一种新的柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因OTU

摘要

本发明提供了一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因OTU，提供一种新的

说明书

技术领域

本发明提供了一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因OTU，特别涉及该蛋白在端粒酶活性调节中的作用，该蛋白对于E.tenella端粒酶活性具有正向调节的作用，可能成为控制球虫病的潜在靶点，属于基因工程技术领域。

背景技术

鸡球虫病对畜牧业有重要的影响，它正在显著增加全球的经济负担。鸡球虫病大多由于被柔嫩艾美尔球虫感染，它是鸡肠道内最严重的寄生虫疾病。目前球虫病的防控主要依赖抗球虫药和疫苗的使用，但由于药物的残留和耐药性问题已经严重影响了食品安全和公共卫生，以及对球虫的细胞和分子生物学特性了解不足，迄今尚无理想的防控措施。因此，寻找理想的药物和疫苗靶标成为当前研究的重点。目前，柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)序列已被报道，但对其调控蛋白了解甚少。端粒酶相关蛋白的研究为寻找新的抗球虫的药物和疫苗作用靶标以及深入研究球虫的细胞和分子生物学特性等提供重要线索。目前，关于TERT及相关蛋白研究主要集中在哺乳动物，寄生虫中研究报道很少。

发明内容

本发明提供了一种新的柔嫩艾美尔球虫TERT互作蛋白基因OTU(ovariantumour)，该基因编码的蛋白对于E.tenella端粒酶活性具有正向调节的作用，它的发现为深入研究细胞分子生物特性及寻找新的药物疫苗靶标等提供了新的线索。

本发明所述的一种柔嫩艾美尔球虫TERT及其相关蛋白基因OTU，如SEQ NO1，SEQNO2所示。

该基因编码的蛋白是利用酵母双杂交的方法通过TERT蛋白对E.tenella的cDNA文库进行筛选，获得与TERT有相互作用的蛋白，并通过酵母回复试验和pull-down的方法进行阳性验证，从而确定在E.tenella中端粒酶蛋白的互作蛋白OTU。利用E.tenella病毒载体介导的核酶干扰OTU基因在球虫体内的表达，从而研究OTU蛋白在E.tenella体内的功能。

本发明所述的一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因的制备方法，包括以下步骤：

(1)含有TERT基因的重组诱饵质粒的构建：从E.tenella cDNA中通过PCR获得TERT序列，回收目的片段并进行双酶切，与酶切后的pGBKT7载体连接，并转入大肠杆菌中扩增，通过质粒双酶切以及测序鉴定获得阳性克隆，即为可表达融合蛋白的重组质粒；

(2)将重组诱饵质粒转化入酵母菌株，并进行毒性及自激活鉴定；

(3)用酵母双杂交的方法筛选E.tenella cDNA文库中与TRBD(RNA bindingdomain of telomerase reverse transcriptase)相互作用的候选蛋白；

(4)用pull-down和酵母回复的方法进一步验证其互相作用，从而确定其为E.tenella TERT相互作用的蛋白。将TERT蛋白和候选蛋白分别构建到pET-32a和pGEX-4T载体上，在低温条件下，在BL21(DE3)感受态中对可溶性蛋白进行诱导表达及纯化。将纯化的候选蛋白加入Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝胶，4°孵育过夜后，把结合有候选蛋白的琼脂糖凝胶珠子加入TERT蛋白，最后通过Western blot检测分析阳性互作的结果；

(5)设计合成针对互作蛋白基因的的锤头状核酶并连接到E.tenella病毒载体上，用体外转录试剂盒进行体外转录，获得其体外转录本，用荧光定量PCR方法在体内和体外分别分析了病毒载体介导的锤头状核酶对该基因mRNA切割效率；

(6)TRAP法检测转染株端粒酶活性。

本发明的积极效果在于：

提供一种新的E.tenella TERT互作蛋白基因OTU，并确定了其功能，为今后寻找新的药物疫苗靶标及深入研究球虫的细胞分子生物特性等提供了新的线索。本发明通过酵母双杂交筛选和验证获得一个新的阳性互作蛋白，并且对其功能进行探讨，该方法具有实用性，高效性的特点。E.tenella病毒转染载体介导核酶为研究球虫基因对虫体影响以及调控提供了一种简易的方法。

附图说明

附图1为重组诱饵蛋白对酵母菌毒性及自激活作用的检测；

附图2为α-半乳糖苷酶试验检测TRBD与候选蛋白相互作用；

附图3为pull-down验证TRBD与OTU间相互作用；

附图4为E.tenella病毒载体介导的锤头状核酶对OTU-sub体外切割效果检测；

附图5为GFP在E.tenella中的表达情况；

附图6为流式细胞术检测和分选GFP-Ham-OTU株；

附图7A、图7B为Western blot鉴定OTU表达水平变化；

附图8为TRAP检测各虫株中端粒酶活性的变化。

具体实施方式

为进一步说明本发明在柔嫩艾美尔球虫TERT蛋白中的应用，以TERT RNA结合域(TRBD)为实施例进行说明。

实施例1：

E.tenella TRBD诱饵表达质粒的构建

一、材料

Trizol(Invitrogen)；反转录酶试剂盒(Tiangen)；T4DNA连接酶、Ex Taq、dNTPs、pMD18-T、EcoR I、BamH I(TaKaRa)。

二、方法与结果

1E.tenella孢子化卵囊总RNA提取

1.1器皿的处理：将研钵、研杵洗涤干净后，浸泡在0.1％DEPC-H₂O中过夜。随后用锡纸包好，180℃干烤3h备用；

1.2收集的E.tenella孢子化卵囊冰上研磨20min，加入1mL Trizol，室温裂解5min；

1.3加入200μL氯仿，混匀，室温放置15min，12000g、4℃离心15min；

1.4吸取上层约600μL RNA转移至新的离心管，加入500μL异丙醇，混匀，室温放置15min，12000g、4℃离心15min；

1.5去上清，沉淀用75％乙醇洗涤，12000g，4℃离心15min；

1.6去上清，离心管放入超净台内风干5min。RNase-free ddH₂O溶解沉淀。琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。

2E.tenella cDNA的合成

8μL RNA和1μL Oligo dT primer(50uM)以及1uLdNTPs(10mM each)混匀，65℃水浴5min，随后置于冰上2min。加入下列混合物：

30℃10min，42℃水浴1h，95℃5min灭活反转录酶。

3 pGBKT7-TRBD质粒的构建

3.1 PCR扩增目的基因：根据目的基因设计特异引物，并在上下游引物中分别添加了EcoR I和BamH I酶切位点。

下游F-TRBD-BK 5’-GGGGAATTCATTACAAGTACTAGAGTAGTAAATT-3’(斜体为EcoR I酶切位点),

下游R-TRBD-BK 5’-GGGGGATCCTCCTTTTAAACTTTCTAGATAC-3’(斜体为BamH I酶切位点)。

引物由长春库美生物技术服务公司合成。

以cDNA为模板，进行PCR，PCR体系如下：

反应参数为：95℃5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，28cycles；72℃10min。

实施例2：

重组诱饵蛋白对酵母菌株毒性及自激活作用的检测

一、材料

X-α-GAL、鲑鱼精DNA(Sigma)；酵母氮源(Biosharp)；c-Myc(Epitomics)；ECL化学发光试剂盒(Thermo)；酵母质粒小提试剂盒(Tiangen)。

二、方法与结果

1Y187酵母感受态的制备及重组诱饵质粒pGBKT7-TRBD的转化

1.1将冻存的Y187细胞平板划线，30℃温箱培养3～4d至长出直径2～3mm的单克隆；

1.2挑取Y187酵母单克隆细胞，接入含10mL YPDA液体培养基的试管中，并吹打均匀，30℃，210r/min振荡培养至OD₆₀₀>1.5；取4～5mL酵母菌接入50mL>600＝0.4～0.6；

1.3 50mL离心管收集酵母菌液，700g室温离心5min，弃上清；加入25mL ddH₂O重悬洗涤酵母沉淀细胞，700g离心5min，去上清，重复洗涤一次；用1.5mL>2O>

1.4转化质粒与鲑鱼精DNA置于1.5mL离心管中，混匀。

新鲜配制的鲑精DNA需要水浴煮沸20min并且冰浴后使用；

1.5每管加入80uL酵母感受态细胞，振荡混匀；

1.6各加入600uL PEG/LiAc(10×TE 60uL，10×LiAc 60uL，50％PEG 480uL)，为了提高转化效率，混合物需剧烈震荡，30℃，210r/min振荡培养30min；

1.7加入70uL DMSO，缓慢倒置混匀(不能振荡)，42℃水浴15min，迅速插入冰浴冷却1～2min；

1.8室温离心12000g，5sec，尽量弃尽上清，以0.5mL 1×TE(10×TE 50uL，ddH₂O450uL)重悬沉淀细胞，取80uL涂布相应的固体培养板，30℃倒置培养3-5d待菌落长出。

2E.tenella TRBD对酵母菌株毒性

比较分别转化pGBKT7-TRBD和pGBKT7后的酵母大小，二者无明显差异，表明诱饵蛋白对酵母无毒性作用(见附图1)。

3E.tenella TRBD对酵母菌株自激活作用的检测

挑取转化pGBKT7-TRBD和阳性对照pCL1的酵母菌落分别点种于SD/-Trp/X-α-gal和SD/-Leu/X-α-gal琼脂糖平板，30℃温箱培养。结果显示试验组酵母菌落无显色现象，证明诱饵蛋白无法产生自激活活性(见附图1；1：空载体质粒pGBKT7；2：诱饵质粒pGBKT7-TRBD；3：自激活阳性对照质粒pCL1)。

实施例3：

TRBD相互作用蛋白的筛选

一、材料

-Trp/-His/-Leu DO Supplement、-Trp/-His/-Leu/-Ade DO Supplement(Clontech)。

二、方法与结果

1酵母双杂交cDNA文库中筛选与TRBD相互作用的蛋白

1.1挑取转化pGBKT7-TRBD的Y187单克隆于50mL SD/-Trp液体培养基；

1.2 30℃，270r/min摇床培养至OD₆₀₀>0.8(16～20h)，常温离心700g，5min，弃上清；

1.3重悬沉底，并用细胞计数板计数，调整细胞浓度≥1×10⁸细胞/mL；

1.4混合5mL诱饵菌Y187和1mL文库AH109细胞(≥2×10⁷细胞)在一个1L的无菌烧锥形瓶中；

1.5在锥形瓶中加入45mL 2×YPDA液体培养基(含Kan⁺50μg/mL)，文库管用1mL2×YPDA洗涤2次，洗涤液加入锥形瓶中；

1.6 30℃恒温摇床30～50r/min，培养20～24h；

1.7培养20h时，取一滴杂交液在显微镜下查看杂交结果，若杂交液中有三叶草或米老鼠型的杂合子出现则可停止培养，若无则继续培养至杂合子出现4h；

1.8室温1000g离心10min，弃上清。同时用50mL Mili-Q水洗涤锥形瓶2次，并重悬沉淀细胞；

1.9室温1000g离心10min，弃上清。用10mL Mili-Q水重悬细胞；

1.10将细胞用玻璃珠涂布于90mm SD/-His/-Trp/-Leu固体培养基上，每板200μL，30℃恒温培养直至克隆出现；

1.11复制生长在SD/-His/-Trp/-Leu的克隆到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上，30℃培养3～8d；

1.12复制SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp克隆到SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-Gal培养基上并在30℃下生长2～4d。pGBKT7-53/pGADT7-T和pGBKT7-lam/pGADT7-T分别为阳性和阴性对照组。试验组和阳性对照组克隆为蓝色，且阴性对照培养板菌落不生长不显色，初步判断获得的克隆为阳性克隆，见附图2；1：试验组(pGBKT7-TRBD/pGADT7-OTU)；2：阴性对照组(pGBKT7-lam/pGADT7-T)；3：阳性对照组(pGBKT7-53/pGADT7-T)。

2阳性酵母质粒DNA的提取及转化

挑取显蓝色的酵母克隆接种于5mL SD/-Leu液体培养基，30℃，210r/min振荡培养1～2d，使其丢失pGBKT7-TRBD质粒；收集5mL酵母菌，3000g离心2min，弃上清；根据天根公司酵母质粒小提试剂盒说明书，采用玻璃珠法提取酵母质粒。将所提蓝斑质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取生长的阳性菌液克隆送至公司测序。将测序结果的基因序列经NCBI上Blast比对，初步证明了OTU是一个E.tenella TERT互作蛋白，本研究中E.tenella OTU与E.tenella OTU(GenBank:013229759.1)的核酸同源性为100％。核酸序列见序列表1。

试验例1：

阳性互作蛋白pull-down验证

一、材料

anti-His单克隆抗体、anti-GST单克隆抗体(Tiangen)；Glutathione-Sepharose4B(GE,USA)；蛋白酶抑制剂片剂(Roche)；可溶型Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒、GST琼脂糖凝胶。

二、方法与结果

1引物合成及PCR扩增目的基因

根据TRBD序列设计特异引物，

F-TRBD-32a 5’-GGGGGATCCGACATCAAGACTCTTCGGGA-3’(斜体为BamH I酶切位点)，

R-TRBD-32a 5’-GGGCTCGAGTCCTTTTAAACTTTCTAGATAC-3’(斜体为Xho I酶切位点)；

根据OTU基因设计特异引物，F-OTU-4T 5’-GGGGGATCCATGGTGCGCACATGTTTTGAC-3’(斜体为BamH I酶切位点)，R-OTU-4T 5’-GGGGTCGACCTATCCCGGCTTACTTGGCGT-3’(斜体为Sal I酶切位点)。引物由上海生物工程技术服务公司合成。

2重组表达质粒pET-32a-TRBD和pGEX-4T-OTU的构建

将TRBD和OTU分别亚克隆至pET-32a和pGEX-4T构建重组表达质粒重组表达质粒pET-32a-TRBD和pGEX-4T-OTU，经双酶切和序列测定鉴定表明重组表达质粒pET-32a-TRBD和pGEX-4T-OTU构建成功。

3重组蛋白的诱导表达

取pET-32a-TRBD和pGEX-4T-OTU分别转化入BL21(DE3)感受态，加IPTG至终浓度1mM。His-TRBD重组蛋白诱导表达条件为：25℃，过夜；GST-OTU重组蛋白诱导表达条件为：18℃，20小时。8000r/min离心2min收集菌体。

4重组蛋白的鉴定

将收集的菌液加入800μL PBS，55％功率超声10min，12000g离心15min，分离上清及沉淀进行SDS-PAGE分析，结果表明二者均能用可溶性的形式表达。

5重组蛋白的纯化

200mL LB培养基中加入5mL菌液，37℃ 180r/min振荡培养45min，加IPTG至终浓度1mM诱导表达蛋白。8000r/min离心20min收集菌体。

His-TRBD纯化：每100mg菌体(湿重)加入3mL细菌裂解液，55％功率冰上超声裂解菌体至菌液变清；12000g，4℃离心20min，收集上清中的可溶性蛋白；用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后上柱并收集流穿液；使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白；使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即蛋白。

GST-OTU纯化：10mL冰上预冷的1×PBS重悬沉淀，冰上超声破碎菌体至透明状；12000g，4℃离心20min，收集上清中的可溶性蛋白；PBS平衡层析柱，然后加入含目的蛋白的上清，以使目的蛋白与琼脂糖凝胶结合；上样完成后，20倍柱床体积的PBS洗涤凝胶以去除杂蛋白；用10～15倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱GST融合蛋白，并分管收集(GST标签蛋白以相同方法纯化，做对照试验)。

SDS-PAGE分析表明纯化蛋白效果较好，可用于后续试验。

6pull-down

6.1 1.5mL离心管中加入100μL蛋白Glutathione-Sepharose 4B珠子，lysisbuffer洗涤3次；

6.2lysis buffer中加入GST-OTU蛋白，并加入蛋白酶抑制剂，4℃摇床孵育过夜。阴性对照组中加入His-TRBD和GST；

6.3离心后弃去上清，用PBS洗三次，在珠子中加入His-TRBD可溶性蛋白，4℃孵育2h；

6.4PBS洗涤珠子3次；

6.5加入30μL 1×SDS-loading buffer，沸水煮5min以分离蛋白；

6.6Western blot分析结果。试验组的Western blot分析，anti-His标签能检测到His-TRBD，表明二者有相互作用。而对照组His-TRBD/GST中，Western blot无法检测到TRBD蛋白，表明GST标签蛋白不能与His-TRBD结合，见附图3；1.GST/His-TRBD；2.GST-OTU/His-TRBD；3.input。

试验例2：

E.tenella病毒载体介导锤头状核酶对OTU体外切割效果研究

一、材料

T7体外转录试剂盒(Promega Corporation)；FastStart Universal SYBR GreenMaster(Rox)(F.Hoffmann-La Roche，Ltd)；荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)；anti-α-tubulin抗体(碧云天生物技术有限公司)。

二、方法与结果

1序列合成

注：其中斜体部分为酶切位点，下划线部分为锤头状核酶。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

2重组质粒构建

以E.tenella cDNA为模板、OTU-sub-F/OTU-sub-R为引物，PCR扩增切割底物，并亚克隆至pEtV-GFP-CFP，构建重组质粒pEtV-OTU-sub。将Ham-OTU-F/Ham-OTU-R、Ham-MIC-F/Ham-MIC-R和Noham-OTU-F/Noham-OTU-F三对引物95℃变性5min，缓慢退火至室温。将三个片段分别与经Hind III/Sal I酶切后的本实验室保存的pEtV-GFP-CFP载体连接，经改造构建成重组质粒pEtV-GFP-Ham-OTU、pEtV-GFP-Ham-MIC和pEtV-GFP-Noham-OTU。

3体外切割

将pEtV-OTU-sub、pEtV-GFP-Ham-OTU、pEtV-GFP-Ham-MIC和pEtV-GFP-Noham-OTU经引物T7-F/T7-R PCR扩增。PCR产物凝胶回收后作为模板，用T7体外转录试剂盒进行体外转录。

将pEtV-GFP-Ham-OTU、pEtV-GFP-Ham-MIC和pEtV-GFP-Noham-OTU的转录产物RNA与pEtV-OTU-sub转录的RNA以分子比为5:1的比率混合于Tris-HCl(pH 8.0)的溶液至终浓度为50mM，95℃，3min；37℃，5min；最后加入MgCl₂至终浓度10mM启动切割反应，37℃，3h，每个反应设3个重复。

4体外切割效率检测

以OTU-sub-R为引物，将pEtV-OTU-sub转录的产物RNA反转录成cDNA。用RNase-free H₂O将cDNA按10^-2～10^-7梯度稀释后，各取1μL进行Real-time>

以pEtV-GFP-Ham-OTU、pEtV-GFP-Ham-MIC和pEtV-GFP-Noham-OTU切割后的混合物为模板，OTU-sub-R为引物进行RT反应。各取1μL cDNA进行Real-time PCR反应，用以检测pEtV-GFP-Ham-OTU体外转录体的切割效率。每个梯度样品做3个重复。Real-time PCR结果表明，pEtV-GFP-Ham-OTU体外转录RNA对pEtV-OTU-sub体外转录体RNA的切割效率显著，达到85.24％。而pEtV-GFP-Noham-OTU体外转录体对pEtV-OTU-sub体外转录体RNA的影响较小，效率仅为20％，pEtV-GFP-Ham-MIC对pEtV-OTU-sub外转录体RNA反转录影响，见附图4。

试验例3：

E.tenella病毒载体介导锤头状核酶对OTU体内切割效果研究

一、材料

GFP-CFP转染株由本实验室构建并保存；anti-α-tubulin抗体(碧云天)；电转仪及电转杯(BTX)；流式细胞仪FACS Aria II(BD)。

二、方法与结果

1转基因卵囊的分离

在电转杯中加入20μL pEtV-GFP-Ham-OTU体外转录RNA、30μL未孢子化卵囊(1×10⁵个)和50μL电转缓冲液，冰浴15min后进行电转。电转条件：电压500V，时间0.3ms，电击3次，每次间隔100ms。电转完毕后，冰浴15min，转移未孢子化卵囊至6孔细胞培养板中，加入适量K₂Cr₂O₇进行孢子化。

将转染pEtV-GFP-Ham-OTU体外转录RNA的孢子化卵囊(定义为GFP-Ham-OTU株)接种10日龄雏鸡，收取接种5～7d后的粪便并分离卵囊。激光共聚焦显微镜观察转染后RFP的表达情况，可见GFP-Ham-OTU株可观察到绿色荧光，未转染组无荧光，见附图5；A：GFP-Ham-OTU未孢子化卵囊；B：GFP-Ham-OTU孢子化卵囊。

将分离的带有红色荧光卵囊进行流式细胞分选，分选后的卵囊接种10日龄雏鸡，收取接种5～7d后的粪便并分离卵囊。二代卵囊中带绿色荧光的卵囊比例为26.9％(见附图6；A：野生株；B：转染GFP-Ham-OTU二代卵囊)。将混合的卵囊经过流式细胞分选。

2体内切割效果及蛋白含量的检测

分别提取分别提取野生株、GFP-Ham-OTU株以及GFP-CFP株的总RNA,体外反转录，用2ul反转录产物为模板，进行Real-time PCR反应，同时设立阴性对照。提取野生株、GFP-Ham-OTU株以及GFP-CFP株卵囊的虫体蛋白，Western blot检测OTU表达量，蛋白上样量为20μg。以anti-OTU多克隆抗体以及anti-α-GAPDH抗体(内参)为一抗，以HRP标记的羊抗兔及羊抗鼠IgG为二抗。相对于野生株，GFP-Ham-OTU株下调，见附图7A(1：野生型未孢子化卵囊；2：转染RFP-GFP未孢子化卵囊；3：转染GFP-Ham-OTU未孢子化卵囊)、图7B(E.tenella病毒载体介导的锤头状核酶对OTU-sub体内切割效果)。结果表明构建的锤头状核酶在E.tenella体内成功的干扰了OTU的表达。

试验例4：

TRAP法检测转染株端粒酶活性

一、材料

端粒酶活性检测试剂盒(Millipore)。

二、方法与结果

1引物合成

根据E.tenella端粒DNA重复序列设计TRAP反应引物。

2 TRAP方法检测端粒酶活性

RNase-free PBS洗涤未孢子化卵囊后，取1×10⁷个虫体加200μL>

TRAP反应体系：

端粒酶提取物2μL(600ng)10×TRAP Buffer5μL50×dNTP Mix1μLTS引物1μLddH₂O39μL

30℃反应30min，95℃灭活5min。然后加入PR引物1μL，rTaq 1μL进行PCR扩增。

扩增参数为：94℃1min，59℃1min，72℃1min，33cycles。

12％非变性PAGE凝胶电泳，EB染色，见附图8(M：DNA分子量(DL500DNA Marker)；1：HeLa细胞TRAP产物(阳性对照)；2：野生型未孢子化卵囊TRAP产物；3：转染GFP-GFP未孢子化卵囊TRAP产物；4：转染GFP-Ham-OTU未孢子化卵囊TRAP产物)。结果表明：当OTU基因表达被抑制后，E.tenella端粒酶活性降低，表明OTU对于端粒酶活性具有正向调节的作用。

柔嫩艾美尔球虫TRBD序列

<110>吉林大学

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211>513

<212> DNA

<213>柔嫩艾美尔球虫（Emeriatenella）

<400> 1

1attacaagtactagagtagtaaattttttatctagatacttgattaaagtattaccaaag

61 aatatacttttaggtacctttaaaaactttaagacttttattaataaaaagatcccaataa

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柔嫩艾美尔球虫OTU序列

<110>吉林大学

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 1107

<212> DNA

<213>柔嫩艾美尔球虫（Emeriatenella）

<400> 1

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