一种调节植物对干旱感应信号钙离子和激素脱落酸反应的基因

摘要

本发明公开了一种调节植物对干旱感应信号钙离子和激素脱落酸反应的基因，具体而言，涉及抗旱相关基因Sv4317的克隆及功能表达方式，通过材料的准备与处理、RNA的提取和cDNA的反转录，使用PCR进行克隆出抗旱Sv4317基因，将该基因通过转基因手段导入拟南芥野生植物中，通过筛选抗性苗最终的到T

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。沙地柏属于强旱生和耐土壤养分贫瘠植物，广泛应用于我国北方荒漠化地区防风固沙生态工程中。本发明首先利用基于Illumina Solexa技术平台，对沙地柏根RNA进行了高通量转录组测序。因为钙是植物感应和抵抗逆境最重要的信号分子，我们对沙地柏转录组中有编码钙结合蛋白的基因进行了梳理。进一步对其中序列代号是Sv4317的基因进行深入分析和研究。生物信息学发现Sv4317可能编码一个Ca转运蛋白。为了明确这个基因的功能，我们通过基因工程的方法，将这个基因在模式植物拟南芥中进行了表达。对转基因拟南芥进行表型分析发现，含有Sv4317基因的拟南芥植物，相对于不含有这个基因的正常植物，表现出对低钙和低浓度干旱感应激素脱落酸(ABA)超敏感的现象。这说明Sv4317具有调节植物对干旱感应信号钙离子和干旱感应激素脱落酸反应的功能，具有应用到调节作物对这两种干旱相关信号感应的、遗传育种工作中的潜力。

背景技术

沙地柏(Sabina vuLgaris.)，又名叉子圆柏、新疆圆柏，主要分布于内蒙古、陕西、新疆、宁夏、甘肃、青海等地。主要培育基地有江苏、浙江、安徽、湖南等地。沙地柏能忍受风蚀沙埋，长期适应干旱的沙漠环境，是干旱、半干旱地区防风固沙和水土保持的优良树种。喜光，喜凉爽干燥的气候，耐寒、耐旱、耐瘠薄，对土壤要求不严，不耐涝，在肥沃通透土壤成长较快。适应性强，扦插宜活，栽培管理简单，这种生命力坚强的常绿植物在北方绿化和造林中具有举足重轻的作用，所以研究沙地柏，对于野生植物抗旱相关基因的开发和利用具有重要意义。目前对于沙地柏的研究主要集中在生理和生态特性方面，在关于其抗旱基因的克隆及利用方面均无报道。

我国植物分子育种能力同发达国家差距巨大，拥有自主知识产权的抗逆基因是世界植物分子育种领域竞争的焦点。对于植物抗逆基因的开发及利用，目前的研究主要集中于模式植物拟南芥或水稻、小麦等作物中，缺乏对野生植物体内丰富的抗逆基因的挖掘。本发明正是利用ILLumina公司的高通量测序技术，对我国北方荒漠化地区防风固沙首选树种沙地柏进行转录组测序，获得了一种经自然环境长期筛选出的抗旱相关基因Sv4317。

发明内容

本发明的目的是的利用分子克隆技术，对抗旱基因Sv4317进行克隆，最终得到用于基因表达的表达载体，从而使该基因导入到拟南芥野生植物中并在野生植物体内表达，再通过表型分析进一步验证该基因的功能。

本发明的实施方案是选用苗木基地的沙地柏为实验材料，采用ILLumina SoLexa转录组高通量测序的方法，获得沙地柏抗旱相关基因Sv4317的核苷酸序列，通过对序列的分析设计引物，再通过分子克隆技术获得该基因，并将其导入到拟南芥中，最终获得转基因植株，通过对转基因植株进行表型分析了解基因的生物学功能。

本发明的一个目的在于提供新的沙地柏抗旱相关基因，定名为Sv4317，其序列为SEQ No：1的序列。

本发明涉及一种在沙地柏根内表达量较高的基因，名称为Sv4317，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO：1或SEQ NO：2所示，其编码的728个氨基酸序列，如序列表中SEQ NO：3所示。

具体地说，本发明提供了含有下述序列之一的分离的多核苷酸：

(1)序列表中的SEQ NO：1或SEQ NO：2

(2)与序列表中的SEQ NO.1或SEQ NO.2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

上述涉及的多核苷酸还包括取代、缺失和插入突变体以及等位变体、剪接变体、片段、衍生物等。

本领域技术人员可以理解的是，上述的分离的多核苷酸也包括那些与SEQ NO：1或SEQ NO：2所示序列具有较高同源性的序列，例如同源性大于95％，或90％，甚至85％的序列；

还包括那些在严谨条件下可与SEQ NO：1或SEQ NO：2所示序列杂交的序列；或者可与SEQ NO：1或SEQ NO：2的序列互补的序列。

本发明同时提供了将本发明的新基因Sv4317应用于植物抗旱基因工程的技术方案，具体植物可包含沙地柏和拟南芥。

本发明从沙地柏中成功地分离获得了一种经自然环境长期筛选出的抗相关基因Sv4317，这给利用基因工程技术培育抗旱植物提供了新的方向，对干旱胁迫下的分子育种工作具有重要意义。具体来说，本发明的具体实施方案之一是将Sv4317基因应用于植物基因工程以提高植物在干旱胁迫下的生存能力。

以上概括的描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。

附图说明

图1：实验总的流程图

图2：含有Sv4317基因的转基因拟南芥C6-6在低浓度钙离子和干旱激素ABA存在条件下的的生长表型。

图3.含有Sv4317基因的转基因拟南芥C6-6在低浓度钙离子和干旱激素ABA存在条件下的的叶鲜重统计图。

图4：含有Sv4317基因的转基因拟南芥C6-6在其他矿质离子缺乏条件下的生长表型。

图5：含有Sv4317基因的转基因拟南芥C6-6在其他矿质离子缺乏条件下根长的统计分析。

图6：表型分析中培养皿的种植方式

具体实施方式

实施例1、沙地柏样品采集

本发明选用内蒙古蒙草抗旱股份有限公司苗木基地的树种为实验材料。为了最大限度的增加其体内和抗逆性相关的RNA的丰富度，选择在天气相对寒冷的12月(2013年)进行沙地柏根的取样，样品在收集后迅速保存于液氮中备用。

实施例2、表达载体的构建

a.总RNA的提取

采用TRIzol法提取RNA

1)、将适量的液氮盛于研钵中，充分预冷研钵，直至液氮不沸腾四溅，将收集好的植物放入液氮中(保证液氮没过根或粉末即可)

2)、加入液氮后，用杵将植物捣成碎块，待液氮挥发至仅能盖住研钵底部时，迅速研磨，及时补加液氮，研磨过程重复2-3次。

3)、将准备盛放研磨粉末的离心管在液氮中预冷：顺序为管底-管壁-管口(不要将管体与管盖连接部分伸入液氮中，以免断裂)。离心管盖子中间用镊子钻一个小洞，以免加入液氮以后离心管爆裂。

4)、用经过液氮充分冷却的离心管从研钵中挖取粉末(1.5mL离心管粉末体积少于50μL)，迅速加入1mLTRIzol提取液，加入提取液时冲击离心管底部粉末，并迅速在振荡器上混匀(使提取液在30秒内溶解RNA，以便保护RNA)。确保粉末在融入TRIzol之前不融化。(粉末与提取液的体积比约为1∶10到1∶15)。充分混匀，室温放置不少于5分钟。

5)、10000x g，4℃离心20分钟。离心时间长一些，可以使RNA同其他沉淀分的更好，在RNA相内污染更少。

6)、取80％左右的上清液到一个新的离心管内，加入1/4体积的氯仿，充分Vortex

7)、10000x g，4℃离心15分钟。这是检测RNA提取是否能成功的关键步骤。如果前面都是成功的，这时候看见的是两层完全透明但又清晰分开的溶液，中间没有任何看见物质。这是最完美的。如果严格遵守前面步骤，达到这个状况并不难。相对不完美，但是还可以接受的情况是，中间有淡淡的微透明的白色物质；如果这个时候中间层有清晰的不透光的乳白色沉淀，实验基本上已经失败。用氯仿反复抽提也不会解决问题。而且每次抽提都会有溶液的损失，到最后即使去除了蛋白质沉淀，也得不到足够的RNA。

8)、取80％左右的上清液到一个新的离心管内。宁可牺牲一些上清液，也要完全避免吸取任何中间层物质。加入等体积的在-20℃保存的异丙醇，充分Vortex。-20℃静置1小时，如果有时间连续工作。如果因为时间问题，也可过夜，这个时候RNA基本是稳定的。

9)、10000x g，4℃离心20分钟，弃上清。

10)、用1mL乙醇(DEPC水配制)。充分混匀，使RNA沉淀完全破碎，只要这样才能达到乙醇溶解盐的目的。10000x g，4℃离心10分钟(洗二次)(以此往下均在超净内进行)

11)、缓慢倒掉大部分上清，倒置离心管在灭菌的滤纸上，吸净残液。高速快速离心1分钟。用最小枪头吸取残留上清液体。室温干燥5-10分钟

12)、加20-30μL左右DEPC水回溶。

13)、取1μL电泳，观察带型。高电压，短时间，控制在10分钟内。

b.cDNA的反转录

RNA 7μL

Anchored OLigo(dT)20Primer(0.5μg/μL)1μL

DEPC1μL

65℃孵育5分钟，冰浴2分钟，再加入

2Xts II Reaction Mix10μL

TransScript II RT/RI Enzyme Mix 1μL

gDNA Remover1μL

50℃孵育反转录30分钟，85℃加热5秒失活TransScript II RT/RI与gDNARemover。

c.沙地柏Sv4317基因表达载体的构建

扩增Sv4317基因编码序列的引物

正向引物：5’-ATTTGCGGCCGCATG GAG GAT CCG CTG ATC ATG AAT-3’

反向引物：5’-CCCTCGAGCTAAGC ACA ATT TTC TTC CAA CTC-3’

选用TaKaRa的一款高保真的DNA聚合酶Primer Star对C_6-6进行目的基因的克隆。具体方案如下

1、目的基因的反应体系：(50μL)

PCR循环体系

98℃ 5min

26个循环

2、选用TRAN的胶回收试剂盒回收目的基因

①切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，如果胶重为100mg，可视为100μL(100mg＝100μL)，以此类推。

②加入3倍体积溶液GSB，于55℃水浴溶胶6-10分钟，间断(2-3分钟)混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液的颜色，如颜色为紫色，加入适量3M醋酸钠(PH5.2)，调整颜色和GSB颜色相同(黄色)。(为增加DNA回收量，可加入1倍体积的异丙醇于已融化的凝胶溶液中，，如果胶重为100mg，，加入100μL异丙醇)。

③待融化的凝胶溶液降至室温(高温时离心柱结合DNA能力弱)，加入离心柱中静置1分钟，10000x g离心1分钟，弃流出液。

④加入650μL溶液WB(事先加入无水乙醇)，10000x g离心1分钟，弃流出液。

⑤10000x g离心1-2分钟，去除残留的WB。

⑥将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置1分钟，使残留乙醇挥发干净。在柱中央加入30-50μL EB或去离子水(PH＞7.0)(EB或去离子水在60-70℃水浴预热，使用效果更好)，室温静置1分钟。

⑦10000x g离心1分钟，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20℃保存。

3、将胶回收得到的目的片段与克隆载体pEASY-BLunt SimpLe(Kan)按照一定比例25℃连接一个小时。

4、热激法转化大肠杆菌感受态：取大肠杆菌感受态于冰上解冻，加入连接反应产物，混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，立即置于冰上2分钟；加入500μL无抗性LB液体培养基，37℃摇床上200rpm或37℃恒温培养箱静置培养60分钟后，将菌液涂布与含有相应抗生素(Kan 50mg/mL)的固体LB平板上；37℃倒置培养过夜后观察其结果。

5、菌落PCR鉴定

为了获得正确的阳性克隆，首先随机挑选培养基上生长的单菌落进行PCR鉴定

(一般12个左右)，模板换成单克隆菌落，用灭过菌的牙签挑取。

菌落PCR的体系(选用TRAN的一款DNA聚合酶EasyTaqMix)

混匀，离心，按下面循环进行扩增反应，反应条件：

94℃ 5min

35个循环

1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，将条带正确的挑菌加入到含有kan(50mg/mL)抗生素的5mL LB培养液里，37℃摇床过夜培养。

6、质粒提取：选用TRAN的质粒提取试剂盒提取质粒

1)、取2mL过夜培养的菌液，10000x g离心1分钟，去上清。如菌液量大，可分多次离心收集。

2)、加入250μL无色溶液RB(含RnaseA)，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。

3)、加入250μL蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5分钟)。

4)、加入350μL黄色溶液NB，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟。

5)、12000x g离心5分钟，小心吸取上清加入离心柱中。12000xg离心1分钟，弃流出液。如上清体积大于800μL，可以分成多次加入柱中，并同上离心，弃流出液。

6)、加入650μL溶液WB，12000xg离心1分钟，弃流出液。

7)、12000x g离心2分钟，彻底去除残留的WB。

8)、将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL EB或去离子水(PH＞7.0)室温静置1分钟。

9)、10000x g离心1分钟，洗脱出的DNA于-20℃保存。

7、酶切验证：根据质粒图谱和待克隆的DNA特异片段酶切图谱选用限制性内切酶5’：SaL I 3′：EcoR I(一般选用双酶切)对阳性克隆质粒进行验证。

双酶切反应体系

混匀后根据根据公司提供目录所示的酶活温度定为37℃，温浴30分钟，1％琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳条带大小判断片段是否正确。

8、测序：经过菌落PCR和质粒酶切验证正确的克隆，最后进行测序验证其序列的正确性，测序工作一般交由南京金斯瑞公司完成。对测序结果与已知基因序列比对分析，从中选出正确的克隆，用于下一步目的载体的构建。

9、目的载体的连接和构建的完成

目的载体的连接是将测序正确的基因片段和目的载体同时经过5’：SaL I 3′：EcoR I的酶切，经过DNA胶回收，DNA连接酶连接，然后转化大肠杆菌，经过菌落PCR和提取质粒，酶切验证的方法，最终获得连接到的载体基因的质粒。

a、目的片段与表达载体的连接：

原则：按照目的片段和表达载体摩尔比是3∶1或1∶3的比例进行连接

T4DNA连接酶(1μL)+buffer(2μL)+17μL(目的片段+表达载体)

16℃过夜连接

b、转化：取大肠杆菌感受态于冰上解冻，将连有目的片段和表达载体的产物再次转化到大肠杆菌感受态里，混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，立即置于冰上2分钟；加入500μL无抗性LB液体培养基，37℃摇床上200rpm或37℃恒温培养箱静置培养60分钟后，将菌液涂布与含有相应抗生素(Spe 50mg/mL)的固体LB平板上；37℃倒置培养过夜后观察其结果。

c、菌落PCR鉴定

为了获得正确的阳性克隆，首先随机挑选培养基上生长的单菌落进行PCR鉴定

(一般12个左右)，模板换成单克隆菌落，用灭过菌的牙签挑取。

菌落PCR的体系(选用TRAN的一款DNA聚合酶EasyTaqMix)

混匀，离心，按下面循环进行扩增反应，反应条件：

94℃ 5min

35个循环

1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，将条带正确的挑菌加入到含有Spe(50mg/mL)抗生素的5mL LB培养液里，37℃摇床过夜培养。

d、质粒提取：选用TRAN的质粒提取试剂盒提取质粒

1)、取2mL过夜培养的菌液，10000x g离心1分钟，去上清。如菌液量大，可分多次离心收集。

2)、加入250μL无色溶液RB(含RnaseA)，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。

3)、加入250μL蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5分钟)。

4)、加入350μL黄色溶液NB，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟。

5)、12000x g离心5分钟，小心吸取上清加入离心柱中。12000x g离心1分钟，弃流出液。如上清体积大于800μL，可以分成多次加入柱中，并同上离心，弃流出液。

6)、加入650μL溶液WB，12000x g离心1分钟，弃流出液。

7)、12000x g离心2分钟，彻底去除残留的WB。

8)、将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL EB或去离子水(PH＞7.0)室温静置1分钟。

9)、10000x g离心1分钟，洗脱出的DNA于-20℃保存

e、酶切验证：继续选用前面所用的限制性内切酶5’：SaL I 3′：EcoR I对阳性克隆质粒进行验证。

双酶切反应体系

37℃恒温培养箱，温浴30分钟。1％琼脂糖凝胶电泳检测，选取带型正确的进行保菌(40％黄盖甘油)

10、农杆菌转化：电转化法转化农杆菌

1)、取农杆菌感受态，置于冰上融化，加入质粒约5μL，混匀后冰上放置30分钟。

2)、同时准备干净干燥的电转杯，冰上预冷；

3)、将电转杯表面擦干，把加有质粒的农杆菌全部加入电转杯中后放入电转仪，电激转化；

4)、电转杯加入1mL无抗生素的LB培养液，反复吹吸，吸入2mL离心管中，28℃摇床200rpm或28℃恒温培养箱恢复培养1.5小时后；

5)、取500μL菌液涂布于含有抗生素(Rif50mg/mL和Spe 50mg/mL)的固体LB培养基上，28℃恒温培养箱倒置培养1-2天直至单克隆出现；

6)、选取阳性农杆菌单菌落进行菌落PCR，将含有正确目的条带的PCR结果相应的农杆菌单菌落进行扩繁(菌落PCR的体系及反应条件同大肠杆菌的菌落PCR一样)。

11、农杆菌质粒提取：选用TRAN的质粒提取试剂盒提取质粒

1)、取2mL过夜培养的菌液，10000x g离心1分钟，去上清。如菌液量大，可分多次离心收集。

2)、加入250μL无色溶液RB(含RnaseA)，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。

3)、加入250μL蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5分钟)。

4)、加入350μL黄色溶液NB，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟。

5)、12000x g离心5分钟，小心吸取上清加入离心柱中。12000x g离心1分钟，弃流出液。如上清体积大于800μL，可以分成多次加入柱中，并同上离心，弃流出液。

6)、加入650μL溶液WB，12000xg离心1分钟，弃流出液。

7)、12000x g离心2分钟，彻底去除残留的WB。

8)、将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μLEB或去离子水(PH＞7.0)室温静置1分钟。

9)、10000x g离心1分钟，洗脱出的DNA于-20℃保存

12、酶切验证：选用限制性内切酶5’：SaL I 3′：EcoR I对所提取的质粒进行验证，

双酶切反应体系

28℃恒温培养箱，温浴30分钟。1％琼脂糖凝胶电泳检测，分析结果，选择条带正确的农杆菌保存甘油菌(40％蓝盖)，用于转化植物。

实施例3、转基因植物的获取

本实施例采用花絮侵染法来获取转基因植株代号

1、挑取已正确保菌的农杆菌进行活化(活化目的是确保菌的活力)，将活化好的菌加入到含有抗生素(50mg/mLRif和50mg/mLSpe)的5mL LB培养液中，28℃摇床过夜培养，将摇好的菌液放入到离心机内，5000x g，10min，弃去上清液，加入1mL的侵染液(5％蔗糖，0.02％silwet悬浮液溶于水)，用胶头滴管轻轻吹吸使菌悬浮。

2、选用三盒长势良好且已开花的野生型Col-0植株，剪去植株上的已结豆荚和已完成授粉的花苞，用胶头滴管吸取菌液滴在未开花的花苞上，并贴标签标注，每隔2-3天侵染一次，直至所有植株都开花(注：每次侵染前一天给植物浇水)。

3、当植株成熟后及时收取T₁代种子，待种子干燥一周左右将其撒播在含有抗生素的抗性固体MQA>1代的筛选。

4、选取抗性培养皿上长势良好的T₁代植株，移土培养并单株标号，待其成熟后及时单株收取T₂代种子，干燥一周后，继续将其单管撒在抗性培养基上，光照培养数天后，选取符合活死比为3∶1的T₂代植株进行移土培养等待收取T₃代的植株。将T₃代植株继续撒在抗性培养皿上，选取全活的纯和植株即为可用作表型分析的种子。

实施例4、在不同元素中的表型分析

本实例中用到的MQA培养基成分主要有

大量元素：1MKNO₃、1MMgSO₄、1MH₃PO₄、1MCaCl₂

微量元素：MS微量(0.5x)、

Fe²⁺盐：MSFe²⁺盐(0.5x)

Mn²⁺盐：MSMn²⁺盐(0.5x)以及0.5M>

碳源：1％蔗糖

a.具体的培养基方案如表1(100mL)

注：10μM PO43-、0μM K+、0μM Ca2+、10μMNO3-、0μM Mg2+这几个梯度加入1.0％的琼脂糖1g

1mMCa²⁺、1μMABA、80mMNaCL这几个梯度加入1.2％的琼脂1.2g

另ABA是在培养基灭完菌之后温度降至手温时再加。

表1：各种元素的培养基方案KOH或BTP调PH为5.7(80mMNacl调PH为7.0)

b.种植方式如图4所示

每种梯度三个重复，待种完后用封口膜封口，先在4℃冰箱春化三天，再放置温度为22℃，湿度为40％RH的培养室竖直光照培养二十天之后观察C_6-6与野生型Col-0的表型，并对其进行根长和鲜重的数据和照片采集，可以看出C_6-6相对于野生型Col-0在0μMCa²⁺有叶黄而小、根短的敏感表型和1μMABA表现为叶小、根短的表型，如图所示(附图2和附图3)

c.培养皿的摆放

8个梯度为一组，分为三组

例：假设八个梯度分别以字母A、B、C、D、E、F、G、H

A、B、C、D、E、F、G、H

B、C、D、E、F、G、H、A

C、D、E、F、G、H、A、B

以上实施例进一步说明了本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范畴。