牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明涉及一种预防牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感的三联灭活疫苗及其制备方法。本发明所述疫苗其有效成分包括牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒与牛副流感3型病毒的灭活抗原,该三联灭活疫苗是利用细胞转瓶、全悬浮及微载体培养的传代细胞系进行病毒增殖，并对制苗工艺等进行了优化。疫苗安全和效力检验结果显示：使用本发明的三联灭活疫苗免疫牛后没有任何局部和全身不良反应，所有的牛都产生了免疫保护，说明本发明的疫苗安全可靠，可达到“一针三防”的目的，降低经济损失。

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由属于黄病毒科、瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一种病毒性传染病，主要侵害牛、羊、鹿、耗牛、猪等动物，各年龄牛均易感。临床主要表现为腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，免疫抑制，怀孕母畜流产或产生畸形胎儿等。1946年Olafson等在美国首次发现该病，以发热、腹泻和咳嗽为特征，称为牛病毒性腹泻。Ramsey和Chiverst于1953年首先发现了黏膜病(Mucosal disease，MD)，1971年美国兽医协会将其统一命名为牛病毒性腹泻/黏膜病(BVD/MD)。该病在世界范围内广泛分布，是造成全球养牛业经济损失的主要病原。上世纪80年代初，李佑民等首次在流产胎儿的脾脏中分离并鉴定出BVDV，证明该病在我国的存在。血清学调查表明，BVD在我国呈上升趋势。

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)是由属于疱疹病毒科、水痘病毒属的牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine RhinotracheitisVirus,IBRV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，又称为“坏死性鼻炎”或“红鼻病”。IBRV即牛I型疱疹病毒(BoHV-1)，能够在牛体内侵害多种系统的组织和器官，临床症状表现为高热，病牛体温可达40℃以上、食欲降低、呼吸困难、流鼻液、上呼吸道及气管黏膜发炎，病毒还可侵害生殖道。病毒感染能够诱发产奶量下降和流产，并导致肉用牛和康复牛的生长缓慢，给养牛业造成极大的损失。该病最早于上世纪50年代在美国的科罗拉多州被发现，Madin在1956年首次从病牛体内分离得到IBRV。1980年，周泰冲等首次在我国从新西兰引进的奶牛中分离鉴定了IBRV，之后广东、广西、河北、河南、内蒙古、新疆、山东、青海、黑龙江等全国各地的黑白花、本地黄牛、牦牛和水牛均有IBR感染的报道。血清学调查显示，IBR在我国牛群中广泛流行，且呈明显上升趋势。

牛副流感(Bovine parainfluenza，BP)是由属于副黏病毒科、呼吸道病毒属的牛副流感3型病毒(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)引起的一种急性呼吸道疾病，其引起的病症为牛副流行性感冒，又称“运输热”，是一种急性接触性传染病，BPIV3对牛的致病力不强，但在继发细菌、支原体及外界诱因的联合作用下，则可产生严重呼吸道症状，甚至可引起病牛的死亡。BP与BVD、IBR一起构成了牛呼吸道综合征(Bovinerespiratory disease complex,BRDC)的主要病原。目前，BRDC是引起世界范围内的饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害养牛业的健康发展。BP在世界上许多国家流行，我国于2008年在黑龙江首次分离到BPIV3，研究表明，BPIV3在我国抗体阳性率高。

发明内容

本发明的目在于采用一种牛肾细胞(MDBK)繁殖牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感3型病毒，进而将此三种病毒作为抗原制备成预防BVD、IBR和BP的三联灭活疫苗。

本发明的技术方案

1.一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒及牛副流感3型病毒的灭活抗原。

2.本发明所述的牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗，其特征在于所述灭活抗原是牛病毒性腹泻病毒L株、牛传染性鼻气管炎病毒J1株及牛副流感3型病毒S株的灭活病毒，该三株病毒已于2017年03月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCC No.13787、CGMCC No.13786、CGMCC No.13788。

3.本发明所述的牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法步骤包括：

(1)细胞培养：将牛肾细胞系(MDBK)采用贴壁培养或者悬浮培养或者微载体培养的的方式进行传代和培养；

(2)毒种繁殖：将牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒及牛副流感3型病毒作为生产种毒共同接种在牛肾细胞上，并通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；

(3)抗原灭活：将制备的病毒液使用灭活剂进行灭活；

(4)配苗：加入相应的佐剂或者直接将灭活好的抗原进行配苗。

本发明具体实施方式

1.BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株的分离鉴定

(1)本发明所用毒株BVDV-L株于2010年分离自疑似发病牛的粪便，接种MDBK细胞后可产生细胞病变，能被BVDV标准阳性血清中和，BVDV IFA荧光抗体检测阳性，参照规程SN/T1905-2007，针对BVDV 5’-UTR设计特异性引物，引物序列如下：

BVDV-P1：5’-AGGCTAGCCA TGCCCTTAGT-3’20(序列1)

BVDV-P2：5’-TCTGCAGCAC CCTATCAGG-3’19(序列2)

RT-PCR后扩增出288bp特异性片段。

(2)IBRV-J1株于2011年分离自疑似发病牛的鼻拭子，接种MDBK细胞30h即可产生细胞病变，能被IBRV标准阳性血清中和，参照规程SN/T 1918-2007，设计了扩增IBRV gB、gE基因的特异性引物，引物序列如下：

gB-P1：5’-TACGACTCGT TCGCGCTCTC-3’20(序列3)

gB-P2：5’-GGTACGTCTC CAAGCTGCCC-3’20(序列4)

gE-P1：5’-GCTTCGGTCG ACACGGTCTT-3’20(序列5)

gE-P2：5’-CTTTGTCGCC CGTTGAGTCG-3’20(序列6)

提取DNA后PCR分别扩增出491bp(gB基因)、271bp(gE基因)的特异性片段。

(3)BPIV3-S株分离自疑似发病牛的鼻拭子，接种MDBK细胞能产生细胞病变，根据病毒N蛋白设计特异性引物(参照文献牛副流感病毒3型的分离鉴定和间接ELISA方法建立及初步应用，刘鹏，2010)，引物序列如下：

BPIV3-P1：5'-GAGAAAGACC CAGGAAGACA GA-3'22(序列7)

BPIV3-P2：5'-ACACCCATCG CATAACTCCA GA-3'22(序列8)

提取RNA后RT-PCR可扩增出704bp的特异性片段。

2.抗原制备

为解决BVDV、IBRV、BPIV3适应转瓶贴壁培养、悬浮培养、微载体悬浮培养细胞牛肾细胞系MDBK(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)过程中出现的一系列问题，本发明提供了利用转瓶贴壁培养、悬浮培养技术、微载体悬浮培养技术制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株的方法。

(1)利用转瓶贴壁培养细胞制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)培养细胞：首先复苏种细胞牛肾细胞系MDBK到细胞瓶中，生长48小时左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:3的比例进行传代。加细胞生长液(含有10％(v/v)的小牛血清的DMEM培养液，pH值为7.0)转瓶培养，细胞长满90％～100％时，用于继续传代或接种病毒。

2)繁殖毒种：取生长良好的上述MDBK细胞，用PBS洗2～3次，将BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株分别按照(V/V)0.1％、0.1％、0.2％的接毒量进行接种。加入维持液(含2％(V/V)的小牛血清的DMEM培养液，pH值为7.0)进行培养。28～36小时细胞80％出现CPE时将转瓶置于-20℃反复冻融2～3次，收获细胞培养毒液作为生产用毒种。

(2)利用悬浮培养技术制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)细胞复苏及驯化：从液氮罐中取出保存的MDBK细胞，置37℃水浴锅内快速融化，1000r/rmin离心1min，弃去冻存液，用含8％～10％小牛血清的DMEM培养液重悬细胞，接种于细胞瓶中，培养48小时左右，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:5的比例进行传代。48小时后将细胞再次消化，收集细胞接种于250ml三角瓶中，置于37℃、100转/分振荡悬浮培养。调节pH值在6.8～7.4之间。待细胞增加至一定量时，转入专用悬浮培养瓶中进行培养，进行细胞训化，定期观察，直到细胞团块消失，细胞96h内生长到2～4×10⁶个/ml。

2)反应器放大培养细胞：将驯化好的MDBK细胞接种至2L生物反应器，提高转速150转/分，充分悬浮细胞，降低转速至50～80r/rmin，加入消泡剂(体积比0.1％)，培养72h，细胞密度达到2-4×10⁶个/ml，更换15L反应器，降低转速至40～60r/rmin，加入低血清悬浮培养基(含1％小牛血清)培养，使细胞密度达到2×10⁶个/ml，更换150L反应器，以转速150r/rmin，充分悬浮细胞，加入0.1％消泡剂，培养48～72h，当细胞密度达到2×10⁶个/ml，放大至1000升反应器。

3)繁殖毒种：当细胞密度达到2×10⁶个/ml时，将BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株分别按照0.1％、0.1％、0.2％的接毒量进行接种，加入无血清专用悬浮培养基进行悬浮培养，每隔3小时取样，检测细胞形态，12～16小时收获病毒液，采用高压均质机将收获的病毒液进行压力破碎，释放病毒粒子。

(3)利用微载体悬浮培养技术制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)细胞复苏及传代培养：复苏种细胞牛肾细胞系MDBK到细胞瓶中，生长48h左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:3的比例进行传代。细胞长满90％～100％时，用PBS洗涤2～3次，加入胰酶-EDTA溶液消化，收集细胞并计数，每升培养基中加入3～5克微载体Cytodex I(购自GE公司)，按照每个微载体添加15～20个细胞的比例进行细胞接种。

2)生物反应器培养接种细胞：向生物反应器中加入细胞培养基(Gibco公司DMEM高糖培养基，血清浓度为8％～10％)，微载体投放量为3～5g/L，调节各项指标，溶氧量为35％、温度为36.7℃、搅拌速度为50～60r/min、pH为7.15～7.40；每个微载体上细胞数达到150个以上时，排出反应器中培养基，用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并排出PBS，反复2～3次。

3)接毒、收毒：将BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株按照0.1％、0.1％、0.2％的接毒量分别加入到生物反应器中，改变搅拌速度进行均匀接种，然后加入细胞培养基(含2％血清DMEM高糖培养基)，进行病毒繁殖，控制反应器中培养条件：溶氧量为25％、温度为36.7℃、搅拌速度为60r/min、pH为7.4。培养结束后分别收集病毒液。

(4)病毒液灭活

制备的病毒液按照《中华人民共和国兽药典》附录进行纯净性检验，应无细菌、霉菌、支原体，且每毫升BVDV-L株病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀，IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒含量不低于10^8.33TCID₅₀。使用甲醛或BEI灭活，检验合格后，进行乳化配苗。

将检验合格的BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒，分别置于不同容器内，加入一定工作浓度的甲醛或BEI，30℃～37℃，灭活24～36小时，取样按10％接种量接种MDBK细胞，盲传三代，进行灭活检测。

(5)乳化配苗

将分别制得BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒灭活抗原按比例混合，使得每剂量疫苗中，灭活前三种抗原含量BVDV-L株不低于10^7.5TCID₅₀/ml，IBRV-J1株、BPIV3-S株不低于10^8.33TCID₅₀/ml。将抗原缓缓注入佐剂中，按抗原：佐剂体积比1:1进行混合乳化，配制成三联灭活疫苗。

3.疫苗成品检验

(1)无菌检验按现行《《中国兽药典》附录(中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011年，本发明称《中国兽药典》)进行，应符合规定。

(2)安全性试验

1)替代动物试验：试验选用1.5～2.0kg的健康家兔6只，其中免疫组4只，对照组2只，免疫组家兔各腿部肌肉注射疫苗1.0ml，对照组家兔各腿部肌肉注射细胞培养物1.0ml，连续观察7天并每天下午定点测量体温，应不出现死亡及不良反应，无临床异常表现，体温正常。选用350～400g健康雌性豚鼠6只，其中免疫组4只，对照组2只，免疫组豚鼠各颈部皮下注射疫苗0.5ml，对照组豚鼠各颈部皮下注射细胞培养物0.5ml，连续观察7天，应不出现死亡及不良反应，无临床异常表现。

2)本体动物试验：试验选用6月龄以上BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛4头，其中免疫组2头，对照组2头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物4.0ml；选用2月龄BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感犊牛4头，其中免疫组2头，对照组2头，免疫组犊牛各头颈部肌肉注射疫苗4.0ml，对照组犊牛各颈部肌肉注射细胞培养物4.0ml。连续观察14天，应不出现死亡及不良反应，无临床异常表现，体温正常。

(3)效力试验

1)中和抗体检测法：试验选用350～400g健康雌性豚鼠8只(BVDV、IBRV、BPIV3血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)，其中免疫组5只，对照组3只，免疫组豚鼠各腿部肌肉注射疫苗1.0ml，对照组豚鼠各腿部肌肉注射细胞培养物1.0ml，21天后同样方式加强免疫，二免后21天心脏采血测定中和抗体水平，应至少4只豚鼠的BVDV、IBRV、BPIV3中和抗体效价≥1:64。

2)牛体免疫攻毒法：试验选用2～3月龄BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛30头，其中免疫组15头，攻毒对照组15头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml，21天后同样方式加强免疫，二免后21天将免疫牛随机分为BVDV、IBRV及BPIV3组，每组5头。BVDV组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行BVDV强毒攻毒，每头牛左右鼻孔、口腔、颈部两侧肌肉各注射2.0ml BVDV强毒株；IBRV组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行IBRV强毒攻毒，每头牛上、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5ml IBRV强毒株；BPIV3组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行BPIV3强毒攻毒，每头牛上、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5ml BPIV3强毒株。攻毒后连续观察14天，每天上午定点测量体温，观察临床症状并采集鼻拭子进行病原检测与病毒分离。BVDV、IBRV及BPIV3攻毒对照牛均应至少3头发病，免疫组牛均应至少4头保护。

附图说明

图1家兔体温趋势图，图中显示安检家兔的体温变化在正常范围之内。

图2牛体温趋势图，图中显示安检牛的体温变化在正常范围之内。

图3犊牛体温趋势图，图中显示安检犊牛的体温变化在正常范围之内。

本发明涉及的生物材料资源信息

本发明制苗用毒株:牛病毒性腹泻病毒L株、牛传染性鼻气管炎病毒J1株及牛副流感3型病毒S株均为本发明在我国国内分离获得，该三株病毒已于2017年03月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCC No.13787、CGMCC No.13786、CGMCC No.13788。牛肾细胞系(MDBK)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(保藏编号：CL21，请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p166)。

本发明的积极意义

本发明涉及一种预防牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感的三联灭活疫苗及其制备方法。本发明所述疫苗其有效成分包括牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒与牛副流感3型病毒的灭活抗原；该三联灭活疫苗是采用细胞转瓶、全悬浮及微载体培养三种方法培养不同的传代细胞系，并对该疫苗制备方法中的病毒增殖、制苗工艺等进行了优化。疫苗安全和效力检验结果显示：使用本发明的三联灭活疫苗免疫牛后没有任何局部和全身不良反应，所有的牛都产生了免疫保护，说明本发明的疫苗安全可靠，可达到“一针三防”的目的，降低经济损失。

实施例

实施例1

——牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗(L株+J1株+S株)的制备

1.抗原制备

为解决BVDV、IBRV、BPIV3适应转瓶贴壁培养、悬浮培养、微载体悬浮培养细胞牛肾细胞系MDBK(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)过程中出现的一系列问题，本发明提供了利用转瓶贴壁培养、悬浮培养技术、微载体悬浮培养技术制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株的方法。

(1)利用转瓶贴壁培养细胞制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)培养细胞：首先复苏种细胞牛肾细胞系MDBK到细胞瓶中，生长48小时左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:3的比例进行传代。加细胞生长液(含有10％(v/v)的小牛血清的DMEM培养液，pH值为7.0)转瓶培养，细胞长满90％～100％时，用于继续传代或接种病毒。

2)繁殖毒种：取生长良好的上述MDBK细胞，用PBS洗2～3次，将BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株分别按照(V/V)0.1％、0.1％、0.2％的接毒量进行接种。加入维持液(含2％(V/V)的小牛血清的DMEM培养液，pH值为7.0)进行培养。28～36小时细胞80％出现CPE时将转瓶置于-20℃反复冻融2～3次，收获细胞培养毒液作为生产用毒种。

(2)利用悬浮培养技术制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)细胞复苏及驯化：从液氮罐中取出保存的MDBK细胞，置37℃水浴锅内快速融化，1000r/rmin离心1min，弃去冻存液，用含8％～10％小牛血清的DMEM培养液重悬细胞，接种于细胞瓶中，培养48小时左右，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:5的比例进行传代。48小时后将细胞再次消化，收集细胞接种于250ml三角瓶中，置于37℃、100转/分振荡悬浮培养。调节pH值在6.8～7.4之间。待细胞增加至一定量时，转入专用悬浮培养瓶中进行培养，进行细胞训化，定期观察，直到细胞团块消失，细胞96h内生长到2～4×10⁶个/ml。

2)反应器放大培养细胞：将驯化好的MDBK细胞接种至2L生物反应器，提高转速150r/min，充分悬浮细胞，降低转速至50～80r/rmin，加入消泡剂(体积比0.1％)，培养72h，细胞密度达到2～4×10⁶个/ml，更换15L反应器，降低转速至40～60r/rmin，加入低血清悬浮培养基(含1％小牛血清)培养，使细胞密度达到2×10⁶个/ml，更换150L反应器，以转速150r/rmin，充分悬浮细胞，加入0.1％消泡剂，培养48～72h，当细胞密度达到2×10⁶个/ml，放大至1000升反应器。

3)繁殖毒种：当细胞密度达到2×10⁶个/ml时，将BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株分别按照0.1％、0.1％、0.2％的接毒量进行接种，加入无血清专用悬浮培养基进行悬浮培养，每隔3小时取样，检测细胞形态，12～16小时收获病毒液，采用高压均质机将收获的病毒液进行压力破碎，释放病毒粒子。

(3)利用微载体悬浮培养技术制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)细胞复苏及传代培养：复苏种细胞牛肾细胞系MDBK到细胞瓶中，生长48h左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:3的比例进行传代。细胞长满90％～100％时，用PBS洗涤2～3次，加入胰酶-EDTA溶液消化，收集细胞并计数，每升培养基中加入3～5克微载体Cytodex I(购自GE公司)，按照每个微载体添加15～20个细胞的比例进行细胞接种。

2)生物反应器培养接种细胞：向生物反应器中加入细胞培养基(Gibco公司DMEM高糖培养基，血清浓度为8％～10％)，微载体投放量为3～5克/升，调节各项指标，溶氧量为35％、温度为36.7℃、搅拌速度为50～60r/min、pH为7.15～7.40；每个微载体上细胞数达到150个以上时，排出反应器中培养基，用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并排出PBS，反复2～3次。

3)接毒、收毒：将BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株按照0.1％、0.1％、0.2％的接毒量分别加入到生物反应器中，改变搅拌速度进行均匀接种，然后加入细胞培养基(含2％血清DMEM高糖培养基)，进行病毒繁殖，控制反应器中培养条件：溶氧量为25％、温度为36.7℃、搅拌速度为60r/min、pH为7.4。培养结束后分别收集病毒液。

(4)病毒液灭活

制备的病毒液按照《中国兽药典》附录进行纯净性检验，无细菌、霉菌、支原体。

病毒液病毒含量如表1。

表1病毒含量测定结果

结果显示病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀/ml，IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒含量均不低于10^8.33TCID₅₀/ml。用BEI灭活，检验合格后，进行乳化配苗。

1)BEI配制：将0.4mol/L BEA和0.4mol/L NaOH按体积比1:1混合，37℃环化1小时，生成BEI，调节pH至7.2～7.6。

2)灭活及检验：将检验合格的BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒，分别置于不同容器内，加入工作浓度为0.003M的BEI，30℃，灭活24～36小时，取样按10％接种量接种MDBK细胞，盲传三代，进行灭活检测。

3)中和：灭活完全后，加入终浓度为0.03M的硫代硫酸钠进行中和。

(5)乳化配苗

将分别制得BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒灭活抗原按比例混合，使得每剂量疫苗中，灭活前每毫升三种抗原含量BVDV-L株不低于10^7.5TCID₅₀，IBRV-J1株、BPIV3-S株不低于10^8.33TCID₅₀。将抗原缓缓注入206佐剂中，保持30℃，按抗原：佐剂体积比1:1进行混合乳化，配制成三联灭活疫苗。

实施例2

——牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗(L株+J1株+S株)的成品检验

1.无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。上述检验结果见表2。

表2物理性状、无菌检验结果

2.安全检验：

(1)替代动物检验：用1.5～2.0kg的健康家兔6只，其中免疫组4只，对照组2只，免疫组家兔各腿部肌肉注射疫苗1.0ml(两点注射，0.5ml/点)，对照组家兔各腿部肌肉注射细胞培养物1.0ml(两点注射，0.5ml/点)，连续观察7天并每天下午定点测量体温，均健活，免疫组腿部注射部位触摸无异样，无流鼻液、打喷嚏等症状，精神、采食正常，体温均低不高于40.0℃。选用350～400g健康雌性豚鼠6只，其中免疫组4只，对照组2只，免疫组豚鼠各颈部皮下注射疫苗0.5ml(两点注射，0.25ml/点)，对照组豚鼠各颈部皮下注射细胞培养物0.5ml(两点注射，0.25ml/点)，连续观察7天，均健活，免疫组颈部皮下触摸无硬块，无流鼻液、打喷嚏等症状，精神、采食正常。

(2)本体动物检验：用6月龄以上BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛4头，其中免疫组2头，对照组2头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物4.0ml；选用2月龄BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感犊牛4头，其中免疫组2头，对照组2头，免疫组犊牛各头颈部肌肉注射疫苗4.0ml，对照组犊牛各颈部肌肉注射细胞培养物4.0ml。连续观察14天，均健活，颈部肌肉注射部位触摸无异样，无流鼻液、流眼泪、打喷嚏等症状，精神、采食正常，体温均不高于40.0℃。安全检验结果及体温变化见表3、图1～3。

表3安全检验结果

3.效力检验

(1)中和抗体检测法试验选用350～400g健康雌性豚鼠8只(BVDV、IBRV、BPIV3血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)，其中免疫组5只，对照组3只，免疫组豚鼠各腿部肌肉注射疫苗1.0ml(两点注射，0.5ml/点)，对照组豚鼠各腿部肌肉注射细胞培养物1.0ml(两点注射，0.5ml/点)，21天后同样方式加强免疫，二免后21天心脏采血测定中和抗体水平，4只豚鼠的BVDV、BPIV3中和抗体效价＞64、5只豚鼠的IBRV中和抗体效价＞64，具体结果见表4。

(2)牛体免疫攻毒法试验选用2～3月龄BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛30头，其中免疫组15头，攻毒对照组15头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml，21天后同样方式加强免疫，二免后21天将免疫牛随机分为BVDV、IBRV及BPIV3组，每组5头，各组单独饲养。BVDV组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行BVDV强毒攻毒，每头牛左右鼻孔、口腔、颈部两侧肌肉各注射2.0ml BVDV强毒株；IBRV组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行IBRV强毒攻毒，每头牛上、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5ml IBRV强毒株；BPIV3组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行BPIV3强毒攻毒，每头牛上、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5ml BPIV3强毒株。攻毒后连续观察14天，每天上午定点测量体温，观察临床症状并采集鼻拭子进行病原检测与病毒分离。具体结果见表5～7。

表4效力(豚鼠)检测结果

表5BVDV效力(牛)检测结果

注：符合体温升高、流鼻液、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。

表6IBRV效力(牛)检测结果

注：符合体温升高、流鼻液、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。

表7BPIV3效力(牛)检测结果

注：符合体温升高、流鼻液、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。

结果表明，使用BVDV、IBRV、BPIV3三联灭活疫苗免疫牛后，能够有效抵抗强毒株的攻击，对BVDV、IBRV、BPIV3强毒株的保护率分别为80％、100％、80％。

序 列 表

<110> 齐鲁动物保健品有限公司

<120> 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗及其制备方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增BVDV 5’-UTR的引物BVDV-P1

<400> 1

AGGCTAGCCA TGCCCTTAGT 20（序列1）

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 扩增BVDV 5’-UTR的引物BVDV-P2

<400> 2

TCTGCAGCAC CCTATCAGG 19 （序列2）

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增IBRV gB基因的特异性引物gB-P1

<400> 3

TACGACTCGT TCGCGCTCTC-3’20 （序列3）

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增IBRVgB基因的特异性引物gB-P2

<400> 4

GGTACGTCTC CAAGCTGCCC-3’ 20 （序列4）

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增IBRV gE基因的特异性引物gE-P1

<400> 5

GCTTCGGTCG ACACGGTCTT-3’ 20（序列5）

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增IBRV gE基因的特异性引物gE-P2

<400> 6

CTTTGTCGCC CGTTGAGTCG-3’ 20（序列6）

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增704bp的BPIV3特异性片段的引物BPIV3-P1

<400> 7

GAGAAAGACC CAGGAAGACA GA 22（序列7）

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增704bp的BPIV3特异性片段的引物BPIV3-P2

<400> 8

ACACCCATCG CATAACTCCA GA 22（序列8）

1