-2^-中，得到重组菌，作为对照菌。

将步骤1的pDE3dBH.qa-GFP与pBT6质粒导入粗糙脉孢菌株dcl-1^-/dcl-2^-中，得到重组菌，将该重组菌命名为dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-GFP。

3、粗糙脉孢菌中目的片段表达情况的检测

将步骤2得到的各重组菌分别接种到培养基1(培养基为向0.1％葡萄糖培养基中添加QA(奎宁酸)得到的QA浓度为0.001M的培养基，其中0.1％葡萄糖培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：琼脂1.5g/100mL，葡萄糖0.1g/100mL，精氨酸0.17g/100mL，二水合柠檬酸钠0.25g/100mL，磷酸二氢钾0.5g/100mL，硝酸铵0.2g/100mL，七水合硫酸镁0.02g/100mL，二水合氯化钙0.01g/100mL，生物素5g/10⁶mL，0.01ml微量元素母液/100ml；其中微量元素母液溶剂为水，溶质及其浓度分别为：一水合柠檬酸5g/100mL，七水合硫酸锌5g/100mL，六水合硫酸铵亚铁1g/100mL，五水合硫酸铜0.25g/100mL，一水合硫酸锰0.05g/100mL，硼酸0.05g/100mL，二水合钼酸钠0.05g/100mL。)，两天后挑取菌丝用Trizol法提取总RNA，经消化反转合成cDNA后利用各基因的AC片段的引物进行PCR反应，用内参验证cDNA质量。hsp基因的引物为F：ACCACCTCCAAGATCGAAGA,R：ACACCGTATTTGATGCCAAG，cyc基因的引物为F：GCCTTGGCCGATTCGACTTC，R：TGGCTGACATTCCTGAGGGA,tmy基因的引物为F：ACGTTCGGATTCATCACAGT,R：ACGCCATCAAGAAGAAGATG，GFP基因的引物为F：GGGTGTTCTGCTGGTAGTGG，R：ACGTAAACGGCCACAAGTTC,内参为Nc-β-tubulin，内参引物为F：GCGTATCGGCGAGCAGTT,R：CCTCACCAGTGTACCAATGCA。

PCR产物的电泳结果显示，各目的基因条带大小均正确，证明QA诱导的重组粗糙脉孢菌中各基因的目的片段均成功表达(图1)，对照菌中无hsp基因、cyc基因、tmy基因和GFP基因片段的表达。

4、松材线虫喂食重组粗糙脉孢菌

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

将步骤2得到的各重组菌分别接种于步骤3的培养基1中28℃黑暗条件下培养一天，得到粗糙脉孢菌培养物；向粗糙脉孢菌培养物中接种松材线虫，在28℃下培养6天，用灭菌水冲洗收集松材线虫，分别得到喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫、喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-cyc的松材线虫、喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-tmy的松材线虫、喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-GFP的松材线虫和喂食对照菌的松材线虫。

每种松材线虫各取部分提取总RNA，消化反转录合成cDNA后检测hsp基因、cyc基因和tmy基因的表达水平。所用内参为松材线虫β-actin基因，各基因的引物如下：

β-actin:S：5'-TCTCTTCCAGCCTTCTTTCTTG-3',AS：5'-GGCCGGATTCGTCGTACT-3'；

tmy：tmy-F：5'-TTACCGTCCCAGCCTACTTC-3'，tmy-R：5'-GCGTTCAACTCCTCCCTTC-3'；

hsp：hsp-F：5'-TTACCGTCCCAGCCTACTTC-3'，hsp-R：5'-GCGTTCAACTCCTCCCTTC-3'；

cyc：cyc-F：5'-GGGAAAGAAGGTGTTCAAGC-3'，cyc-R：5'-TGTTGGCAGCGGAGTAA-3'。

结果(图2)发现，喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫中hsp基因的表达量显著低于喂食对照菌的松材线虫，喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-cyc的松材线虫中cyc基因的表达量显著低于喂食对照菌的松材线虫，喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-tmy的松材线虫中tmy基因的表达量显著低于喂食对照菌的松材线虫，喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-GFP的松材线虫中GFP基因高表达。

5、喂食重组粗糙脉孢菌的松材线虫性状检测

从干扰后线虫高温存活率和运动活性两个方面检测喂食不同重组菌的松材线虫的特点，均以喂食对照菌和喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-GFP的松材线虫为对照，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

对步骤4的喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫高温存活率的检测方法如下：是将20条L2～L3龄期的松材线虫接种到PDA灰葡萄孢平板培养基(PDA灰葡萄孢平板培养基为向PDA培养基中接种灰葡萄孢(Botrytis>-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫在高温37℃条件下培养两天后松材线虫平均总量为58条，与对照相比下降了38.30％，表明利用本发明的方法可以成功抑制hsp基因的表达，进一步可以降低其抗高温敏感性(图3)。

检测步骤4得到的喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫、喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-cyc的松材线虫和喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-tmy的松材线虫的运动活性，具体方法如下：将各松材线虫分别接种至质量百分比浓度为27％的PluronicF-127透明胶中，28℃培养放置，在接种后不同时间段(2h,4h和16h)观察记录各松材线虫的运动情况。

结果(图4)显示，喂食对照菌的松材线虫的平均运动活性为3.0mm/min，喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-tmy的松材线虫平均运动活性为1.0mm/min，喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-cyc的松材线虫的平均运动活性为1.2mm/min，tmy和cyc基因的表达受到抑制后松材线虫的运动活性下降，喂食dcl-1^-/dcl-2^--pDE3dBH.qa-hsp的松材线虫的平均运动活性(2.5mm/min)也有所下降，但与对照相比相差不大。表明利用本发明的方法可以成功抑制tmy和cyc基因的表达，进一步可以抑制其运动活性。

实验结果表明，利用本发明的方法可以成功抑制松材线虫目的基因(hsp、tmy和cyc基因)的表达，进一步可以降低其抗高温敏感性和抑制其运动活性。

<110> 中国农业大学

<120> 用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂与方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 431

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gaattcacca cctccaagat cgaagatgag gacattgcgt tcaactcctc ccttcttgtc 60

aagaccgtaa gcgatggcag cggcggtggg ctcattgatg attcgaagaa cattcaaacc 120

agcaatagct ccggcgtctt tcgtagcctg acgctgagag tcgttgaagt aggctgggac 180

ggtaacaacg gcatccttga cttcagatcc gaggaaggct tcggcggttt ccttcatctt 240

gataagaacc atagatgaga tctcttcagg gaagaagctc ttggtctctc ctttgtattc 300

gacctgaacc ttaggacgtc caccttcggc ctggacgacc ttgaatggcc agtgcttcat 360

gtcggcttga actgtgggtt catcgaattt acggccaatc aaacgcttgg catcaaatac 420

ggtgtggatc c 431

<210> 2

<211> 291

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

cccgggacca cctccaagat cgaagatgag gacattgcgt tcaactcctc ccttcttgtc 60

aagaccgtaa gcgatggcag cggcggtggg ctcattgatg attcgaagaa cattcaaacc 120

agcaatagct ccggcgtctt tcgtagcctg acgctgagag tcgttgaagt aggctgggac 180

ggtaacaacg gcatccttga cttcagatcc gaggaaggct tcggcggttt ccttcatctt 240

gataagaacc atagatgaga tctcttcagg gaagaagctc ttggtggatc c 291

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 3

gaattcgcct tggccgattc gacttcgatg tatttgatca aatcagctcg ttcatcggcc 60

ttcttgagac cagcgaacac catcttcgtt cctgggatat acttcttggg gttgagcaag 120

tattcgaaca gggtctcacg agtccaaacg acacccttgt tcttgttggc agcggagtaa 180

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cccttctcac aatctccctc aggaatgtca gccaggatcc 340

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<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 4

cccggggcct tggccgattc gacttcgatg tatttgatca aatcagctcg ttcatcggcc 60

ttcttgagac cagcgaacac catcttcgtt cctgggatat acttcttggg gttgagcaag 120

tattcgaaca gggtctcacg agtccaaacg acacccttgt tcttgttggc agcggagtaa 180

tcgaaaccgg gaacggtacc agacttcctt ccgatgattc cattggatcc 230

<210> 5

<211> 383

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gaattcacgt tcggattcat cacagttggc ggaagcctcc tccatcttct cggtggcgat 60

cttcagacgt tcctcagcac gctccaactc ttcttccaaa agggtcatac gacggttcaa 120

ggaagcgacc tcagcctcgg cttcttggac cttcttctcc ttctcctcga gttgggtgtt 180

ggcggctgcc agatcttcct gggccttgtc gaggtcgttc tcggtctgca tgttcttctt 240

ctgggtgtcg cgaagttctt cctcgacgcg ctccagtttc tcctgggttt gacgggcttt 300

ctcttcggcg gcatcggcgc gatcgagggc gttgtccttc tcgatcttca tcgcctgcat 360

cttcttcttg atggcgtgga tcc 383

<210> 6

<211> 242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

cccgggacgt tcggattcat cacagttggc ggaagcctcc tccatcttct cggtggcgat 60

cttcagacgt tcctcagcac gctccaactc ttcttccaaa agggtcatac gacggttcaa 120

ggaagcgacc tcagcctcgg cttcttggac cttcttctcc ttctcctcga gttgggtgtt 180

ggcggctgcc agatcttcct gggccttgtc gaggtcgttc tcggtctgca tgttctggat 240

cc 242