拟南芥SSCD1基因突变在调控植物体内茉莉酸合成中的应用

摘要

一种拟南芥SSCD1基因突变在调控植物体内茉莉酸合成中的应用，该SSCD1突变基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过对比短日照条件下野生型拟南芥Col‑0和SSCD1基因突变型拟南芥sscd1体内茉莉酸合成基因的表达、茉莉酸的含量、茉莉酸防御途径下游响应基因的表达，发现该SSCD1基因的突变能影响植物体内茉莉酸的合成，改变植物体内茉莉酸的含量，激活茉莉酸防御途径，诱导茉莉酸防御途径下游响应基因的表达，通过对该基因进行改造，能提高植物体内的茉莉酸含量，培育具有高茉莉酸含量的植物。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程应用技术领域，主要涉及拟南芥SSCD1基因突变在短日照条件下能调控茉莉酸的合成，从而影响植物体内茉莉酸参与和介导的防御系统。

背景技术

每年的9月到第二年的3月，我国大部分地区都属于短日照时期。而这一时期正是农作物收获的季节，为了保证农作物的产量和质量，农业生产者通过喷施农药来减少病虫害的发生，但随着人们生活水平的提高，对无公害、纯天然的绿色农产品的需求日渐增长，喷施农药或使用化肥的农产品越来越难达到人们的要求。因此，在农业生产上，需要改变传统的依靠农药来防治病虫害的方法。

茉莉酸是广泛分布在植物体内的一种新型激素，随着对其研究的深入，人们发现茉莉酸对植物的生长发育以及植物的防御有着重要的作用。有研究表明，茉莉酸可以显著抑制植物的生长，调节花粉的发育(Kazan and Manners.2012)，促进叶片的衰老、果实的成熟，诱导植物块茎的形成(Creelman and Mullet.1995)。另一方面，茉莉酸可以参与调节植物的防御反应，增强植物对病虫害、逆境环境的抗性(Yang et al.2012)。在农业生产上，就有通过外源喷施茉莉酸来防治农作物病虫害的方法，但是受到外界环境的影响，这种方法的效果并不稳定。

拟南芥SSCD1基因是参与体内酪氨酸降解途径的一个关键基因，该基因发生突变会在短日照条件下形成一种模拟病斑的表型(Han et al.2013)。大量的研究表明产生模拟病斑表型的植株，其体内的茉莉酸或其它激素所介导的防御途径往往会有明显的变化。但是目前关于该基因在提升植物体内茉莉酸含量方面的研究和应用还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟南芥SSCD1基因突变在调控植物体内茉莉酸合成中的应用，拟南芥SSCD1基因突变在短日照条件下能促进拟南芥体内茉莉酸合成、提高茉莉酸含量。为农业生产上借助于茉莉酸进行病虫害防治以及调节作物生长提供一定的参考和帮助，为培育短日照条件下高茉莉酸含量的植物奠定基础。

为达上述目的，本发明采用的技术方案是：一种拟南芥SSCD1突变基因于短日照条件下在调控植物体内茉莉酸合成中的应用，该SSCD1突变基因序列如SEQ ID No.2所示。

在短日照条件下，SSCD1突变基因能诱导植物体内茉莉酸合成基因的表达，提升体内茉莉酸含量，并诱导茉莉酸防御途径下游响应基因的表达，即该SSCD1基因的突变可以调控茉莉酸的合成，并可以激活植物体内茉莉酸所介导的防御途径。

本发明主要通过基因工程技术手段，使拟南芥体内的SSCD1基因发生点突变，无法正常编码延胡索酰乙酰乙酸酶(FAH)，中断体内的酪氨酸降解途径。在短日照条件下，SSCD1基因发生突变后的拟南芥植株体内茉莉酸合成基因LOX2以及AOS表达明显上调，茉莉酸含量明显的升高，同时茉莉酸防御途径被激活，其下游响应基因表达量明显的上调。

如此，本发明通过对比短日照条件下野生型拟南芥Col-0和SSCD1基因突变型拟南芥sscd1体内茉莉酸合成基因的表达、茉莉酸的含量、茉莉酸防御途径下游响应基因的表达，发现该基因的突变能影响植物体内茉莉酸的合成，改变植物体内茉莉酸的含量，激活茉莉酸防御途径，诱导茉莉酸防御途径下游响应基因的表达，通过对该基因进行改造，能提高植物体内的茉莉酸含量，培育具有高茉莉酸含量的植物。

附图说明

图1为在长日照条件下生长2周后转入短日照条件下生长3天的野生型拟南芥Col-0以及SSCD1基因突变拟南芥sscd1材料体内茉莉酸生物合成基因LOX2、AOS的表达情况。

其中，A：LOX2基因，B：AOS基因，C：野生型拟南芥Col-0，S：SSCD1基因突变拟南芥sscd1材料。

图2为在长日照条件下生长2周后转入短日照条件下生长2至3天的野生型拟南芥Col-0以及SSCD1基因突变拟南芥sscd1材料体内茉莉酸含量检测结果。

图3为在长日照条件下生长2周后转入短日照条件下生长3天的野生型拟南芥Col-0以及SSCD1基因突变拟南芥sscd1材料体内茉莉酸防御途径下游响应基因PDF1.2、VSP2、THI2.1的表达情况。

其中，A：PDF1.2基因，B：VSP2基因，C：THI2.1基因，C(横标)：野生型拟南芥Col-0，S：SSCD1基因突变拟南芥sscd1材料。

具体实施方式

下述提及的拟南芥SSCD1基因突变体种子(sscd1突变体种子)是通过EMS诱变拟南芥野生型(Col-0)而获得，参见CN102911946B中记载的化学诱变处理过程，该sscd1突变体中SSCD1基因(SSCD1基因CDS序列如SEQ ID No.1所示)发生突变(该SSCD1基因突变后的CDS序列如SEQ ID No.2所示)，使其不能正常编码相关蛋白质。

实施例1短日照条件下，SSCD1突变基因使突变体中茉莉酸合成基因LOX2以及AOS表达明显上调

(A)材料的培养：将野生型拟南芥Col-0种子和sscd1突变体种子分别用消毒液(含有20％的84消毒液以及0.01％的TritonX-100)消毒10分钟，无菌水清洗3-5次后铺在MS(含有1％蔗糖)的固体培养基上，4℃低温条件下春化。3天后置于长日照培养室进行培养，具体培养条件为：光/暗周期为16h/8h，温度22℃，光照强度100umolm-2s-1，相对湿度70％。生长7天后，将幼苗移到新的无菌MS培养基上，移苗过程要注意不损伤幼苗，同时要留出足够的空间保证幼苗能够正常生长，将移植的幼苗继续置于长日照培养室培养7天，然后转入短日照培养室培养3天，短日照培养条件为：光/暗周期为8h/16h，温度22℃，光照强度100umolm-2s-1，相对湿度70％，分别得到野生型拟南芥Col-0幼苗材料和sscd1突变体幼苗材料。

(B)拟南芥Col-0和sscd1突变体幼苗材料RNA的提取及cDNA的获得：将短日照条件下生长3天的2种拟南芥幼苗材料(100-200mg)分别置于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，然后移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol Reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，然后剧烈振荡,使植物粉末与RNA提取液充分混匀,室温静置5min；向离心管中加入200μl氯仿，剧烈振荡1min，然后室温静置5min；4℃、12000g离心15min；将上清液转移至新离心管中,加入与上清等体积的异丙醇和高盐溶液混合溶液(高盐溶液以1.2M氯化钠、0.8M梓檬酸钠及1％(V/V)DEPC水配制)，充分混匀，室温沉淀l0min；4℃、12000g离心10min；去上清液，加入1ml 75％乙醇，上下颠倒，充分清洗沉淀，4℃、8000g，5min离心；去上清液，吸干剩余乙醇，室温下瞭干至乙醇完全挥发，加入10-30μl0.1％DEPC水，使RNA充分溶解，分别得到2种材料的RNA。分别取1μl RNA，检测OD260/OD230、OD260/OD280值和浓度。

采用东洋纺(TOYOBO)公司生产的Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix withgDNA Remove试剂盒(FSQ-301)合成cDNA：第一步根据所测得的RNA浓度算好所需RNA体积，使每个体系含有1000ng的RNA，并用ddH2O补足到14μl，65℃处理5分钟，取出立即置于冰上；第二步向每个体系中加入3μl的4x DN Master Mix溶液(含有1/50体积的gDNA Remover溶液)，37℃处理5分钟，取出立即置于冰上；第三步向每个反应体系中加入3μl的5xRT MasterMixⅡ溶液，37℃处理15min，50℃处理5min，98℃处理5min，cDNA合成完成，分别取2种材料的1μl cDNA，检测OD260/OD230、OD260/OD280值和浓度。

(C)QRT-PCR分别检测2种材料的基因的表达情况：根据所测得的cDNA浓度计算每个反应体系所需cDNA体积，每个体系所含cDNA为200ng，补ddH2O到2μl，然后依次加入2.2μl的ddH2O、0.4μl的正向引物、0.4μl的反向引物、5μl的罗氏(Roche)SYBR荧光染液，总计10μl的反应体积，以拟南介ACTIN2基因为内参。QRT-PCR所用仪器为BIO-RAD公司生产的CFXConnect Real-Time System，具体反应程序为：第一步95℃10min；第二步95℃15s，55℃1min，72℃30s循环40次。所得数据采用2^-ΔΔCt进行计算。

本实验所用引物序列如下：

ACTIN2-FP：5-AGCACTTGCACCAAGCAGCATG-3(SEQ ID No.3)，

ACTIN2-RP:5-ACGATTCCTGGACCTGCCTCATC-3(SEQ ID No.4)；

LOX2-FP:5-TGCTCCCCAGAATCATCAAA-3(SEQ ID No.5)，

LOX2-RP:5-AAACTCGTCGTCTCGTAACCAT-3(SEQ ID No.6)；

AOS-FP:5-TTTTACGACCAAGGAGCTGAAG-3(SEQ ID No.7)，

AOS-RP:5-CGGTGGCATGTTGACTCTGTA-3(SEQ ID No.8)。

结果如图1所示，在短日照条件下生长3天，SSCD1基因发生突变的sscd1材料体内茉莉酸合成基因LOX2以及AOS的表达量要明显的高于野生型Col-0材料。表明：短日照条件下,SSCD1突变基因能诱导茉莉酸合成基因的表达。

实施例2短日照条件下，SSCD1突变基因能提升植物体内茉莉酸含量

(A)材料的培养：将野生型拟南芥Col-0种子和sscd1突变体种子分别用消毒液(含有20％的84消毒液以及0.01％的TritonX-100)消毒10分钟，无菌水清洗3-5次后铺在MS(含有1％蔗糖)的固体培养基上，4℃低温条件下春化。3天后置于长日照培养室进行培养，具体培养条件为：光/暗周期为16h/8h，温度22℃，光照强度100umolm-2s-1，相对湿度70％。生长7天后，将幼苗移到新的无菌MS培养基上，移苗过程要注意不损伤幼苗，同时要留出足够的空间保证幼苗能够正常生长，将移植的幼苗继续置于长日照培养室培养7天，然后转入短日照培养室培养3天，短日照培养条件为：光/暗周期为8h/16h，温度22℃，光照强度100umolm-2s-1，相对湿度70％。

(B)茉莉酸含量检测：分别取新鲜的2种拟南芥材料2g,剪碎，加入15ml 4℃预冷的80％甲醇浸提12小时，冰上研磨成匀浆，1400rpm/min离心15分钟，取上清液，用5ml0.2mol/L的Na₂HPO₄-H₃PO₄缓冲液加适量石油醚萃取，弃去上层醚相，保留水相，重复萃取至上层清澈无色为止，加Na₂HPO₄调节pH值为8.0。再加5ml乙酸乙酯混合萃取，6000rpm/min离心5分钟，取酯相，重复1-2次。将酯相在20℃减压条件下浓缩抽干，用505色谱纯甲醇定容至1ml，然后用高效液相色谱测定。

结果如图2所示，通过检测短日照条件下生长2至3天的野生型拟南芥Col-0材料和SSCD1基因突变拟南芥sscd1材料中的茉莉酸含量，发现在短日照生长条件下，SSCD1基因突变的拟南芥sscd1材料体内的茉莉酸含量要明显地高于野生型拟南芥Col-0材料，随着短日照生长时间的增加，sscd1材料体内的茉莉酸含量也随着增加。表明：在短日照条件下，SSCD1突变基因能提升植物体内的茉莉酸含量，并且这种提升随着短日照的持续而一直保持。

实施例3短日照条件下，SSCD1突变基因诱导茉莉酸防御途径下游响应基因PDF1.2、VSP2、THI2.1的表达

(A)材料的培养：将野生型拟南芥Col-0种子和sscd1突变体种子分别用消毒液(含有20％的84消毒液以及0.01％的TritonX-100)消毒10分钟，无菌水清洗3-5次后铺在MS(含有1％蔗糖)的固体培养基上，4℃低温条件下春化。3天后置于长日照培养室进行培养，具体培养条件为：光/暗周期为16h/8h，温度22℃，光照强度100umolm-2s-1，相对湿度70％。生长7天后，将幼苗移到新的无菌MS培养基上，移苗过程要注意不损伤幼苗，同时要留出足够的空间保证幼苗能够正常生长，将移植的幼苗继续置于长日照培养室培养7天，然后转入短日照培养室培养3天，短日照培养条件为：光/暗周期为8h/16h，温度22℃，光照强度100umolm-2s-1，相对湿度70％，分别得到野生型拟南芥Col-0幼苗材料和sscd1突变体幼苗材料。

(B)拟南芥Col-0和sscd1幼苗材料RNA的提取及cDNA的获得：将短日照条件下生长3天的2种拟南芥幼苗材料(100-200mg)分别置于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，然后将其移入1.5ml离心管中，加入 1ml Trizol Reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，然后剧烈振荡，使植物粉末与RNA提取液充分混匀，室温静置5min；向离心管中加入200μl氯仿，剧烈振荡1min，然后室温静置5min；4℃、12000g离心15min；将上清液转移至新离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇和高盐溶液混合溶液(高盐溶液以1.2M氯化钠、0.8M梓檬酸钠及1％(V/V)DEPC水配制)，充分混匀，室温沉淀l0min；4℃、12000g离心10min，去上清液，加入1ml 75％乙醇，上下颠倒，充分清洗沉淀，4℃、8000g，5min离心；去上清液，吸干剩余乙醇，室温下瞭干至乙醇完全挥发，加入10-30μl0.1％DEPC水，使RNA充分溶解，分别得到2种材料的RNA；分别取1μl RNA，检测OD260/OD230、OD260/OD280值和浓度。

采用东洋纺(TOYOBO)公司生产的Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix withgDNA Remove试剂盒(FSQ-301)合成cDNA：第一步根据所测得的RNA浓度算好所需RNA体积，使每个体系含有1000ng的RNA，并用ddH2O补足到14μl，65℃处理5分钟，取出立即置于冰上；第二步向每个体系中加入3μl的4x DN Master Mix溶液(含有1/50体积的gDNA Remover溶液)，37℃处理5分钟，取出立即置于冰上；第三步向每个反应体系中加入3μl的5xRT MasterMixⅡ溶液，37℃处理15min，50℃处理5min，98℃处理5min，cDNA合成完成，分别得到2种材料的cDNA。分别取1μl cDNA，检测OD260/OD230、OD260/OD280值和浓度。

(C)QRT-PCR检测基因的表达情况：根据所测得的cDNA浓度计算每个反应体系所需cDNA体积，每个体系所含cDNA为200ng，补ddH2O到2μl，然后依次加入2.2μl的ddH2O、0.4μl的正向引物、0.4μl的反向引物、5μl的罗氏(Roche)SYBR荧光染液，总计10μl的反应体积，以拟南介ACTIN2基因为内参。QRT-PCR所用仪器为BIO-RAD公司生产的CFX Connect Real-Time System，具体反应程序为：第一步95℃10min；第二步95℃15s，55℃1min，72℃30s循环40次。所得数据采用2^-ΔΔCt进行计算。

本实验所用引物序列如下：

ACTIN2-FP：5-AGCACTTGCACCAAGCAGCATG-3(SEQ ID No.3)，

ACTIN2-RP:5-ACGATTCCTGGACCTGCCTCATC-3(SEQ ID No.4)；

PDF1.2-FP:5-GCTTCCATCATCACCCTTATC-3(SEQ ID No.9)，

PDF1.2-RP:5-TTGGCTTCTCGCACAACTT-3(SEQ ID No.10)；

THI2.1-FP:5-GGTTGGGTAAACGCCATTCT-3(SEQ ID No.11)，

THI2.1-RP:5-CATTGTTCCGACGCTCCATT-3(SEQ ID No.12)；

VSP2-FP:5-GGATTGAACCCATCATACTCAG-3(SEQ ID No.13)，

VSP2-RP:5-CACGAGACTCTTCCTCACCTTT-3(SEQ ID No.14)。

结果如图3所示，通过对比短日照条件下野生型拟南芥Col-0和SSCD1基因突变拟南芥sscd1材料中茉莉酸防御途径下游响应基因PDF1.2、VSP2、THI2.1的表达情况，结果发现SSCD1基因突变后，在短日照条件下，其体内的PDF1.2、VSP2、THI2.1基因的表达量明显地上调，其表达量与Col-0相比有明显地提升。表明：短日照条件下，SSCD1突变基因能够引起茉莉酸防御途径下游响应基因的表达，调控植物体内茉莉酸所介导的防御途径。

综上所述，通过上述实验，证明了短日照条件下SSCD1突变基因能诱导茉莉酸生物合成基因的表达，促使植物体内产生茉莉酸的积累，并引起茉莉酸防御途径下游响应基因的表达。本发明为在短日照条件下通过提升植物内源茉莉酸含量来提高植物对病虫害的抗性提供了理论基础，并为培育高茉莉酸含量植物提供了实践基础。

参考文献：

1.Kazan k,Manner JM(2012).JAZ repressors and the orchestration ofphytohormone crosstalk.TRENDS IN PLANT SCIENCE.17:22-31

2.Creelman,R.A.,and Mullet,J.E(1995).Jasmonic acid distribution andaction in plants-regulation during development and response to biotic andabiotic stress.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 92:4114-4119

3.Yang,Dong-Lei,Yao,Jian,Chuan-ShengMei,et al(2012).Plant hormonejasmonate prioritizes defense over growth by interfering with gibberellinsignaling cascade.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America.19:1192-1200

4.Han CY,Ren CM,Zhi TT,Zhou Z,Liu Y,Chen F,Peng W,Xie DX(2013)Disruption of fumarylacetoacetate hydrolase causes spontaneous celldeathunder short-day conditions in Arabidopsis.Plant Physiol.162:1956-1964。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南农业大学

<120> 拟南芥SSCD1基因突变在调控植物体内茉莉酸合成中的应用

<130> 012

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> SSD1基因的CDS序列

<400> 1

atggcgttgc tgaagtcttt catcgatgtt ggctcagact cgcacttccc tatccagaat 60

ctcccttatg gtgtcttcaa accggaatcg aactcaactc ctcgtcctgc cgtcgctatc 120

ggcgatttgg ttctggacct ctccgctatc tctgaagctg ggcttttcga tggtctgatc 180

cttaaggacg cagattgctt tcttcagcct aatttgaata agttcttggc catgggacgg 240

cctgcgtgga aggaagcgcg ttctacgctg caaagaatct tgtcatctaa tgaacctatc 300

ttgcgagaca atgatgtttt gaggagaaaa tcattccatc agatgagtaa agtggaaatg 360

attgttccta tggtgattgg ggactataca gacttctttg catctatgca tcacgcgaag 420

aactgcggac ttatgttccg tgggcctgag aatgcgataa acccaaattg gtttcgtctt 480

cccattgcat atcatggacg ggcatcatct attgtcatct ctgggactga cattattcga 540

ccaagaggtc agggccatcc acaaggaaac tctgaaccat attttggacc ttcgaagaaa 600

cttgattttg agcttgagat ggctgctgtg gttggtccag gaaatgaatt gggaaagcct 660

attgacgtga ataatgcagc cgatcatata tttggtctat tactgatgaa tgactggagt 720

gctagggata ttcaggcgtg ggagtatgta cctcttggtc ctttcctggg gaagagtttt 780

gggactacta tatccccttg gattgttacc ttggatgcgc ttgagccttt tggttgtcaa 840

gctcccaagc aggatccacc tccattgcca tatttggctg agaaagagtc tgtaaattac 900

gatatctcct tggaggttca acttaaacct tctggcagag atgattcttg tgtaataaca 960

aagagcaact tccaaaactt atattggacc ataacgcagc agctagcaca ccataccgtt 1020

aacggttgca atttgaggcc tggtgatctc cttggcacag gaaccataag cggaccggag 1080

ccagattcat atgggtgcct acttgagttg acatggaatg gacagaaacc tctatcactc 1140

aatggaacaa ctcagacgtt tctcgaagac ggagaccaag tcaccttctc aggtgtatgc 1200

aagggagatg gttacaatgt tgggtttgga acatgcacag ggaaaattgt tccttcaccg 1260

ccttga 1266

<210> 2

<211> 1266

<212> DNA

<213> ssd1突变体中SSD1基因的CDS序列

<400> 2

atggcgttgc tgaagtcttt catcgatgtt ggctcagact cgcacttccc tatccagaat 60

ctcccttatg gtgtcttcaa accggaatcg aactcaactc ctcgtcctgc cgtcgctatc 120

ggcgatttgg ttctggacct ctccgctatc tctgaagctg ggcttttcga tggtctgatc 180

cttaaggacg cagattgctt tcttcagcct aatttgaata agttcttggc catgggacgg 240

cctgcgtgga aggaagcgcg ttctacgctg caaagaatct tgtcatctaa tgaacctatc 300

ttgcgagaca atgatgtttt gaggagaaaa tcattccatc agatgagtaa agtggaaatg 360

attgttccta tggtgattgg ggactataca gacttctttg catctatgca tcacgcgaag 420

aactgcggac ttatgttccg tgggcctgag aatgcgataa acccaaatta gtttcgtctt 480

cccattgcat atcatggacg ggcatcatct attgtcatct ctgggactga cattattcga 540

ccaagaggtc agggccatcc acaaggaaac tctgaaccat attttggacc ttcgaagaaa 600

cttgattttg agcttgagat ggctgctgtg gttggtccag gaaatgaatt gggaaagcct 660

attgacgtga ataatgcagc cgatcatata tttggtctat tactgatgaa tgactggagt 720

gctagggata ttcaggcgtg ggagtatgta cctcttggtc ctttcctggg gaagagtttt 780

gggactacta tatccccttg gattgttacc ttggatgcgc ttgagccttt tggttgtcaa 840

gctcccaagc aggatccacc tccattgcca tatttggctg agaaagagtc tgtaaattac 900

gatatctcct tggaggttca acttaaacct tctggcagag atgattcttg tgtaataaca 960

aagagcaact tccaaaactt atattggacc ataacgcagc agctagcaca ccataccgtt 1020

aacggttgca atttgaggcc tggtgatctc cttggcacag gaaccataag cggaccggag 1080

ccagattcat atgggtgcct acttgagttg acatggaatg gacagaaacc tctatcactc 1140

aatggaacaa ctcagacgtt tctcgaagac ggagaccaag tcaccttctc aggtgtatgc 1200

aagggagatg gttacaatgt tgggtttgga acatgcacag ggaaaattgt tccttcaccg 1260

ccttga 1266

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 3

agcacttgca ccaagcagca tg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成

<400> 4

acgattcctg gacctgcctc atc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 5

tgctccccag aatcatcaaa 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 6

aaactcgtcg tctcgtaacc at 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 7

ttttacgacc aaggagctga ag 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 8

cggtggcatg ttgactctgt a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 9

gcttccatca tcacccttat c 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 10

ttggcttctc gcacaactt 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 11

ggttgggtaa acgccattct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 12

cattgttccg acgctccatt 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 13

ggattgaacc catcatactc ag 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 14

cacgagactc ttcctcacct tt 22