准噶尔大戟中的萜类化合物及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种准噶尔大戟中的萜类化合物及其制备方法和用途，该方法以准噶尔大戟（

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及准噶尔大戟中的萜类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

大戟属(Euphorbia)是大戟科(Euphorbiaceae)中的一个大属，全球约有2000余种植物，广泛分布于热带及温带地区。大戟属植物具有重要的药用价值，多用于通便、利尿，治疗结核、水肿、牛皮癣、和疥疮等疾患。准噶尔大戟(Euphorbia soongarica Boiss.)为大戟属多年生草本植物，产于新疆北部和甘肃西部，分布于中国、西西伯利亚至中亚和蒙古。其根部入药，具有逐水、消肿、散瘀的功效，在新疆地区也作为大戟的替代品使用。目前已报道的从准噶尔大戟中得到的化合物有50余个，主要为黄酮类、多酚类和三萜类化合物，但有关其生物活性的研究甚少，仅发现3个三萜类化合物具有一定的细胞毒性，而大戟属的特征成分——二萜类化合物并未见报道。因此，对准噶尔大戟的化学成分进一步挖掘研究，对明确准噶尔大戟次生代谢产物提供参考，也为揭示其药效作用的物质基础提供依据。

肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)，即一种药物作用于肿瘤使之产生耐药性后，该肿瘤对从未接触、结构无关、靶点不同、机制各异的多种抗肿瘤药也具有交叉耐药性的现象。MDR有多种形成机制，其中最主要的机制之一是ABC家族转运蛋白(目前研究最广泛、最深入的为ABCB1基因编码的P-糖蛋白，P-gp)的过表达，导致药物外排增加，形成耐药性。近年来，许多从植物中分离得到的二萜类化合物被发现具有显著的MDR逆转活性，因而成为研究热点之一。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种准噶尔大戟中的萜类化合物及其制备方法和用途，该方法以准噶尔大戟(E.soongarica)的全草为原料，用有机溶剂提取，通过溶剂萃取法、正相硅胶柱层析法、反相硅胶柱层析法、Sephadex LH-20凝胶柱层析法中的三种至四种方法进行分离，得到10个新的萜类化合物(包括5个二萜类、3个降碳三萜类和2个三萜类化合物)，并对得到10个新的萜类化合物进行了多药耐药逆转活性测定，结果表明：所述新的萜类化合物具有不同程度的多药耐药逆转活性，可用于制备多药耐药逆转药物中的应用，或将其与抗肿瘤药物组合制备抗肿瘤组合药物。

本发明所述的一种准噶尔大戟中的萜类化合物，该化合物为二萜类化合物和三萜类化合物，其中二萜类化合物的结构式为：

式(Ⅰ)化合物为3β-苯甲酰氧基-5,6-环氧-随续子烷-12E-烯-7β,15β-二醇-14-酮；

式(Ⅱ)化合物为3β-苯甲酰氧基-随续子烷-5E,12E-二烯-7β,15β-二醇-14-酮；

式(Ⅲ)化合物为麻疯树烷-4E,6(17)-二烯-13β,14β-二醇-3-酮；

式(Ⅳ)化合物为12α-苯丙烯酰胺基-3β-乙酰氧基-甘青大戟B烷-5α,15β-二醇-14-酮；

式(Ⅴ)化合物为12α-苯甲酰氧基-甘青大戟B烷-4Z-烯-3β,5α-二醇-14-酮；

三萜类化合物的结构式为：

式(Ⅵ)化合物为25,26,27-三降-大戟烷-8Z,22E-二烯-3β-醇-7-酮-24-醛；

式(Ⅶ)化合物为27-降-大戟烷-8Z,23E-二烯-3β-醇-7,25-二酮；

式(Ⅷ)化合物为24R-大戟烷-8Z,25E-二烯-3β,24-二醇-7-酮；

式(Ⅸ)化合物为22,23,24,25,26,27-六降-大戟烷-8Z-烯-3β-醇-7,20-二酮；

式(Ⅹ)化合物为7,15-二氧-D:C-friedo-齐墩果烷-8Z-烯-3β-醇。

所述准噶尔大戟中的萜类化合物的制备方法，按下列步骤进行：

a、以准噶尔大戟全草为原料，粉碎后用5-10倍量体积浓度为50-99％的乙醇水溶液、无水乙醇、体积浓度为50-99％的甲醇水溶液、无水甲醇、体积浓度为50-99％的丙酮水溶液或丙酮进行室温下的渗漉或冷浸提取，或加热回流提取，浓缩得到准噶尔大戟粗提物；

b、将步骤a得到的粗提物用乙腈分散，加入环己烷、正己烷或石油醚萃取，或将粗提物用环己烷、正己烷或石油醚分散，再加入乙腈萃取1-5次，将乙腈萃取液浓缩，得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏经正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析法中的两种或三种进行分离，即得到式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物。

步骤c中所用正相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析，所用填料为硅胶，所用洗脱剂为石油醚、环己烷、正己烷、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中至少两种溶剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。

步骤c中所用反相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析，洗脱剂为体积浓度为30-99％的甲醇水溶液、10-99％的乙腈水溶液或10-99％的乙腈-甲醇-水混合溶液，采用等度洗脱或梯度洗脱。

步骤c中所用Sephadex LH-20凝胶柱层析法为常压柱层析，洗脱剂为甲醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或它们中至少两种溶剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。

所述准噶尔大戟中的萜类化合物中的式(Ⅳ)和式(Ⅴ)化合物，式(Ⅵ)、式(Ⅶ)和式(Ⅷ)化合物在制备多药耐药逆转药物中的用途。

所述准噶尔大戟中的萜类化合物中的式(Ⅳ)和式(Ⅴ)化合物，式(Ⅵ)、式(Ⅶ)和式(Ⅷ)化合物在制备与抗肿瘤药物组合的药物中的用途。

本发明所述的准噶尔大戟中的萜类化合物及其制备方法和用途，通过所述方法获得的10个新的萜类化合物经过多药耐药逆转活性测定，实验结果表明：所述式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)、式(Ⅶ)和式(Ⅷ)化合物能够不同程度地抑制耐药细胞中P-糖蛋白介导的药物排外作用，从而表现出多药耐药逆转活性，可用于制备多药耐药逆转药物或与抗肿瘤药物组合制备抗肿瘤组合药物。

本发明所述的准噶尔大戟中的萜类化合物，可通过从植物中分离纯化得到，也可以经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。

本发明所述的准噶尔大戟中的萜类化合物，采用高分辨质谱、一维和二维核磁共振谱等现代波谱手段确定其结构，结构鉴定过程如下：

式(Ⅰ)化合物为白色无定型粉末，[α]_D²⁰+44.0(c>max(logε)229(4.21),267(4.19)nm；ECD(MeOH)202(Δε-2.71),231(Δε-8.34),272(Δε+8.15),348(Δε+0.53)nm；HRESI(+)MS给出准分子离子峰m/z>+(计算值为C₂₇H₃₅O₆455.2434)，确定其分子式为C₂₇H₃₄O₆；根据¹H，¹³C>1H和¹³C>1H)，150MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

式(Ⅱ)化合物为白色无定型粉末，[α]_D²⁰+90.0(c>max(logε)229(4.20),274(4.13)nm；ECD(MeOH)216(Δε-16.13),237(Δε-14.58),278(Δε+16.85),345(Δε+2.53)nm。根据HRESI(+)MS(m/z>+，计算值为C₂₇H₃₅O₅>27H₃₄O₅；根据¹H，¹³C>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

式(Ⅲ)化合物为白色无定型粉末，[α]_D²⁰-75.6(c>max(logε)231(3.88)nm；ECD(MeOH)231(Δε-12.86)nm；根据其¹³C>+，理论值C₂₀H₂₉O₃>20H₂₈O₃；根据¹H，¹³C>1H和¹³C>1H)，150MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

表1.式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)化合物的¹H和¹³C>

式(Ⅳ)化合物为白色无定型粉末，[α]_D²⁰+1.0(c>max(logε)216(4.23),277(4.29)nm；ECD(MeOH)203(Δε-10.54),260(Δε-1.43),311(Δε+4.49)nm；通过其HRESI(+)MS数据(m/z>+，计算值为C₃₁H₄₂NO₆524.3012)并结合氮率确定其分子中含有一个氮原子，分子式为C₃₁H₄₁NO₆；根据¹H，¹³C>1H和¹³CNMR归属见表2[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，CDCl₃]。

式(Ⅴ)化合物为无色油状，[α]_D²⁰-31.0(c>max(logε)230(4.01)nm；ECD(MeOH)250(Δε-7.37),333(Δε+0.67)nm；根据其¹³C>+，理论值C₂₇H₃₅O₅>27H₃₄O₅。根据¹H，¹³C>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，CDCl₃]。

表2.式(Ⅳ)、式(Ⅴ)化合物的¹H和¹³C>

式(Ⅵ)化合物为白色无定型粉末，[α]_D²⁰+7.8(c>max(logε)216(3.94)nm；ECD(MeOH)219(Δε+1.37),247(Δε-0.27),280(Δε+1.34),337(Δε+0.65)nm；根据其HRESI(+)MS数据(m/z>+，理论值C₂₇H₄₁O₃413.3056)判断其分子式为C₂₇H₄₀O₃；根据¹H，¹³C>1H和¹³C>1H)，150MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

式(Ⅶ)化合物为白色无定型粉末，[α]_D²⁰+7.0(c>max(logε)224(3.96)nm；ECD(MeOH)233(Δε+0.75),257(Δε-1.13),284(Δε+0.49),335(Δε+1.09)nm；HRESI(+)MS给出m/z>+(理论值C₂₉H₄₅O₃>29H₄₄O₃；根据¹H，¹³C>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

表3.式(Ⅵ)、式(Ⅶ)化合物的¹H和¹³C>

式(Ⅷ)化合物为白色无定型粉末，[α]_D²⁰+15.0(c>max(logε)254(3.97)nm；ECD(MeOH)220(Δε-2.73),260(Δε-2.44),338(Δε+1.86)nm；HRESI(+)MS给出准分子离子峰m/z>+(理论值C₃₀H₄₉O₃>30H₄₈O₃；通过解析¹H，¹³C>13C>1H和¹³CNMR数据见表3[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]；式(Ⅷ)化合物及已知化合物[(+)-(24S)-eupha-8,25-diene-3β,24-diol-7-one]的¹³C(文献报道的和我们分得的)NMR数据见表4[150MHz(¹³C)]。

表4.式(Ⅷ)化合物和[(+)-(24S)-eupha-8,25-diene-3β,24-diol-7-one](文献报道的和我们分得的)的¹³C>6,δ(ppm)]

*文献中的ND为未检测到该信号。

式(Ⅸ)化合物为白色无定型粉末，[α]_D²⁰-24.2(c>max(logε)252(3.89)nm；ECD(MeOH)257(Δε-2.75),287(Δε-1.41),339(Δε+1.35)nm。通过其¹³CNMR和HRESI(+)MS数据(m/z>+，理论值C₂₄H₃₇O₃>24H₃₆O₃。根据¹H，¹³C>1H和¹³C>1H)，150MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

式(Ⅹ)化合物为白色无定型粉末，[α]_D²⁰+1.0(c>max(logε)245(3.96)nm；ECD(MeOH)209(Δε-4.22),254(Δε-4.76),284(Δε+0.53),334(Δε+0.74)nm。根据其HRESI(+)MS数据(m/z>+，理论值C₃₀H₄₇O₃455.3525)判断其分子式为C₃₀H₄₆O₃；根据¹H，¹³C>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

表5.式(Ⅸ)、式(Ⅹ)化合物的¹H和¹³C>

附图说明

图1-图2为本发明所述式(Ⅰ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图；

图3-图4为本发明所述式(Ⅱ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图；

图5-图6为本发明所述式(Ⅲ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图；

图7-图8为本发明所述式(Ⅳ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图；

图9-图10为本发明所述式(Ⅴ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图；

图11-图12为本发明所述式(Ⅵ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图；

图13-图14为本发明所述式(Ⅶ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图；

图15-图16为本发明所述式(Ⅷ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图；

图17-图18为本发明所述式(Ⅸ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图；

图19-图20为本发明所述式(Ⅹ)化合物的¹H和¹³C核磁共振谱图。

具体实施方式

实施例1.

a、取准噶尔大戟全草10kg，粉碎后用50L丙酮室温下渗漉提取，减压蒸干溶剂得到准噶尔大戟粗提物；

b、将步骤a得到的粗提物用乙腈分散，加入环己烷进行萃取，合并乙腈层并减压蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，合并相同流分，得到12个组分(F1-F12)；将组分F6进行正相硅胶柱分离，以体积比为40:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到组分F6A-F6F；将组分F6C经RP-18反相柱分离，以浓度为50％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇-水溶液的洗脱液，减压蒸干后采用制备反相柱(C₁₈>18>18>18>18>

实施例2

a、取准噶尔大戟全草10kg，粉碎后用60L的浓度为80％的丙酮-水溶液室温下冷浸提取，减压蒸干溶剂得到准噶尔大戟粗提物；

b、将步骤a得到的粗提物用乙腈分散，加入正己烷进行萃取，合并乙腈层并减压蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比为100:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经TLC分析，合并相同流分，得到12个组分(F1-F12)；将组分F6进行正相硅胶柱分离，以体积比为40:1-0:1的环己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，得到组分F6A-F6F；将F6C组分经RP-18反相柱分离，以浓度为30％-100％的乙腈-水溶液梯度洗脱，收集50％乙腈-水溶液的洗脱液，减压蒸干后采用制备反相柱(C₁₈>18>18>18>18>

实施例3

a、取准噶尔大戟全草10kg，粉碎后用70L乙醇室温下渗漉提取，减压蒸干溶剂得到准噶尔大戟粗提物；

b、将步骤a得到的粗提物用乙腈分散，加入石油醚进行萃取，合并乙腈层并减压蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比为100:1-0:1的环己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经TLC分析合并相同流分，得到12个组分(F1-F12)；将组分F6进行正相硅胶柱分离，以体积比为40:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到组分F6A-F6F；将F6C组分经RP-18反相柱分离，以浓度为50-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇-水溶液的洗脱液，减压蒸干后采用制备反相柱(C₁₈>18>18>

实施例4.

a、取准噶尔大戟全草10kg，粉碎后用80L的浓度为90％的乙醇-水溶液温度80℃下回流提取，减压蒸干溶剂得到准噶尔大戟粗提物；

b、将步骤a得到的粗提物用环己烷分散，加入乙腈进行萃取，合并乙腈层并减压蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经TLC分析合并相同流分，得到12个组分(F1-F12)；将组分F6进行正相硅胶柱分离，以体积比为40:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到组分F6A-F6F；将F6C段组分经RP-18反相柱分离，以浓度为30-100％的乙腈-水溶液梯度洗脱，收集50％乙腈-水溶液的洗脱液，减压蒸干后采用制备反相柱(C₁₈>18>185μm>

实施例5

a、取准噶尔大戟全草10kg，粉碎后用90L无水甲醇室温下渗漉提取，减压蒸干溶剂得到准噶尔大戟粗提物；

b、将步骤a得到的粗提物用正己烷分散，加入乙腈进行萃取，合并乙腈层并减压蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经TLC分析，合并相同流分，得到12个组分(F1-F12)；将组分F6进行正相硅胶柱分离，以体积比为40:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，得到组分F6A-F6F；将F6C段组分经制备反相柱(C₁₈>18>18>

实施例6

a、取准噶尔大戟全草10kg，粉碎后用100L浓度为90％的甲醇-水溶液室温下冷浸提取，减压蒸干溶剂得到准噶尔大戟粗提物；

b、将步骤a得到的粗提物用石油醚分散，加入乙腈进行萃取，合并乙腈层并减压蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比为100:1-0:1的环己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经TLC分析合并相同流分，得到12个组分(F1-F12)；将组分F6进行正相硅胶柱分离，以体积比为40:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，得到组分F6A-F6F；将F6C段组分经制备反相柱(C₁₈>18>18>

实施例7

式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的细胞毒和抗耐药活性测试：

材料与试剂：RPMI 1640培养基购自Invitrogen公司；双抗和胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶购自Gibco公司；噻唑蓝(MTT)购自上海翼飞生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学有限公司；罗丹明123购于SIGMA公司；盐酸维拉帕米购自阿拉丁化学有限公司；紫杉醇购自Biocompounds公司；酒石酸长春瑞滨购自上海赢瑞化学科技有限公司。

细胞株：人口腔鳞状细胞癌KB细胞及其长春新碱耐药株KBv200细胞(购自ATCC公司)。

细胞培养：人口腔鳞状细胞癌KB细胞及其长春新碱耐药株KBv200细胞在RPMI1640完全培养基(RPMI 1640培养基+10％FBS+1％双抗)中培养。所有细胞均置于CO₂培养箱(温度37℃，5％CO₂)维持传代培养。耐药株(KBv200细胞)在无抗肿瘤药的完全培养基中培养两周后用于实验。

实验方法：MTT法，以2500个/孔的密度将处于对数生长期的KB或KBv200细胞接种于96孔微量培养板内，在温度37℃培养箱孵育12h后加入供试单体化合物(20μL/孔)；另设空白对照组，溶剂(DMSO)对照组及阳性药物对照组；肿瘤细胞在温度37℃、5％CO₂条件下培养72h后弃去上清液，加入MTT液(5mg/mL，用生理盐水配制，20μL/孔)，在温度37℃、5％CO₂条件下继续培养1h；弃去上清液，每孔加入100μL>50值采用Logit法计算)和耐药系数：抑制率(％)＝(A对照组－A给药组)/A对照组×100％；耐药系数(RF)＝IC₅₀(KBv200)/IC₅₀(KB)。

实验结果：准噶尔大戟中分得的式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的半数生长抑制率，见表6：

表6.准噶尔大戟中式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物对KB和KBv200细胞的半数生长抑制率

由上表可知，式(Ⅱ)、式(Ⅴ)、式(Ⅶ)、式(Ⅷ)、式(Ⅹ)化合物对KB及KBv200细胞均有较弱的细胞毒性(IC₅₀范围10.34-22.94μM)，且对KB和KBv200细胞的抑制活性差别不大(耐药系数范围在0.90-1.19)，表明耐药细胞KBv200对这些化合物同样敏感。其他化合物未表现出细胞毒性(IC₅₀＞30μM)。

实施例8.

式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的多药耐药逆转活性测试：

实验方法：罗丹明123细胞内蓄积实验(流式细胞仪法)，该模型可间接显示以P-糖蛋白药物外排泵为靶点的肿瘤多药耐药逆转剂的逆转活性。若罗丹明123细胞内蓄积相对值越大，表明其在细胞内蓄积越多，则其多药耐药逆转活性越强。将KBv200细胞按15×10⁴/mL的密度接种于24孔板，每孔1mL，过夜以致贴壁；待细胞生长至70-80％融合时，每孔加入待测单体化合物(终浓度为10μM)后在温度37℃培养箱孵育4h；设空白对照组、溶剂(DMSO)对照组和阳性药物对照组(维拉帕米，10μM)；然后每孔加入罗丹明123(终浓度10μM)后于温度37℃培养箱避光孵育1h；弃去培养基，每孔用1mL冰1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2次后，消化收集细胞；每孔用300μL>

罗丹明123细胞内蓄积相对值＝(给药组平均荧光强度－空白对照组平均荧光强度)/(溶剂对照组平均荧光强度－空白对照组平均荧光强度)。

实验结果：准噶尔大戟中分得的式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的罗丹明123细胞内蓄积相对值见表7：

表7准噶尔大戟中分得的式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的罗丹明123细胞内蓄积相对值

如上表所示，式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)、式(Ⅶ)、式(Ⅷ)化合物的罗丹明123细胞内蓄积相对值均大于1，即这些化合物能够不同程度地抑制P-gp介导的药物外排作用，也即显示出不同程度的多药耐药逆转活性。

实施例9

式(Ⅷ)化合物逆转肿瘤多药耐药活性测试：

本实验选择准噶尔大戟中分得的萜类化合物中P-糖蛋白抑制活性最好的式(Ⅷ)化合物与抗肿瘤药长春瑞滨(NVB)联用，检测联用前后对耐药细胞的生长抑制，进行多药耐药逆转活性测试。

实验方法：将处于对数生长期的KBv200细胞以2500个/孔的密度接种于96孔微量培养板(每孔160μL)，在37℃培养箱中孵育24h后加入长春瑞滨(20μL/孔)和供试单体化合物或阳性对照药维拉帕米(20μL/孔)，每个浓度均为3个复孔，并设空白对照组和溶剂(DMSO)对照组；肿瘤细胞在温度37℃、5％CO₂条件下培养72h后弃去上清液，将MTT与细胞完全培养液按1:10的比例混匀后，每孔加入100μL，在温度37℃、5％CO₂条件下继续培养1h后弃去上清液，每孔加入100μL>

逆转倍数＝IC₅₀(长春瑞滨)/IC₅₀(长春瑞滨+二萜类化合物)

实验结果：式(Ⅷ)化合物与长春瑞滨联用对KBv200细胞的半数生长抑制率及其逆转倍数见表8：

表8式(Ⅷ)化合物与长春瑞滨联用对KBv200细胞的半数生长抑制率

由上表可知，长春瑞滨与式(Ⅷ)化合物联用后与长春瑞滨单独作用相比，IC₅₀值显著降低，降低程度以逆转倍数表示，3μM的式(Ⅷ)化合物的逆转倍数(225.35倍)即与10μM阳性对照药维拉帕米相当(259.46倍)，即式(Ⅷ)化合物具有很强的逆转肿瘤多药耐药的活性。