一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力的抗体检验方法

摘要

本发明提供了一种猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗、效力检验方法，取健康的易感家兔作为检验对象，分为对照组和免疫组；对免疫组家兔进行注射，注射猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗，而对照组的家兔不注射任何物质；注射疫苗21日后，对免疫组和对照组的家兔均进行心脏采血，心脏血分别经过离心后取上清液，分别检测猪瘟ELSIA抗体，抗体至少4/5为阳性则证明猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗效力检验合格。本发明的猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗效力检验方法，可替代用猪进行免疫攻毒的效力检验，由于检验动物家兔易获得，节约检验成本，检验周期短，不涉及用猪瘟强毒攻击，生物安全性高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)效力的抗体检验方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪瘟(slassical swine fever，CFS)以出血和发热为主要特征，呈急性或慢性经过，是一种对猪危害性极大的传染病，被国际兽疫局列为A类动物传染病。在世界许多国家和地区，传统疫苗接种是控制猪瘟的重要手段。目前使用的弱毒疫苗主要是中国猪瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE疫苗和法国的Thireval疫苗。20世纪70年代后期，猪瘟的流行形式发生了很大变化。地区散发性流行及非典型猪瘟症状的发生，特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C-株检测时发现有不同的反应模式，猪瘟免疫屡屡失败等，表明猪瘟病毒的抗原性可能存在着变异，从而使有人对传统弱毒疫苗提出了质疑。随着传代次数的增加和对不同细胞的适应性繁殖，疫苗毒株可能发生异质性或抗原漂移加之数十年来CSFV在大规模免疫接种压力下可能出现抗原变异。

这些情况都表明，现有的传统疫苗已不能适应新形势的需要，研究和开发新型猪瘟疫苗机是大势所趋。分子生物学技术的兴起和发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发奠定了基础。基因缺失弱毒疫苗、亚单位疫苗和活载体疫苗是目前研究的热点。

猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗属于灭活疫苗，除采用靶动物(猪)进行免疫攻毒的效力检验方法外，目前还没有可用的替代方法，由于采用靶动物(猪)进行免疫攻毒的方法检测周期长(51日)，饲养和检验成本高，检验过程中涉及使用猪瘟强毒，为解决以上问题，急需建立可行的有效的实验动物效力检验方法用于灭活疫苗的效力检验，能够缩短检测周期，节约检测成本，提高生物安全。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗效力检验方法，可替代常规的用猪进行免疫攻毒的效力检验，从而弥补现有亚单位疫苗效力检验的空白。

本发明检验方法，包括如下的步骤：

1)取健康的易感家兔作为检验对象，按照体重、性别随机分为对照组和免疫组，免疫组至少设有2个平行组；

所述的易感家兔，为猪瘟病毒ELISA抗体为阴性的家兔；

2)对免疫组家兔注射待检测的猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗(293T-E2)，而对照组的家兔不注射；注射疫苗的家兔和对照组的家兔按照正常饲养方式饲养；

3)在步骤2)注射疫苗21日后，对免疫组和对照组的家兔均进行心脏采血，血液经过离心后取上清液，分别检测猪瘟ELSIA抗体，抗体为阳性则证明猪瘟基因工程亚单位疫苗达到保护作用。

优选的，步骤1)中，所述的对照组不设平行组；所述的免疫组设有平行组，每个平行组设立的家兔只数与对照组相同。

优选的，步骤2)中，所述的猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗的注射方式为皮下静脉注射，注射部位为家兔的颈部。

优选的，步骤2)中，所述的猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗的注射剂量为0.2ml/只。

优选的，步骤3)中，离心时的速度为7000r/min，离心时间为10分钟。

根据本发明方法判定，对照组家兔猪瘟ELSIA抗体均为阴性，而免疫组的家兔，猪瘟ELSIA抗体为阳性的比率至少为80％。本发明的猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗效力检验方法，可替代用猪进行免疫攻毒的效力检验，由于检验动物家兔易获得，节约检验成本，检验周期短，不涉及用猪瘟强毒攻击，生物安全性高。

具体实施方式

本发明采用健康易感家兔免疫猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗(293T-E2)，免疫后采血检测猪瘟病毒ELISA抗体，通过抗体阴阳性判定疫苗的免疫效果。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：一种猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)效力检验方法

包括以下步骤：

(1)取20只健康的易感家兔(猪瘟病毒ELISA抗体为阴性的家兔)作为检验对象，按照体重、性别随机分为4组，每组5只；3组为免疫组，1组为对照组；

(2)对免疫组家兔进行注射，3组分别注射0.1ml、0.2ml、0.5ml的猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)，而对照组的家兔不注射任何物质；注射疫苗的家兔和对照组的家兔按照正常饲养方式饲养；

(3)步骤(2)注射疫苗21日后，对免疫组和对照组的家兔均进行心脏采血，心脏血分别以7000r/min离心10min后取上清液，分别检测猪瘟ELSIA抗体(按照IDEXX公司生产的猪瘟病毒抗体检测试剂盒说明书进行操作，检测时间为4小时)，抗体为阳性则证明猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)达到保护作用。结果如表1所示：

表1：抗体检测

注：阻断率≥40％为阳性(+)；30％＜阻断率＜40％为可疑(±)；阻断率≤30％为阴性(-)。

由表1可知，家兔注射猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)后，能够产生特异性的抗体，以0.1ml/只剂量免疫，抗体阻断率在10.3-71.0％之间，抗体阳性率为80％，以0.2ml/只、0.5ml/只剂量免疫，抗体阻断率在64.9-81.8％之间，抗体阳性率均为100％，对照组抗体阻断率在2.8-12.4％之间，抗体均为阴性，由此可见猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)对家兔的最小免疫剂量为0.1ml/只，在进行疫苗的效力检验时，使用剂量定为最小免疫剂量的2倍，即0.2ml/只。

实施例2：抗体检测与攻毒保护相关性检测：

实施例1中，免疫组和对照组的家兔进行心脏采血后，每只家兔进行耳部静脉注射猪瘟活疫苗(脾淋源)，1.0ml/只；注射猪瘟活疫苗(脾淋源)的前两日每日测量一次体温，注射后每6小时测温一次，共测72小时；注射前后家兔体温变化不超过1℃时判定为达到保护作用。结果如表2所示：

表2：攻毒保护

分组动物种类动物数量保护率不保护率免疫组1(0.1ml/只)家兔5只80％20％免疫组2(0.5ml/只)家兔5只100％0％免疫组3(1.0ml/只)家兔5只100％0％对照组家兔5只0％100％

由表2可知，家兔注射猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)后，再用猪瘟毒(猪瘟脾淋源活疫苗中的猪瘟兔化弱毒株)攻击，可以达到保护作用，此外，抗体检测与攻毒保护具有很好的相关性。

实施例3：本发明检验方法应用及与靶动物检验对比

取猪体重1.5～3.0kg健康易感(瘟病毒ELISA抗体均为阴性)家兔20只，随机分成4组，每组5只，1-3组各颈部皮下注射201401、201402、201403批猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)，0.2ml/只，第4组为对照组。免后21日，所有家兔心脏采血，7000r/min离心10分钟，吸取上清检测猪瘟ELSIA抗体；抗体为阳性则证明猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)达到保护作用。结果如表3所示：

表3：抗体检测

注：阻断率≥40％为阳性(+)；30％＜阻断率＜40％为可疑(±)；阻断率≤30％为阴性(-)。

取猪健康易感(瘟病毒PCR检测阴性，ELISA抗体为阴性)30-60日龄猪20头，随机分成4组，每组5头，1-3组为免疫组、各颈部肌肉注射1.0ml猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗，第4组为对照组。免后28日，所有猪注射猪瘟病毒石门系强毒1.0ml/头。攻毒后日测温两次，共测16日，观察攻毒猪的临床表现(眼结膜炎、食欲废绝、便秘和腹泻交替出现、精神沉郁)。根据攻毒前2日及攻毒后测温和临床观察综合判定，体温变化不超过1℃时且无临床表现判定为达到保护作用。结果如表4所示：

表4：攻毒猪体温反应、临床观察和剖检统计表

注：“√”表示出现此症状或有体温反应；“-”表示无此症状或无体温反应。

表6：攻毒保护统计表

分组动物种类动物数量保护率不保护率免疫组1(1.0ml/头)30-60日龄猪5头100％0％免疫组2(1.0ml/头)30-60日龄猪5头100％0％免疫组3(1.0ml/头)30-60日龄猪5头100％0％对照组30-60日龄猪5头0％100％

由表3、4、5、6可知，用家兔进行抗体检测，3批疫苗免疫家兔均达到5/5抗体阳性，而用猪进行免疫攻毒结果表明，3批疫苗免疫猪均5/5保护，由此可见，两种方法的检验结果是一致的，可以用家兔进行抗体检测可以替代用猪进行免疫攻毒。

上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。