一种测定金银花大鼠血清代谢产物的方法

摘要

本发明公开了一种测定金银花大鼠血清代谢产物的方法，通过对净化剂类型和提取净化程序进行了系统优化，建立了QuEChERS技术处理大鼠血清样品的方法；通过RRLC‑ESI‑MS‑MS技术对金银花代谢产物中7种成分进行定性定量测定，计算其回收率。该技术简单、快速、准确、有效，为复杂基质中药大鼠血清代谢产物的提取净化和分析研究提供了新方法。

说明书

技术领域

本发明属于分析测试领域，具体涉及一种利用QuEChERS-RRLC-ESI-MS/MS法测定金银花大鼠血清代谢产物的方法。

背景技术

金银花Lonicera japonica Flos.为忍冬科植物，忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、凉散风热的作用。现代药理及临床研究表明，金银花具有抗病原微生物、抗炎、解热、保肝、抗生育、止血、免疫调节、降血脂、中枢兴奋等作用。对金银花入血后的代谢产物进行分析，有助于阐明金银花的药效成分。但代谢产物基质复杂，特别是含有脂质和蛋白质等内源性杂质，这给代谢产物的分析带来巨大困难。因此，需要发展一种合适的提取净化方法，对血液样品进行快速、有效的前处理。

QuEChERS(Quick快速、Easy简便、Cheap廉价、Effective有效、Rugged耐用、Safe安全)法，是2003年由Anastassiades教授开发的一种快速样品前处理技术，常用于水果蔬菜的农残检测。其原理与固相萃取(SPE)相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。该技术使用的主要吸附萃取剂为乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18和石墨化碳(GCB)。其中PSA能有效地去除样本基质中的脂肪酸、糖类等极性杂质，C18能去除部分非极性脂肪和脂溶性杂质，而石墨化碳对样本基质中的色素、固醇类杂质的去除极为有效。近年来QuEChERS法在食品安全检测中得到广泛应用，在血清样品前处理中也逐渐有探索报道，但对中药血清代谢产物的提取净化和分析的研究应用较少。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的为提供一种利用QuEChERS-RRLC-ESI-MS/MS法测定金银花大鼠血清代谢产物的方法，经检测发现，金银花在血清中的代谢产物包括马钱酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸C和槲皮素，本发明的检测方法中对吸附萃取剂进行了优化，该吸附萃取剂可以最大限度除去血清中存在的内源性干扰杂质，避免了对金银花血清代谢产物检测的干扰作用，提高了检测的准确度，并且采用RRLC-ESI-MS/MS联用的检测方法，通过优化各个参数，获得了较高的灵敏度，可以成功实现大鼠血清中马钱酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸C和槲皮素的分离检测。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种利用QuEChERS-RRLC-ESI-MS/MS法测定金银花大鼠血清代谢产物的方法，包括对含有马钱酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸C和槲皮素的大鼠血清进行前处理的步骤，向设定体积的大鼠血清中加入提取试剂，震荡、离心后，取上清液，并向上清液中加入内标物和吸附萃取剂，震荡萃取、离心，取上清液过固相萃取小柱，流出液经过滤后待检。

其中，每毫升大鼠血清所用的吸附萃取剂由以下组分组成：C18 3.5～4.5mg、PSA1.7～2.1mg和GCB 1.8～2.2mg。

由于大鼠血清中的干扰杂质较多，如果只采用单一的吸附萃取剂难以彻底除去干扰物质。发明人经过反复试验发现，当三种吸附剂为以上配比时，不但会完全吸附大鼠血清中的干扰物质，还能最大限度降低对目标物质的吸附。所以，利用该吸附萃取剂对含有金银花代谢产物的大鼠血清进行前处理时，可以大大提高对目标物质的检测准确度。

优选的，每毫升大鼠血清所用的吸附萃取剂由以下组分组成：C18 4mg、PSA 2mg和GCB2mg。

优选的，所述固相萃取小柱为Cleanert MAS-WA固相萃取小柱。该固相萃取小柱可以将吸附萃取剂不能吸附除去的杂质彻底除去，进一步净化血清基质，提高了目标物质检测的准确度。

优选的，所述内标物为黄芩苷。

内标物，是将一个已知质量、样品中不含有杂质的纯物质，加入至待测样品溶液中，以此纯物质的量为标准，对比测定待测组分的含量，该种纯物质称为内标物。

内标物需满足以下要求：能完全溶解于样品中，且不与待测组分发生化学作用；峰位尽可能与待检测组分的峰位靠近，但能与待测组分完全分开(分离度≥1.5)的纯物质。

经过反复试验优选，黄芩苷可以满足以上要求，较其他的物质，其峰位与目标物质的峰位更接近，更能节省分析时间。

优选的，所述提取试剂为甲醇和乙腈的混合溶液，两者的体积比为1:0.8～1.2，料液比为1:4～5.5。

其中的料液比是指大鼠血清与提取试剂的体积比。

采用上面的提取试剂，可以将大鼠血清中的7种目标物质基本全部回收，提高了目标物质的回收率，进而提高了实际检测中的准确度。

优选的，震荡萃取的时间为1.5～2.5min。

本发明对萃取时间进行了优化，当萃取的时间为1.5～2.5min时，不但可以最大限度地除去体系中的干扰杂质，还可以尽量少地吸附目标物质，减少目标物质的损失，直接的体现是，在该萃取时间下的加标回收率最高。

优选的，上述测定金银花大鼠血清代谢产物的方法，还包括对前处理过的大鼠血清进行RRLC-ESI-MS-MS检测的步骤；

色谱条件为：色谱柱Agilent XDB C18，4.6×50mm，1.8μm；柱温30℃；进样量5μL；流动相乙腈-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～8min，5～60％乙腈；8～10min，60～90％乙腈；流速0.5mL/min；后运行时间7min。

该色谱柱对8种物质(7种待检测物质和1种内标物)进行分离时，分离度和分离得到的色谱峰形较好，无拖尾现象。采用上述流动相和梯度洗脱程序，可以将7种代谢产物和内标物在较短的保留时间下进行完全分离。本发明中，色谱柱、流动相和梯度洗脱程序配合，不但提高了检测的准确度，还提高了检测的效率。

优选的，上述测定金银花大鼠血清代谢产物的方法，还包括对大鼠血清进行质谱检测的步骤，质谱条件为：

离子源为ESI源，负离子模式检测，扫描方式为多反应监测，电喷雾电压4000V，离子源温度为325°，干燥气流速为12.0mL/min，雾化气压力为35psi，离子选择见表2：

表2质谱条件

上述测定金银花大鼠血清代谢产物的方法在测定金银花在大鼠血清中的代谢产物含量中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明中的吸附萃取剂既可以对大鼠血清基质中的复杂干扰物质进行较完全去除，也可以最大限度降低对目标物质的吸附，与检测方法配合，可以提高血清中的各种目标物质的准确检测。

本发明对液相色谱的流动相和梯度洗脱程序进行了研究，使8种物质得以完全分离，且峰形良好，无拖尾现象。良好的前处理方法与良好的检测条件配合，使该方法具有良好的重现性和稳定性，尤其是可以显著降低各种目标物质的检测限，提高了检测的灵敏度。同时，该方法的线性范围较广，可以在很大范围内对目标物质进行定量检测。

附图说明

图1为8种混合标准溶液的提取离子流图；

图2为提取溶剂对血清中目标化合物回收率的影响；

图3为料液比对血清中目标化合物回收率的影响；

图4为C18用量对目标成分回收率的影响；

图5为PSA和GCB的用量对目标成分回收率的影响；

图6为萃取时间对目标成分回收率的影响；

具体实施方式

下面将结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Agilent G6520A飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源ESI(美国Agilent公司)；万分之一电子分析天平(SartouriusBSA)；Milli-Q(18.2MΩ)超纯水处理系统(美国Millipore公司)；XW-80A旋涡混合仪(林贝尔仪器公司)。

甲醇(色谱纯)购于美国Tedia公司，乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司，甲酸(色谱纯)购于德国Riedel公司，实验用水为Milli-Q超纯水(18.2MΩ)。C18(50μm，60A)、N-丙基乙二胺吸附剂(PSA，40～60μm)、石墨化碳(GCB，120～400目)、Cleanert MAS-WA固相萃取小柱(30mg/1mL)均购置于天津博纳艾杰尔(Agela)公司，大鼠血清(肝素钠抗凝)，肝素钠(国药集团)，SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制

精密称取马钱酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸C、槲皮素、黄芩苷(内标物)8种标准品各1.0mg，分别置于1mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液，-20℃保存备用。临用时，用甲醇稀释上述标准储备溶液，配制成不同浓度的标准工作液。各取单标储备液适量，用初始流动相做稀释液配制所需浓度的混合标准溶液。

1.2.2样品前处理

取含有上述前7种标准品溶液的大鼠血清，精确吸取1mL，加5mL甲醇-乙腈(1:1)混合试剂，涡旋振荡，在4℃下12000r/min离心10min。取上清液依次加入黄芩苷(内标物)、4mgC18、2mg PSA、2mg石墨化碳，涡旋震荡2min，在4℃下12000r/min离心10min。取上清液过Cleanert MAS-WA固相萃取小柱，流出液经0.22μm微孔滤膜过滤后待检。

1.2.3色谱条件

色谱柱Agilent XDB C18(4.6×50mm，1.8μm)，柱温30℃；进样量5μL；流动相乙腈-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；流速0.5mL/min；后运行时间7min。

表1 8种成分(含内标)的HPLC条件

1.2.4质谱条件

离子源为ESI源，负离子模式检测，扫描方式为多反应监测(MRM)，电喷雾电压4000V，离子源温度为325℃，干燥气(N₂)流速12.0mL/min，雾化气压力35psi。离子选择见表2，离子流图见图1。

表2质谱条件

2结果与讨论

2.1色谱质谱条件优化

本实验考察比较了8种化学成分在Unitary C18(2.1×100mm，2.8μm)柱，AgilentXDB C18(4.6×50mm，1.8μm)柱和Accucore C18(2.1×100mm，2.6μm)柱，共三种不同类型的C18柱上的分离效果。结果发现，采用Agilent XDB C18(4.6×50mm，1.8μm)柱时分离度和色谱峰形较好，无拖尾现象，可用于进一步分析研究。分别选用甲醇-水和乙腈-水作为流动相对化合物进行洗脱，结果显示，采用乙腈-水作为流动相梯度洗脱时，分离时间较短且分离效果好。进一步考虑各成分的电离问题，分别考查了纯水相、加入10mM甲酸铵和加入0.1％甲酸的水相，结果显示，用加入0.1％甲酸的水相作流动相时，各成分峰型较好，离子响应较好。最终优化得到的梯度洗脱程序如表1所示。

在MRM多反应监测模式下对8种化合物进行Full Scan全扫描，发现8种化学成分在ESI源负离子模式电离下均容易电离形成[M-H]^-峰，优化毛细管电压和破碎电压，使母离子强度最大；以确定的[M-H]^-进行二级质谱扫描，在不同的碰撞电压作用下，每种化合物选择1～3个主要特征碎片离子作为定性与定量离子，优化碰撞电压，使特征碎片离子的强度达到最大。8种化合物的特征离子对和电离条件、碰撞条件见表2。8种混合标准溶液提取离子流图见图1，其中，1-马钱酸，2-绿原酸，3-咖啡酸，4-芦丁，5-金丝桃苷，6-异绿原酸C，7-槲皮素，8-黄芩苷(内标物)。

2.2 QuEChERS提取净化条件优化

2.2.1提取条件优化

本实验考察了不同提取溶剂(甲醇、乙腈、甲醇-乙腈＝1:1、甲醇-乙腈＝3:1、甲醇-乙腈＝1:3)(图2)和料液比(1:3、1:5、1:7、1:9)(图3)对血清中目标化合物回收率的影响。

从图中可以看出，采用甲醇-乙腈＝1:1作为提取溶剂时，7种成分在血清中的回收率较高。增加料液比有利于成分的提取，但试剂用量过多回收率反而下降，综合考虑，本研究选择1:5作为提取目标成分的最佳料液比。

2.2.2净化条件优化

2.2.2.1吸附剂用量

吸附剂类型是影响QuEChERS提取净化的重要参数，由于血清样品基质复杂，本实验采用混合吸附剂(C18、PSA、GCB)对血清样品进行净化。

增加吸附剂的用量可以减少色素、内源性杂质及其他共存成分对目标物的影响，但同时也可能会对目标物产生一定的吸附。本实验首先考察C18的用量(2、4、6、8mg)对目标物的影响(图4)，各目标成分的回收率随着吸附剂用量增加呈现先增加后降低的趋势，当用量为4mg，各目标成分含量均较高，选择C18用量为4mg用于后续研究。进一步考察PSA和GCB的用量对目标物的影响(图5)，实验结果表明：各目标成分的回收率随着吸附剂用量增加呈现降低的趋势，因此选择PSA 2mg和GCB 2mg为最佳用量。

当采用C18、PSA和GCB的混合物作为吸附萃取剂时，向大鼠血清中加入适量的7种目标物质，然后用不同配比的吸附萃取剂进行处理，检测吸附萃取剂在不同配比下各目标成分的加标回收率，结果如表3所示，其中的“2,1,1”是指C18、PSA和GCB的质量分别为2mg，1mg，1mg，第一排中其他组数字的含义与此相同。

表3不同吸附剂对比下的加标回收率

最终确定处理1ml大鼠血清的混合吸附剂用量为C18 4mg、PSA 2mg和GCB 2mg。

2.2.2.2萃取时间

在优化的吸附剂类型和用量条件下，进一步考察了萃取时间(0.5、1、2、3min)对各目标成分测定结果的影响(见图6)。从图中可以看出，随着萃取时间增加，各目标成分的回收率呈现先增高后降低趋势。为了保证净化效果，同时又不损失目标化合物的回收率，本研究选择萃取时间为2min。

2.3 RRLC-ESI-MS/MS分析方法学考察

2.3.1线性关系考察

按1.2.3色谱条件进样分析，测定各不同浓度的混合标准液中各化合物的峰面积，以各化合物浓度(ng/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程。各成分的回归方程、相关系数、线性范围、检测限以及定量限见下表4。

表4回归方程、检出限和定量限检测结果

2.3.2精密度实验

配制不同浓度混合标准溶液，按1.2.3下色谱条件连续进样6次，分别测出7种化合物的峰面积和保留时间，计算出各个化合物的峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)。7种化合物峰面积RSD分别为1.71％，1.02％，1.38％，1.36％，1.29％，1.93％，1.79％；保留时间的RSD分别为0.078％，0.047％，0.053％，0.021％，0.029％，0.043％，0.016％，说明仪器精密度良好。

2.3.3重复性实验

配制不同浓度混合标准溶液6份，进样分析，经过计算得到7种化合物峰面积的RSD分别为1.64％，1.17％，1.48％，1.77％，1.49％，1.57％，2.26％；保留时间的RSD分别为0.070％，0.042％，0.043％，0.016％，0.039％，0.072％，0.011％，说明该方法的重现性较好。

2.3.4稳定性实验

取同一待测样品分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样分析，检测和计算得到7种化合物峰面积的RSD分别为1.72％，1.25％，1.28％，1.36％，1.30％，1.47％，2.01％；保留时间的RSD分别为0.068％，0.056％，0.038％，0.024％，0.037％，0.064％，0.024％。由于其保留时间的RSD均小于1％，峰面积的相RSD均小于3％，说明该样的化学性质在24h内较稳定。

2.3.5加标回收率

在混合标准溶液中，分别精密称定加入马钱酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸C和槲皮素标准品适量，按上述1.2.3色谱条件分析。其平均回收率分别为：99.32％、100.44％、98.75％、99.01％、98.96％、98.02％、98.19％、97.08％，相对标准偏差分别为：1.45％、1.02％、1.28％、1.39％、1.87％、1.09％、1.98％。

2.4大鼠血清中金银花代谢产物的测定

为进一步验证本实验方法的可行性，以金银花中所含有的上述7种成分的混合标准溶液给SD大鼠灌胃，30min后取血，按照上述1.2.2处理方法处理后进行RRLC-ESI-MS/MS分析。未检测到槲皮素成分，可能入血成分较少或者已在大鼠体内代谢。其余6种成分含量分别为马钱酸98.22ng/mL、绿原酸8.66ng/mL、咖啡酸124.87ng/mL、芦丁1.78ng/mL、金丝桃苷1.69ng/mL、异绿原酸C11.58ng/mL，芦丁和金丝桃苷超出线性范围，推测入血较少或者吸附剂对黄酮类成分吸附较多，有待于进一步验证。其余4种成分均在线性范围内，说明此方法可行。

本文研究建立了QuEChERS法提取净化联合RRLC-ESI-MS/MS法分析测定金银花大鼠血清代谢产物中7种成分的方法。该方法操作简单、快速，样品净化效果较好，可有效减少血清中内源性杂质对目标成分的干扰。研究结果为中药及方剂等复杂基质大鼠血清代谢产物的提取、净化和分析研究提供了新思路，拓展了QuEChERS技术在中药代谢组学研究中的应用。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。