一种解磷菌PC05及其分离筛选方法

摘要

本发明公开了一种解磷菌PC05及其分离筛选方法，所述解磷菌PC05菌株名称为Inquilinus ginsengisoli PC05，已于2016年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016347，地址：中国，武汉，武汉大学。本发明培养制得的一种解磷菌PC05可以丰富野生解磷菌遗传资源，具有较高的解磷能力,增加土壤中有效磷的含量，提高土壤中难溶性磷的利用效率，减少磷肥施用量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种农业微生物技术领域，具体涉及一种解磷菌PC05及其分离筛选方法。

背景技术

磷在植物体中的含量仅次于氮和钾，是植物生长发育的关键营养元素之一。缺磷土壤一般是指土壤有效磷(P)小于10mg/kg的土壤，我国缺磷土壤面积超过耕地总面积的74％，土壤中的磷绝大部分以难溶性磷酸盐形式存在，植物无法直接吸收利用。为满足生产需要，我国绝大部分的耕种田都要大量补充磷化肥，由于长期的累积和富集，造成了土壤板结、营养元素失衡等一系列生产、生态问题，故如何改善和提高我国耕作田土壤磷的利用率，仍然是一项战略性课题。从已有的文献报道来看，解磷菌种类繁多复杂，解磷能力也参差不齐，并且应用于实际生产的菌种种类少，缺乏创新，从这个角度看，筛选具有较强解磷能力野生菌株的工作仍然具有重大意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种解磷菌PC05及其分离筛选方法，可以丰富野生解磷菌遗传资源，获取具有较强解磷能力的解磷菌株。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种解磷菌PC05，所述解磷菌PC05菌株名称为Inquilinusginsengisoli PC05，已于2016年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016347，地址：中国，武汉，武汉大学。

一种如权利要求1所述的解磷菌PC05的分离筛选方法，包括如下步骤：

(1)无机磷固体培养基的制备：按重量份数计，培养基由下述成分组成：葡萄糖10g、(NH₄)₂SO₄>4·H₂O>4·7H₂O>4·H₂O>3(PO₄)₂>3(PO₄)₂与其余成分分开灭菌后混合，调节pH为7.0～7.2；

(2)取10mL猪泡粪液样品，放入带有玻璃珠的试剂瓶中，加入90mL无菌水，在28～30℃恒温振荡30～45min，使样品均匀分散于无菌水中，得到稀释倍数为10^-1的菌悬液，将菌悬液静置后取上清液，依次稀释得到10^-3、10^-5、10^-7倍浓度梯度的样品菌悬液，10^-3、10^-5、10^-7倍浓度梯度的菌悬液各取0.1mL，依次均匀的涂布在无机磷固体培养基上，放入恒温培养箱中，在30℃条件下恒温培养3～5天后，观察并记录菌落及溶磷圈的大小，做好菌种标记，筛选出6株解磷菌PC01、PC02、PC03、PC04、PC05、PC06，比较6株解磷菌在无机磷固体培养基上的溶磷圈直径(HD)与菌落直径(CD)的比值，筛选出HD/CD值最大的菌株即为解磷菌PC05。

如上述所述的解磷菌PC05的鉴定方法为：利用引物27F和1492R对菌株PC05进行扩增和正向测序，得到序列长度为1445bp，通过BLAST将序列与GenBank数据库中序列进行对比，其与NR_112560.1相似性超过99％，鉴定其为Inquilinus ginsengisoli。

本发明的有益效果在于：本发明所提供的菌株丰富了野生解磷菌遗传资源，扩大了解磷菌全基因组育种的后备库，该菌具有较强的解磷能力，能提高土壤中有效磷的含量，提高磷肥利用效率，提高农作物产量，减少水土流失，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明筛选的六株解磷菌用钼锑抗比色法测定水溶性磷含量的测定结果图；

图2为四组盆栽接种解磷菌PC01组、PC05组、PC01+PC05混合组、CK组后的油菜生长长势图；

图3为四组盆栽接种解磷菌PC01组、PC05组、PC01+PC05混合组、CK组后的油菜根系生长图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

本发明的一种解磷菌PC05，所述解磷菌PC05菌株名称为InquilinusginsengisoliPC05，已于2016年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016347，地址：中国，武汉，武汉大学。

实施例1

无机磷固体培养基的制备：按重量份数计，培养基由下述成分组成：葡萄糖10g、(NH₄)₂SO₄>4·H₂O>4·7H₂O>4·H₂O0.03g、Ca₃(PO₄)₂>3(PO₄)₂与其余成分分开灭菌后混合，调节pH为7.0～7.2。

取10mL猪泡粪液样品，放入带有玻璃珠的250mL三角瓶中，加入90mL无菌水，在28～30℃恒温振荡30～45min，使样品均匀分散于无菌水中，得到稀释倍数为10^-1的菌悬液，将菌悬液静置后取上清液，依次稀释得到10^-3、10^-5、10^-7倍浓度梯度的样品菌悬液，10^-3、10^-5、10^-7倍浓度梯度的菌悬液各取0.1mL，依次均匀的涂布在无机磷固体培养基上，放入恒温培养箱中，在30℃条件下恒温培养3～5天后，观察并记录菌落及溶磷圈的大小，做好菌种标记，筛选出6株解磷菌PC01、PC02、PC03、PC04、PC05、PC06，比较6株解磷菌在无机磷固体培养基上的溶磷圈直径(HD)与菌落直径(CD)的比值，筛选出HD/CD值最大的菌株(即解磷能力较大的菌株)，如表1所示，解磷能力从大到小依次为：PC05〉PC02〉PC01〉PC03〉PC06〉PC04，其中PC05HD/CD值最大，即为本发明所要获得的解磷菌PC05。

表1解磷菌在平板上的解磷能力

实施例2

对实施例1中分离筛选得到的解磷菌PC05进行形态观察和分子鉴定。解磷菌PC05的生长生理形态为菌落表面光滑，半透明，边缘整齐，圆形凸形，培养初期溶磷圈不明显，3～4d后溶磷圈较显著；利用引物27F和1492R对菌株PC05进行扩增和正向测序，得到序列长度为1445bp，通过BLAST(局部序列比对基本检索工具)，将序列与GenBank数据库中序列进行对比，其与NR_112560.1相似性超过99％，鉴定其为Inquilinus ginsengisoli。

1、解磷菌PC05溶磷能力检测：

对实施例1中分离筛选得到的解磷菌PC05进行溶磷能力检测。

制备无机磷液体培养基：由下述成分组成：葡萄糖10g、(NH₄)₂SO₄>4·H₂O0.3g、NaCl>4·7H₂O>4·H₂O>3(PO₄)₂>3(PO₄)₂与其余成分分开灭菌后混合，调节pH为7.0～7.2。

取1mL己活化的实施例1中筛选出的6株菌株解磷菌PC01、PC02、PC03、PC04、PC05、PC06的菌悬液，分别加入含有100mL无机磷液体培养基的250mL锥形瓶中，于30℃下180r/min振荡培养7天，每株菌株重复3瓶。在接种后每天取培养液，5000r/min离心10min后，取上清液，用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷的含量，同时设置空白组，其中无机磷液体培养基中Ca₃(PO₄)₂的浓度为5g·L^-1。各菌株最大溶磷量如图1所示，由图可知，解磷菌PC01、PC02、PC03、PC04、PC05、PC06六株菌株中，解磷菌PC05解磷效果最好，最高溶磷量是532.33mg/L，解磷率为44.89％。

2、解磷菌PC05促进油菜幼苗生长试验：

取两组实施例1中的解磷菌进行盆栽试验：解磷菌PC01组(盆栽中接种PC01菌液100mL)、解磷菌PC05组(盆栽中接种PC05菌液100mL)、解磷菌PC01+PC05混合组(盆栽中接种PC01和PC05菌液各50mL)、CK组(空白对照组，不接种任何菌种)。每组重复4个重复盆栽，每盆播种12粒经萌发处理后的油菜种子，且每盆按0.15g/kg的氮和0.2g/kg的钾的施用量施加氮肥钾肥，然后将盆栽置于20℃下培养，待出苗后分期进行间苗，最后定苗，每盆保留3株，定期给每盆盆栽浇等量去离子水，连续培养120天。

植株生长状况如图2和图3所示，由图可知，接种解磷菌PC05后整株植物高度、植株根长、根数量、含氮量、含磷量以及含钾量均明显高于空白组；

油菜生长指标测定结果如表2所示，由表可知，接种解磷菌PC05后植株株高增加68.23％，根长增加79.34％，鲜重提高140.41％，干重提高171.88％，含氮量增加215.98％，含磷量增加203.88％，含钾量增加209.44％。

表2不同菌株对油菜生长指标的影响

(注明：表2中注：表格中数据表示为4个重复实验的平均值±标准差，数据后的字母不同表示数据间差异性显著。)

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围做出任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案范围内。