使用红外光谱法在线监测糖化过程的方法

摘要

本发明涉及一种用于控制酶预处理过程，例如糖化过程的方法和系统。该方法允许在酶预处理过程，例如糖化过程中实时精确地确定存在于溶液中的糖分子和糖链的平均长度。而且，关于例如溶解的蛋白质和游离氨基酸浓度的其他信息也可同时获得。所述方法包括使用红外(IR)光谱仪连续测量在生物质的预处理期间获得的样品的衰减全反射(ATR)红外光谱。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于控制酶预处理过程，例如糖化过程的方法和系统。这允许确定在酶预处理过程，例如糖化过程中实时精确地存在于溶液中的糖分子和糖链的平均长度。而且，例如溶解的碳水化合物(如蛋白质和游离氨基酸)的信息也可作为关于糖链的平均长度的信息同时获得。

背景技术

当进行例如酿造时，在广泛的谷物和其他含有淀粉和二-和多糖类的作物中天然存在的碳水化合物的微生物发酵之前，天然存在的碳水化合物通常需要酶预处理。该酶预处理称为糖化。可能需要进行这种糖化程序的谷物和作物的实例是大麦、小麦、黑麦、燕麦、水稻、玉米、木材或马铃薯。

在某些情况下，谷物在糖化前被制成麦芽。在制麦芽过程中，天然酶在作物中生长。在其他情况下，酶在糖化开始之前被加入到谷物或农作物中。在糖化过程中，水被加入到农作物中并且温度被升高且保持加入或天然存在的酶最活跃的一定温度下。糖化通常包括几个温度步骤以刺激不同的酶。

糖化过程期间，由于天然存在的淀粉的酶转化，形成不同类型的单、二和多糖化合物。较小的糖单元(诸如例如麦芽糖)在发酵过程中转化为乙醇，而略微较长的链(诸如例如麦芽糖糊精)在整个发酵中保持并有助于最终酿造物中优选的甜味。

糖化过程完成后，短链糖和长链糖的比例必须在非常窄的间隔内以获得想要的那种酿造。“过糖化”，其中所有淀粉完全转化为麦芽糖，将产生具有高醇含量，但具有平淡的和不令人愉快的或苦的味道的酿造物。另一方面“糖化不足”，其中仅淀粉的小部分转化为麦芽糖，将导致具有低醇含量的非常甜的酿造物。对于大多数类型的酿造物，使麦芽浆处于这两个极端之间某处的糖化过程是优选的。然而，糖化过程的控制是非常具有挑战性的，并没有很好的在线方法可用来测量短链和长链糖化合物之间的比例。

其他重要的酶过程包括在作物的蛋白质中肽键的水解。水解蛋白的含量也影响最终酿造物的特性，并因此是在糖化过程中要控制的一个重要因素。控制蛋白的水解度也是具有挑战性的。

整个酿造过程从科学的角度非常好地被理解-尤其详细对发酵过程进行了研究，并经常作为复杂的和高度工程化的生化过程操作。

相比之下，糖化是为数不多的留在酿造业的“黑盒子”之一，且糖化仍然基本上通过使用“秘方”和试错的方法进行。然而这在很多方面是有问题的。一个关注是，由于每批麦芽关于糖和蛋白质底物以及活性淀粉酶和蛋白酶酶两者均可具有不同组分，因此最优的糖化程序从不完全相同。

缺乏对糖化过程的了解和控制的原因是由于没有可用的提供糖化的在线监测分析技术。HPLC(高效液相色谱法)或GPC(凝胶渗透色谱法)可用于分析在麦芽浆中的糖化合物，但运行仅一个样品的时间比糖化本身每个温度步骤的时间尺度更长，因此其对于在线监测是无用的。

因此，需要新的分析技术来优化并允许更好地理解这一重要的生化过程类型。

发明内容

在本发明的第一个方面本文公开了一种用于控制酶预处理过程，例如糖化过程的方法。该方法包括以下动作：

a)向具有罐的系统提供样品；

b)通过如下获得样品混合物：

-如果样品不含一种或多种酶，则将一种或多种酶加入到样品中，或

-可能向已经含有一种或多种酶的样品中加入一种或多种酶；

c)连续地将一部分样品混合物暴露于红外(IR)光谱仪；

d)在酶预处理过程期间，使用红外光谱仪在400-3500cm^-1之间的波长实时连续测量样品混合物的衰减全反射(ATR)红外光谱，以及

e)将测得的红外光谱反馈至计算单元，其中：

-根据红外光谱，计算在酶预处理过程期间与样本混合物中存在的特定物质

相关的信息，其中与样本混合物中存在的特定物质相关的信息为：

·不同特定物质之间的比例，和/或

·一种或多种特定物质的浓度，和/或

·一种或多种特定物质的聚合度；和

-将与样本混合物中存在的特定物质相关的信息反馈至用户和/或连接到罐

的罐控制系统。

在本发明的第二个方面本文公开了一种用于控制酶预处理过程，例如糖化过程的系统。该系统包括适于含有样品混合物的罐，该样品混合物包含待酶预处理的样品和可能在酶预处理过程期间加入到样品中的一种或多种酶。

该系统还包括连接到红外光谱仪的分析单元，该分析单元适于使得样品混合物与红外光谱仪直接接触，用于在酶预处理过程期间测量样品混合物的衰减全反射(ATR)红外光谱。

该系统还包括与红外光谱仪连接的计算单元，该计算单元适于：

·基于样品的红外光谱，计算样品混合物中特定物质之间的比例，和/或

·基于样品的红外光谱，计算一种或多种特定物质的浓度，和/或

·基于样品的红外光谱，计算一种或多种特定物质的聚合度。

通过本发明的第一和第二方面从而得到了一种能够在例如糖化过程期间精确地实时确定存在于溶液中的特定糖分子和糖链的平均长度的方法和系统。还能够同时获得例如溶解的蛋白质和游离氨基酸的浓度的更多信息。

在制备例如用作燃料，溶剂或添加剂的商品级乙醇过程中，在作物发酵之前的预处理是与如上所述的用于生产用于人类消费的饮料或蒸馏酒的糖化过程几乎相同的过程。

用于制备乙醇的发酵过程的原料可包括与如上所述的用于糖化过程的相同的含淀粉作物，但也可包括非食用的作物或农业废弃物。一些非限制性的实例可以是柳树、木材、甘蔗渣或玉米秸秆。在这些类型的农作物，纤维素是糖化合物的重要部分。纤维素是具有与淀粉几乎相同的化学结构的化合物，其中1,4-糖苷键(其将葡萄糖结合在一起)的构象取向稍有不同，产生几乎相等的化学和光谱性质的溶解的纤维素，纤维素低聚物和类似的二聚物纤维二糖。因此，术语“糖化”也应理解为包括对在生产商品级乙醇中用于发酵的含淀粉或木质纤维素原料的类似的酶预处理。

附图说明

图1、2、3a-b和6a示出了集成有红外光谱仪和计算机的糖化单元的的实施方案。

图4和5示出了从外部(图4)和内部(图5)观察的的红外光谱仪。

图6b-d示出了糖化单元的实施方案。

图7a-d示出了提取和/或回收探针的实施方案。

图8a-b示出了分光单元，其中，图8b是分解图。

图9a-c示出了分光光度计和ATR(衰减全反射)单元的特写。

图10a-b示出了分光光度计和ATR单元的特写以及图10c示出了仅与晶体组合的分光光度计的特写。

图11a-b示出了第一实施方案，其中图8a-b的分光单元与罐相连，图11c-d示出了第二实施方案，其中图8a-b的分光单元与罐相连。

图12示出了葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽糊精的红外光谱。

图13显示了糖苷键以及在与葡萄糖的二-和聚合物相关的淀粉中的缩醛基的特征振动，以及在单体葡萄糖类似物中相关的模式。

图14示出了对于葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽糊精的红外光谱，作为每个葡萄糖单元的糖苷键的函数，1026cm^-1处带的积分吸光度。

图15示出了在淀粉糖化过程中测量的红外光谱。

图16示出了在发芽大麦的糖化过程中1260-950cm^-1积分的红外吸收和白利糖度％的关系。

图17示出了糖化过程中经过和不经过滤的相同样品等分的红外光谱。

图18示出了在图17中观察到的这种现象背后的机理。

图19示出了肽键的水解。

图20示出了阿米露(amylo)-淀粉的水解。

图21a示出了在室温下纯异头α-glycosyranose形成外消旋混合物的转化。

图21b中示出了纯的溶解的D-吡喃葡萄糖与α-和β-形式D-吡喃葡萄糖平衡时的外消旋混合物的比较。

图22示出了α-吡喃糖原位转化后的IR光谱。

图23示出了四个不同的碳水化合物的光谱和各光谱的去卷积。

图24示出了图23的几个去卷积的带面积针对获得自DE值的RDP值的曲线，DE值来自可见光谱Cu(II)-Cu(I)-2,2-b喹啉羧酸酯。

图25示出了不同的含α-(1,4)糖苷键的化合物的光谱。

图26示出了校准组的红外光谱。

图27-28示出了图26中光谱的去卷积的带面积和在不同波长下相对聚合度之间的相关性。

图29示出了葡萄糖和麦芽糊精的红外光谱。

图30-33示出了图29中光谱的去卷积的带面积和在不同波长下相对聚合度之间的相关性。

图34示出了不同样品的ATR-IR光谱。

图35示出了在糖化过程期间实时测量的红外光谱的分析。

具体实施方式

本发明使用中红外(MIR)光谱仪。这些仪器在中红外区(其通常定义为400直至4000cm^-1)操作。中红外的吸收使得照射的样品的分子键通过弯曲或拉伸变形振动。各振动类型对应于一个特定波长的红外光的吸收。所有这些振动和中红外光子在各波长的相应吸收的总和产生中红外光谱。

各光子吸收的位置和强度以及相应的振动服从量子力学的规则，并因此可使用不同的近似值和模型可以预测和推理。由于中红外光谱背后的这些机理，在实践中没有振动超过4000cm^-1。此外，对于本发明的目的，感兴趣的光谱部分远低于3600cm^-1。

本发明所用的真正的红外光谱仪经常与近红外光谱仪混淆，它尽管名称类似却有很大的不同。近红外NIR光谱仪在MIR波数之上，通常高达约10000cm^-1，或者在某些光谱仪一路攀升到可见光或紫外线波长操作。在近红外光谱中没有发现主要的“真实”振动，只有实际振动的泛音和组合带。泛音通常被加密并且更难以分析地使用，并且与MIR相比，大多数情况下对于光谱仪本身应用非常不同的技术。

在本发明的以下描述中，术语红外(IR)将专指中红外光谱，并且不应与近红外光谱混淆。对于本发明来说非常重要的是，其仅适用于MIR而不适用于NIR，即两种类型的红外光谱不被混淆。

在先前的工作中，对于MIR以及NIR的实验室环境，使用红外光谱分析与酿造相关的样品的可能性已经被评估(J.Tehnhunen等人，J.Inst Brew.vol100(1994)第11-15页)。本文测量葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的样品，发现特别是ATR-FTIR不适合用于实际的糖化/酿造分析。因此，本文关注NIR和透射FTIR。该工作的结果清楚地表明，NIR在区分它们样品中的组分方面不是有用的，并且误差显著幅度的大于作者试图在样品中鉴定的因子。透射MIR在过程中在技术上不相关，因为在透射池中允许在指纹区域中透射的高毒性窗口材料将溶解在样品液体中。此外，所使用的池具有如此窄的路径长度，使得在技术上不可能在真正的酿造过程中使用。

在US4913914中，提出了一种用于监测“maromi糖化”的方法(用于例如酱油生产)。“Maromi糖化”是使用曲霉和乳酸菌持续数月至大约一年的大豆和大米的长发酵过程。尽管语言相似，“maromi糖化”的发酵过程与本发明中描述的糖化过程非常不同；作为相对快速的酶预处理。该专利描述了使用近红外光谱仪和自动采样器系统来监测麦芽发酵过程；不是真正的在线分析仪。定义的NIR光谱仪工作在完全不同的波长，其中没有发现本发明中描述的任何分子振动。如背景技术中关于MIR和NIR的描述，必须理解MIR和NIR光谱之间的差异。没有提及在本发明中必需的单-，二-和多糖的区分。

DE4002108(A1)公开了淀粉分析中公知的破坏性方法的自动化，其中淀粉螺旋结构可以通过加入碘来识别。然后可以使用NIR-VIS光谱仪定量淀粉酶螺旋和碘之间的紫色复合物。该过程消耗碘，并且样品不能返回到糖化单元。它基本上描述了一种熟知分析的自动化，在与本发明不同的波长间隔中应用VIS-NIR光谱。

WO2009/074650公开了一种方法，其中未发芽的谷物与加入的酶(主要是淀粉酶)组合用作酿造中发芽大麦和发芽谷物的替代物。本发明描述了酿造领域的任何技术人员公知的糖化或酿造的机理，但是没有以任何方面描述如何使用红外光谱来监测该过程。

EP0851027A1公开了使用ATR-FTIR光谱学来控制发酵过程中乳酸菌的方法。该发明描述了如何通过监测乳酸的两种形式(质子化和去质子化)以及如何使用ATR来定量乳酸菌来控制乳酸菌，使得该方法可用于不同的pH值。该方法还描述了如何通过来自葡萄糖的“醇信号”的强度来控制乳酸菌。然而，没有提及单糖和多糖的区分。仅使用ATR-FTIR对葡萄糖进行定量是直接的，本身并不令人惊讶。该方法没有描述用于在线分析的装置或使用ATR-FTIR来控制酶预处理。

本发明包括一种方法，其中实时应用衰减全反射(ATR)红外(IR)光谱以监测酶预处理过程，例如，糖化过程。ATR-IR光谱分析是指测量在400-3500cm^-1之间的IR光谱的光谱分析。与IR光谱的测量同时地，计算机计算溶液(即麦芽浆)中组分的精确组成，并将生物化学关键值返回给操作者或控制系统，这总体上允许更好的控制和优化糖化程序。这些重要的关键值的实例是单糖，二糖和聚合糖化合物之间的比例，溶解的糖的总浓度，以及蛋白质或重要调味化合物的浓度。还可以监测其他参数。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括以下步骤：当获得样品混合物中特定物质之间的预定比例，和/或一种或多种特定物质的浓度达到预定水平，和/或一种或多种特定物质的聚合度达到预定水平时，停止酶预处理过程。酶预处理过程可以由用户手动停止或由系统基于从计算单元提供的信息自动停止。

在一个或多个实施方案中，在至少部分酶预处理过程中搅拌样品混合物。

在一个或多个实施方案中，在酶预处理过程中将水加入到样品混合物中，例如，与可能加入的一种或多种酶一起。

在一个或多个实施方案中，样品和/或样品混合物中的温度在酶预处理过程开始之前，在酶预处理过程期间，和/或出于停止酶预处理过程的目的而增加和/或降低。

在一个或多个实施方案中，酶预处理过程被系统自动打开罐，或者替代地通过从罐中取出样品混合物而停止。此外，可以增加罐中的温度来停止酶预处理。当获得样品混合物中的特定物质之间的预定比例时，和/或当一种或多种特定物质的浓度达到预定水平时，和/或当一种或多种特定种类的聚合达到预定水平时，通常停止酶预处理过程。

在一个或多个实施方案中，样品选自谷物和其他含有淀粉和二糖和多糖的作物中天然存在的碳水化合物，所述谷物和作物例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大米、马铃薯、稻草、木材、淀粉和玉米秸秆。

在一个或多个实施方案中，酶预处理过程是在发酵过程例如酿造之前进行的糖化过程。

在一个或多个实施方案中，将多种酶在同一时间或在不同时间加入到样品混合物中，并且其中在预处理过程中调节样品混合物的温度以计入多种酶各自最有活性的不同的温度水平。

在一个或多个实施方案中，在400-3000cm^-1、400-2000cm^-1、500-1500cm^-1、700-1400cm^-1或800-1300cm^-1的波长下测量红外光谱。

在一个或多个实施方案中，分析单元是适于在酶预处理过程期间在样品混合物的ATR-IR光谱的测量期间包含小部分样品混合物的ATR-IR池，其中ATR-IR池紧密地安装至包括晶体的ATR-IR板，ATR-IR板是ATR-IR光谱仪的一部分，其中紧密安装通过ATR-IR光谱仪上的夹具和定位在ATR-IR板和分析单元之间的O形环来获得。

在一个或多个实施方案中，系统还包括连接罐和分析单元的连接单元，连接单元适于将小部分样品混合物从罐引导到分析单元，由此样品混合物的ATR-IR光谱通过ATR-IR光谱仪测量。

在一个或多个实施方案中，系统包括在罐内突出的提取探针，用于在罐内用户确定的位置处提取用于红外光谱测量的小样品部分。

在一个或多个实施方案中，分析单元是包括ATR-IR单元，用于测量红外光谱的分光光度计和计算机的分光单元，其中ART-IR单元包括具有晶体的ATR-IR板。

在一个或多个实施方案中，分光单元直接附接于罐的壁。

在一个或多个实施方案中，分光单元通过连接装置例如以一组软管的形式连接至罐的壁。

在一个或多个实施方案中，ATR板可绕其自身轴旋转至90度。

图1示出了包括糖化单元100的装置，其中糖化单元100含有溶液102，溶液102含有待糖化的产品和可能的待加入到原料产品中的酶溶液/化合物。在图1所示的实施方案中，使用波导原理106的ATR-FTIR(衰减全反射傅里叶变换红外)探针直接插入到糖化单元100中。收集红外光谱并将其发送到计算机单元110，其对每个红外光谱去卷积。可以从所述光谱中提取对于总糖/淀粉含量的特征的谱带面积以及对聚合糖化合物特定的带。然后使用预先校准曲线，使用相关的谱带面积计算各个聚合糖化合物的浓度以及单体糖和聚合糖化合物之间的比例。还可以同时报告其他值如蛋白质含量和游离氨基酸含量。

糖化单元100还包括搅拌单元104，其可以是如图1所示的螺旋桨或类似物。红外(IR)光谱测量装置200，例如衰减全反射(ATR)红外光谱仪经由光学连接路径106直接耦合到糖化单元100，光学连接路径106例如，包括用于将来自红外光谱仪200的红外光引导到样品102并用于引导来自样品102和至光谱仪200的背反射光的反射镜或类似光学部件的装置。

红外光谱仪200又连接到计算机110或类似的数据处理设备，其实时计算各个糖化合物以及单体糖类化合物和聚合糖化合物之间的比例(可能连同蛋白质和/或游离氨基酸含量)。

在如图2中所示的另一个实施方案中，光纤116光学FTIR探针114被插入到糖化罐100的侧通道108中，在此它连续地收集红外光谱。在该实施方案的变型中，计算机110被集成到光谱仪200的机柜中，其对每个光谱执行多元数据分析，并且直接在光谱仪200上的显示器112上显示相关值。

在类似于图1中所示的实施方案的实施方案中，FTIR光谱仪200配备有直接安装在糖化罐100上的ATR池。以这种方式，产品102被捣碎并且ATR池中的ATR晶体通过罐100中的孔118紧密地相互作用。红外光谱仪200在罐100上的位置可以在罐的侧面或底部，分别如图3a和图3b所示。

阀可用于允许从糖化罐100提取样品102，即麦芽浆。通过使用泵送单元，或者通过糖化单元100内部的压力或重力，可以将样品送至红外光谱仪200，例如傅立叶变换(FT)红外光谱仪，邻近于ATR单元布置。装备有ATR单元的FTIR光谱仪可以测量和记录被捣碎的溶液102的红外光谱。这样的样品提取可以作为连续流动操作，或者可以在糖化过程期间的优选时间处提取样品等分试样。图4和图5中示出了这种使用ATR池和特殊附加分析室的定制ATR单元的具体实施方案。

图4示出了从“外部”看到的红外光谱仪200，图5示出了光谱仪200和其中导入样品的分析室300的“内部”部分视图。红外光谱仪包括其中产生红外光的盒202和ART-IR单元203。入射红外光204经由一组光学部件206，例如反射镜引导到晶体207，用于在分析室300内获得与样品的紧密接触。反射的红外光210同样被引导离开晶体207到达光谱仪200内部的单元，用于分析光谱。

分析室300可例如是可能是附加装置的ATR-IR单元，并且通常通过通常是光谱仪200的集成部分的夹具208固定到光谱仪200。通常通过使用O形环210获得分析室300和光谱仪200之间的紧密密封，其确保液体样品保持在分析室300内部。样品通过连接器入口302被引导到分析室300中，并且再次通过连接器出口304被引导离开。连接器入口302和出口304可以可释放地连接到分析室300。

在一个或多个实施方案中，分析室300由制造商与ATR单元203一起永久构建。在其他实施方案中，ATR单元203，分析室300和光谱仪200都完全集成到一个组合单元中。

在由光谱仪200测量每个红外光谱之后，分析室300中的样品作为废物丢弃或返回到糖化罐100中。

通过定制软件分析红外光谱，其从收集的光谱中提取谱带面积，并将它们转换为相关值，例如糖含量，糖聚合物的平均长度，溶解的蛋白质含量和它的水解度，调味化合物(例如二乙酰基)、酯化合物或苦味化合物等的浓度。

与上述分析室300组合的光谱仪200的优点在于，可以独立于糖化罐100的操作来校准。

在图6a中，示出了罐100可具有位于糖化罐100的内壁处的提取和再循环阀120以及废物罐122，用于通过阀，在测量样品的红外光谱之后处理样品。该装置还可以配备有用于再循环样品102的泵单元124。

在一个或多个实施方案中，提取探针126和/或再循环探针127可以定位成靠近阀120或与其连接，如图6b-6d所示。图7a-d中示出了提取探针126的一些非限制性实例。

在一个或多个实施方案中，当糖化罐200不运行时，可以使用自动清洁系统来清洁分析室300。自动清洁系统可以通过将清洁剂或化学品例如碱、酸或有机溶剂的流泵送通过分析室300，以及用水冲洗来起作用。当糖化罐200不操作运行校准程序时，校准标准品可以进一步自动地泵入分析室300中。

提取探针126中的入口128(以及如图7a所示的可能的出口130)的尺寸设置成允许大颗粒自由流动通过探针126而不堵塞系统。在一个或多个实施方案中，提取探针126装配有过滤器132，以限制对于系统的其余部分而言太大的颗粒。在另一变型中，探针被设计具有可移除的过滤器，使得可以改变模板尺寸。如图7c中所示，也可以省略过滤器。

在一个或多个实施方案中，提取探针126的一部分134延伸到糖化单元100中，以从糖化罐100中的期望位置提取液体样品。提取探针126通常通过容器安装件136连接到罐100。

在一个或多个实施方案中，提取探针126可以用作糖化罐的内壁上的阀(非限制性实例在图7d上示出)。

在图7a-c中以不同形式示出的提取探针126可以从糖化罐100中的不同位置提取样品。这可以通过使用连接到糖化罐100内部的管的一系列阀来完成。在另一个变型中，提取探针126可以使用马达来延伸和改变糖化罐100内部的位置。

如图7a中所示，探针可以包括两个单独的探针：提取探针126和再循环探针127，其中一个用于样品的入口128，一个用于出口130以允许流回糖化罐100。使用应用于系统的泵，可以改变系统中流动的方向，以防止过滤器中的结块。以这种方式，两个单独的探针(提取探针和再循环探针)可以组合到双探针处理入口和出口。

可以使用糖化罐100内的安装件将提取探针126插入到糖化罐100中。糖化罐安装件允许容易地安装和维护探针126。安装件可以利用三夹式连接件来将紧密密封件连接在探针126和糖化罐100之间。

安装密封件还可以通过使用探针126和糖化罐100之间的真空来产生。或者，安装件可以焊接到糖化罐100的壁上。

图8a示出了根据本发明的红外分光单元/分析单元400，图8b以分解图示出了分光单元400。分光单元400包括具有板404的光谱室402，其中安装有晶体407，晶体407必须与介质接触，以使分光单元400执行红外测量。使用红外光谱星座来引导红外光通过晶体407。在图8a-b中所示的实施方案中，这通过使用具有分光光度计406的分光单元400和由反射镜或光学器件组成的ATR-IR单元403来完成，镜或光学器件将来自分光光度计406中的发射器的光引导通过晶体407并返回到分光光度计406中的接收器中。

发射器可以通过引导光学器件和/或反射镜或光纤从外部光源接收红外光。或者，分光光度计406可以含有在分光光度计406内发射红外光的二极管阵列。接收器可以同样将背反射光引导到外部光谱仪，或者本身包含二极管接收器。

在一个实施方案中，晶体407将仅使光通过介质反射一次(单次反射)，如图10a中所示，而在另一个实施方案中，晶体407将引起通过介质的多次反射(多次反射)，如图10b中所示。

在另一个实施方案中，忽略ATR单元406，并且发射器和接收器成角度朝向晶体407，产生到和来自晶体407的直接路径，如图10c中所示。

在另一个实施方案中，接收器由光传感器和过滤器代替。

分光单元400还包括连接到分光光度计406的计算机408，用于在将数据发送回用户或中央控制系统(例如，连接至罐的罐控制系统)之前执行必要的数据处理。计算机408可以连接到用于无线通信的天线410。作为替代或作为补充，计算机408可以连接到用于与用户直接接口的显示器409。分光单元400还包括盖411。

为了在介质上进行光谱测量，光谱晶体407必须与介质接触。这可以例如是在线测量，其中分光单元400直接安装在罐，容器或管道上。

图11a-b示出了包括罐，例如糖化单元100的直列系统的实施方案，其中红外分光单元400直接附接到糖化单元100的侧面。分光单元400使用密封安装单元401安装到糖化罐100，以使晶体407与介质保持接触，同时防止任何泄漏。密封安装单元401包括罐安装件412，用于紧固分光单元400和罐安装部件412之间的连接的夹具416以及用于密封分光单元400和罐安装件412之间的连接的密封件414。

如图11a中所示，安装件412可以放置在容器/罐100的侧面上，在容器/罐100的底部或顶部上。

当分光单元400不使用时，当样品残留物留在晶体407上时，残留物固化，并且在新测量之前必须清洁ATR单元403。在图9a-c中所示的实施方案中，其中嵌入晶体407的表面倾斜以允许样品从晶体407排出。在图9a-c中，相比于图9a在图9b中示出了45度倾斜，并且在图9c中示出了90度倾斜。

在一个实施方案中，整个分光单元被排空以允许排水。在另一实施方案中，在光谱仪和ATR单元之间实现倾斜基座，允许ATR单元沿着红外光束的轴倾斜。在一个实施方案中，倾斜基座是可调节的以倾斜到期望的程度。在一个实施方案中，倾斜基座是机动的，从而允许其在测量之间额外地倾斜。

保持晶体407与介质接触的另一种方法是使用在线装置，如图11c-d中所示。在该实施方案中，分光单元400安装到泵送单元500并且经由软管602连接到安装在罐100上的过滤单元。两个软管602可以由管替换。

过滤单元600可以是简单的过滤网。或者，如图11a-b中所示，过滤单元600可以由罐安装件412代替。再或者，过滤单元600可以由到达罐或容器100中的探针组成。

泵送单元500包括具有壳体501的蠕动泵系统，马达502，利用介质位移来将介质移动到容器100或移动离开容器100的泵头504，以及用于引导介质通过晶体407的流动池506。流动单元506连接到泵504以确保穿过晶体407的表面的适当流动。泵送单元500还包括密封件414和夹具416，用于获得分光单元400和泵送单元500之间的紧密密封。

在一个实施方案中，泵送单元500被放置在地板上。在另一个实施方案中，泵送单元500安装到壁或容器本身。

本发明可以通过以下非限制性实施例解释：

实施例1

制备分别为5％w/w的葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖和麦芽糖糊精的水溶液，并记录所有溶液的红外光谱。这些光谱可以在图12中找到。图12中的底线示出了用于比较的纯水的光谱。红外光谱源自每种化合物中的振动模式。在化学上几乎相同的四种化合物的红外光谱的相对大的变化显示变化主要源自聚合的1,4-糖苷键。图23和25进一步示出了如图12中所示的相同物质的测量。

糖苷键本身具有特征性的反对称C-O-C拉伸模式，其在约1160cm^-1处给出谱带。然而，由于葡萄糖中C4-O伸缩和聚合物上的末端C4-OH基团的重叠，不适合区分单体和聚合物质。

然而，作为糖苷键结果的缩醛基团，在通过解聚时在1026cm^-1处的谱带的强度显着降低所观察到的光谱中诱导更大的差异-参见图13中的该过程的说明。因此，1026cm^-1谱带的消失是解聚的良好指示器。

像其他形式的透射光谱，Lambert Beers定律适用于ATR-FTIR光谱，定律解读：

A＝ε*l_穿透*c[1]

其中A是吸收，ε是消光系数，l_穿透是红外光束的穿透深度，c是引起吸收的化合物的浓度。

当对于具有相似折射率的样品使用ATR-FTIR时，穿透深度是恒定的，这意味着每个谱带的高度或面积与引起谱带的化合物的浓度成比例。

缩醛基团的特征振动对于聚合物谱带是如此特征，其可用于精确量化不同糖长度的混合物中每个葡萄糖单元的总糖苷谱带。测量吸收的一种方法可以是从每个光谱中减去纯水的光谱并读取在约1020-1030cm^-1处的峰高，其中可观察到来自缩醛基团的振动。然而，由于与相邻谱带的重叠，多元数据分析将显著提高方法的准确性。

因此，使用高斯去卷积提取1026cm^-1谱段的面积。作为替代，也已经可以使用多元数据分析的变型。对于图12所示的四个光谱，显示作为每个葡萄糖单元的糖苷键的函数的在1026cm^-1处的积分吸光度的结果绘制在图14中。图14清楚地表明该方法如何精确地区分和识别糖苷键，即使在低浓度。

实施例2

制备3.5％w/w粉末状淀粉在水中的浆液，并加热至90℃保持5分钟，得到均匀的凝胶状溶液。然后将溶液注入直接连接在ATR板顶部的5mL容器中，以ATR晶体和溶液紧密接触的方式设计容器。然后在室温下通过外部搅拌装置搅拌溶液，同时连续记录光谱。为了模拟糖化过程，将α-淀粉酶的溶液加入到溶液中。此后，由于较短链淀粉分子的更好的溶解性，来自糖化合物的总吸收增加，但是强度在几分钟内稳定。在1200-900cm^-1区域中的光谱开始显着变化，并且1030-1020谱带的谱带强度随时间显着降低，表明淀粉解聚，参见图15的光谱，其中黑线表示早期时间，灰线表示随着线变得越来越灰的越来越长的时间之后的光谱。图15中的底部虚线示出了用于比较的纯水的光谱。

约30分钟后，光谱中没有进一步的变化，表明酶过程几乎停止。比较所述光谱(浅灰色)与图12中麦芽糖和麦芽三糖的光谱，清楚的是溶液现在由麦芽糖和麦芽三糖的混合物组成。

实施例3

将从大麦提取的0.1g蛋白质与1克水混合，并在60℃温和加热15分钟。将所得浆液在ATR-FTIR单元顶部的小容器中搅拌。这允许浆料和ATR单元的金刚石之间的紧密接触，同时连续记录IR光谱。该光谱显示分别为1690cm^-1和1550cm^-1的酰胺基团的特征吸收(略微重叠)，C＝O伸缩谱带和N-H弯曲谱带。一段时间后，将含有蛋白酶的0.1mL溶液注入容器中。酶注射后，在1690cm^-1的谱带向上移动到约1705cm^-1。虽然1690cm^-1处的谱带是蛋白质组中肽键处的羰基伸缩的特征，但是1705cm^-1谱带是游离氨基酸二聚体或短蛋白片段中相应的终止氨基酸基团的特征。1690和1705cm^-1谱带的单个面积可以使用光谱的去卷积清楚地确定，并且用于计算整个蛋白酶处理中的动态比(溶解的蛋白质)/(游离氨基酸)。

实施例4

将60kg粗磨发芽大麦和200L水装入配有用于加热的锅炉单元和机械搅拌装置的250L不锈钢容器中。在罐的底部，连接有电子控制阀用于样品提取。在阀门是粗过滤器之前，防止较大的颗粒通过阀门。在操作期间，阀打开，使得蠕动泵可以通过阀从罐中提取样品。

将样品液体泵送到附接在金门金刚石ATR单元顶部的室中(参见图4-5的图)。以30秒间隔不断记录红外光谱。最初将大麦加热至37℃并在该温度下保持20分钟。然后将麦芽浆加热至60℃保持20分钟，然后至65℃保持40分钟。

首先，来自糖的总信号由于从麦芽溶解到麦芽浆中而增加，但是在升高的温度下，1030-1020cm^-1区域中的谱带的强度的面积开始显著降低。光谱实时记录的同时，对光谱去卷积，并且基于去卷积光谱中的特征谱带的面积和预先获得的校准曲线，获得可发酵糖和麦芽糖糊精之间的比例。当麦芽浆含有可发酵糖之间的优选比例时，将温度快速升至75℃，使淀粉酶变性，从而在最佳组成时停止糖化。

实施例5

反应器装载有1000kg来自马铃薯的皮和2000L的水。然后将所得混合物加热至100℃保持10分钟，并冷却至50℃。在该温度下，在罐的底部和顶部打开阀，并且使混合物循环通过反应器中的侧通道108，产生类似于图2中所示的环。

在其他探针中，基于纤维的ATR-FTIR金刚石探针位于该侧通道中。探针连接到相邻的FTIR单元，其在此时开始记录通过侧通道的液体的光谱。将温度保持在50℃，将商业级直链淀粉粉末加入反应器/糖化罐100中。

最初，光谱显示淀粉和长链麦芽糖糊精的特征。但是在一小时的过程中，1020-1030cm^-1区域的强度增加，而观察到在1200-900cm^-1区域的其余部分上的一般信号增加。

光谱变化表明马铃薯淀粉被水解，而溶液中的糖化合物由于短链淀粉衍生化合物相对于长链淀粉化合物的较高溶解度而增加。与光谱的实时记录同时，每个光谱去卷积。使用1160-900cm^-1区域中的所有谱带的强度来计算溶液中淀粉衍生化合物的总浓度。使用1030-1020cm^-1的谱带来计算平均解聚度。一旦达到最佳组成，将反应器的内容物进一步泵送到发酵单元上。

实施例6

在生产第二代生物乙醇燃料添加剂的设备上，含有粉碎的秸秆和玉米秸秆的原料最初在升高的温度和压力下用稀硫酸溶液预处理。在该处理期间，浆料被冷却，结晶纤维素纤维全部转化为无定形纤维素。提取无定形木质纤维素，洗涤，并加入含有缓冲剂的水。然后加入粉末状商业级纤维素酶，并调节温度并保持在约50℃。

通过分析浆料的液体部分来监测该过程，该液体部分被送到与糖化单元100相邻的定制的ATR-FTIR仪器200,300。通过过滤最大颗粒以连续提取样品以防止堵塞。将过滤的浆料转移到FTIR仪器的ATR单元上的特别设计的室中。

对于糖化的第一操作时期，信号在1200-900cm^-1区域显著增加，表明纤维素低聚物从浆料中的无定形木质纤维素颗粒中溶解。随后，该区域中的信号开始稳定，同时由于低聚物水解成葡萄糖，观察到1020-1030cm^-1区域的显著降低。当1020-1030cm^-1区域中的变化/每分钟低于某一阈值极限值时，反馈触发消息自动从ATR-FTIR分析器发送到过程控制系统。在该阈值下，酶活性降低，并且浆料主要由木质素颗粒和葡萄糖以及少部分纤维二糖和三糖和更高链长的低聚物组成。发送到过程控制系统的触发消息激活具有过滤单元的泵，并且将滤液泵送到发酵单元中。

实施例7

通过在磁力搅拌期间在锥形烧瓶中在54℃下将225g研磨的发芽大麦与1L水混合来进行微量调浆。通过加入0.25g柠檬酸调节pH。温度在54℃保持15分钟。然后将温度升至65℃保持1小时，最后至75℃保持25分钟。在所有三个温度步骤期间，在糖化期间使用移液管提取几mL的等分试样，并转移到沸水浴上的试管中保持5分钟以确保酶的变性。然后通过离心除去沉淀，并获得剩余的澄清液相的ATR-IR光谱，并且使用折射计测定折射率(以白利糖度％计)。白利糖度标度通常用于食品和酿造工业中，并且是描述折射率的方便方式，因此它们直接与溶液中溶解的碳水化合物的总量相关。

使用Thermofisher OMNIC软件假设折射率为1.36对所有光谱进行ATR校准，并且从麦芽浆的每个光谱中减去纯水的光谱。然后测定950cm^-1至1260cm-1的积分吸光度，并绘制为相同样品的白利糖度％值的函数。曲线如图16中所示。

两者之间的关系表明，差值中的求和的积分红外吸收显示与糖化过程中溶解的碳水化合物的总量非常精确的关系。因此，可以使用ATR-IR光谱实时精确监测糖化过程中溶解的碳水化合物的总量。

实施例8

在文献中，已经描述了糖化的颗粒将在ATR-IR光谱的应用中引起问题，因为淀粉颗粒和壳颗粒将影响溶液相的光谱。这似乎是在本领域的技术科学家的一个普遍的看法。

虽然观察到在实验的非常早期时间部分是真实的，其中一些超小淀粉颗粒确实似乎对光谱有微小贡献，但是这对本发明几乎没有技术影响。因为固态颗粒仅在实验的非常早期时间才发现影响监测；即在糖化的感兴趣阶段(在最初几分钟之后)过程中，颗粒没有影响。

在实验室中，进行根据前述实施例7中的程序的糖化。在糖化过程中约20分钟，将约2mL的样品转移到冰浴中的试管中以猝灭酶水解反应。由于细淀粉颗粒和细的壳颗粒，此时样品非常浆状并且显示乳状和不透明。然后将一些微黄色浆料用移液管转移到具有金刚石ATR装置的FTIR-光谱仪，并记录红外光谱，同时使用移液管使样品恒定保持运动，即使用移液管搅拌。获取静态样品的光谱而不使其保持运动。最后，用湿润组织彻底清洁晶体，并将一些更多的相同样品转移到ATR晶体。

最后一次使用装备有0.22μm注射器过滤器的注射器将样品转移到ATR晶体。该澄清液体的光谱与浆料样品的先前光谱相同，表明麦芽浆中的颗粒不影响记录的光谱。比较在图17中显示在糖化过程中在有和没有过滤的情况下相同的样品等分试样的三个光谱。在未过滤的样品的情况下，研究在记录时搅拌样品的效果。

图18中的图示示出了在图17中观察到的现象背后的机理。只要浆料中的颗粒显著大于消散波的穿透深度，它们对记录光谱的贡献可以忽略不计。也就是说记录的光谱实际上不依赖于颗粒，并且只记录浆料的溶剂化部分。聚焦的消散波将仅穿透非常薄的液体膜。消散波的穿透深度小于浆料中典型的淀粉颗粒和壳颗粒的尺寸，实践中从光谱中排除颗粒，并获得纯液体的光谱。

实施例9

基于指纹区域模型中的红外光谱的化学计量模型必须依赖于所有可能的细节来以合理的精度区分非常相似的化合物，特别是关于本发明，其中生物分子的结构的小变化必须使用ATR-FTIR量化。首先，自然值得考虑由于主要结构变化的光谱变化。在生物聚合物的酶水解中，这将是与聚合物键的断裂直接相关的变化。这里，直接光谱变化将分别与蛋白质中的肽键或碳水化合物中的糖苷键的主基团谱带的消失相关。

然而，由于次要结构的新光谱特征考虑可能是至关重要的。次要结构变化在这里应理解为作为主要结构变化的间接结果而发生或变得可能的变化，例如在糖化过程中糖苷或肽键的断裂。

该实施例显示了本发明如何依赖于较通常仅仅依赖盲统计分析的基于光谱的化学计量学中通常使用的更为复杂的方法。在这种方法中，重要的是：1)识别，2)理解，然后3)合理地量化和利用次要结构变化突然变得可能或由主要酶过程间接诱导。例如，肽键的断裂将不仅导致肽键的特征振动模式的损失，而且导致胺基团和羧酸两者的产生。

在这种情况下，最重要的鉴别器很可能是这些次要的变化。在该实施例中，特别地，由于对称性的显著变化，特别是如果产物是离子的，则显著不同的模式的出现至少与主要结构变化一样有用。这在图19中示出，显示了肽键的水解允许形成几种新物质，具有非常不同的对称和光谱性质。然而，新的所示光谱特征的单边统计使用将需要非常大的校准集。但是进一步使这种方法在技术意义上非常有限的是，其仅在非常窄的pH范围内有效。下面提出的方法应用定性解释以及量化和结果在预测中更丰富和多样的模型。

如图20中所示，阿米露-淀粉的水解促进次要结构改变，因为还原末端不会保留在α-吡喃糖形式中，而是与β形式进行平衡。在水溶液中，D-葡萄糖作为α-和β-吡喃葡萄糖形式之间的平衡存在，比例分别为约34％:66％。这种平衡是非常动态的，并且这两种形式可以通过变旋互换。

在原始直链淀粉片段形式中，所有异头C-O基团都是α-构型(参见(a)中的虚线圆圈)。在水解过程中，形成“还原端”。在还原端，碳水化合物可以转化为β异头物，其比α-异头物稍微更稳定。对于也可以进行变旋光的二糖、三糖、低糖和多糖的还原端也是如此。

在α-和β-吡喃葡萄糖的光谱特征之间存在显着差异，如图21a和图21b中所示。

图21a示出了在室温下纯异头α-glycosyranose形成外消旋混合物的转化。虚线显示纯α-形式。光谱中的较浅色调对应于实验中的较早时间戳，而较暗色调对应于较晚时间戳。

图21b中示出了纯的溶解的D-吡喃葡萄糖与α和β-形式D-吡喃葡萄糖平衡时的外消旋混合物的比较。

通过在水中快速溶解12.5w/v的纯结晶α-D-吡喃葡萄糖(Sigma-Aldrich)获得光谱，并使用锗ATR池在室温下连续记录溶液的光谱90分钟(第一记录的光谱从混合开始小于1分钟)。然后盖住样品以避免蒸发。在实验期间，可以原位观察到纯α-D-吡喃葡萄糖形式的葡萄糖到α和β形式的混合物的变化。90分钟后，没有观察到光谱特征的变化，因此α和β形式已经达到平衡。

光谱与存储超过24小时的样品相同。两个有意义的光谱处理是1080cm^-1谱带的强度在β形式中非常强，而1055cm^-1和1150cm^-1谱带在α-形式中强得多。由于指纹区域中的红外活动模式在大多数情况下具有非常复杂且混合的起源，每个包括与多种CO伸缩模式组合的若干OH和CH弯曲模式，单个CO基团的重新取向可以获得几种变化的光谱模式。

除了测量糖苷键本身的基团振动之外，这也是水解的良好量度，因为其允许定量“还原端”的浓度。

然而，实时使用β形式的光谱特征作为水解的量度，将需要变旋速率显著快于淀粉水解速率。如果异头物平衡中的动力学比水解速率慢，这将使得该方法的实时化学计量建模非常具有挑战性。

如图20中所示，平衡时的动力学在室温下相对较慢。通常对于本领域技术人员来说，的确不可能对平衡与水解的动力学如何处于提高的和更实际的过程温度进行最终判断。

因此，在60℃下进行原位变旋，这对于大多数酶水解过程，例如发芽谷物的糖化更典型，因为该温度接近淀粉的凝胶化温度。加热通过放置在锗ATR装置顶部的可以维持等温条件的自制电加热装置引入。通过非常接近锗晶体的热电偶进一步监测温度。然后将α-D-吡喃葡萄糖与水在室温下混合，然后迅速转移到加热块覆盖的60℃热锗晶体，同时连续记录红外光谱。红外光谱示于图22中，显示了α-吡喃葡萄糖，即在60℃下α和β形式的外消旋混合物的原位转化。虚线是在t＝0时纯α形式的光谱。光谱中的较浅色调对应于实验中较早的时间戳，而较暗的色调对应于较晚的时间戳。

实验清楚地表明，在典型的糖化条件下动力学非常快，并且与在较短的低聚糖链中增加量的β-吡喃葡萄糖形式相关的谱带是淀粉总体水解的良好替代测量。

该实验在α-吡喃葡萄糖溶解之前在有和没有向水中加入0.25w/v％柠檬酸的情况下进行，并且观察到变旋速率不依赖于少量柠檬酸的存在。该实施例清楚地证明了在水解期间这种意想不到的和间接光谱处理的重要性。类似地，这将适用于相关系统。一个实例是在纤维素(β-(聚-(1,4)-吡喃葡萄糖)水解的情况下，其中由于上述机理，水解形式将导致更高量的α-吡喃葡萄糖。

实施例10

各种类型的麦芽糖糊精可商购获得，其特征在于它们在葡萄糖当量(DE)中的还原能力。DE值通过将Cu(II)还原为Cu(I)的糖能力来测量，并且是测量碳水化合物的DE值的工业标准方法。其中纯葡萄糖定义为DE＝100，而麦芽糖和麦芽三糖例如分别具有50和33的DE值，平均聚合度(ADP)8的麦芽糖糊精将具有如下的DE值：

DE＝1/8＝12.5[2]

对于淀粉衍生的低聚糖，平均聚合度是互逆的DE值。

DE＝1/(ADP) [3]

还原是在大量过剩的Cu(II)中进行的。由于Cu(II)比浅淡蓝绿色Cu(I)着色多，所以测定还原后Cu(I)浓度的传统方法是Lane-Eynon滴定或通过重量分析法，其均是相当费力的方法。此外，这些方法本质上不可能实时进行。

这里适用了更新的和完善的方法，当添加2,2-b喹啉羧酸阴离子时，其允许Cu(I)浓度作为强紫色复合物比色测定。此外，通过在105℃下加热所有糖1至2小时，通过重量分析法测定所有麦芽糖糊精的水分含量，并且相对于麦芽糖糊精的干部分计算DE和ADP值。

发现使用这种良好建立的正交技术是一种验证由本发明应用的方法的准确性的好方法。根据已知技术(Zhang，Y.-H.P.；Lynd，L.R.Biomacromolecules2005,6,1510-1515。)制备试剂。在75℃的反应时间从30分钟增加到恰好60分钟。对于每种碳水化合物使用5种不同的稀释度，并且通过在560nm处的吸光度测量2,2-喹啉羧酸酯-Cu(I)复合物的浓度。通过与葡萄糖标准比较，通过线性回归的斜率确定DE值，所有R²值大于0.999。DE值在表1中给出。

表1商业淀粉水解产物的ADP值通过使用相对于葡萄糖标准的Cu(II)的糖还原能力的比色测定获得。

由于ATR-IR光谱是进行透射红外光谱的方法，并且由于在某一波长处的穿透深度对于具有相似折射率的样品将总是恒定的，所以如式1中所示的Lambert Beers定律是直接适用的。

为了进一步使得在糖化期间所有浓度底物浓度的ADP值的分析是通用的，引入表示相对聚合度(RDP)的术语。在合成或生物聚合物的一般情况下，RDP将是：

RDP＝n_聚合物键/n_{总单体单元}[4]

在特殊情况下，来自淀粉的水解产物或纤维素RDP定义为：

RDP＝n_葡糖苷键/n_{总葡萄糖单元}＝(n_{总葡萄糖单元}-1)/n_{总葡萄糖单元}[5]

例如，单体将具有等于零的RDP值，二聚体将具有0.5的值，而七聚体具有6/7，依此类推。通过引入RDP的概念，创建通用校准以确定平均聚合度，而不考虑绝对碳水化合物浓度成为可能。

制备15重量％碳水化合物的溶液，每种碳水化合物在表1中示出。使用45°金刚石ATR装置记录图23中所示的所有样品的光谱。用于对光谱去卷积的模型在光谱中指示。

图23中的所有光谱以以下方式分析：将光谱进行ATR校准以近似相应的真实透射光谱，然后从每个光谱中减去水的背景。最后，使用包括pseudo-voigt函数的模型对每个经ATR校准的差光谱去卷积。在去卷积期间，分布曲线的位置和带宽受到约束，并且仅优化振幅，以确保谱带在去卷积期间不随机迁移。为了适应由于谱带的轻微移动而产生的一些弹性，在一些情况下，一些谱带被分成具有彼此非常接近的位置的两个谱带。例如，在1080和1152cm^-1附近的谱带分别由1078+1081cm^-1和1148+1154cm^-1处的谱带的总和表示。每个所获得的谱带面积通过除以来自去卷积的所有谱带的和而标准化。除以总面积等于用总溶解的碳水化合物浓度进行标准化。这显然是非常好的近似，如实施例8中所证明的，清楚地显示总溶解的碳水化合物浓度与所有这些谱带的积分面积成比例。

通过绘制若干去卷积带面积对从如图24所示的Vis光谱Cu(II)-Cu(I)-2,2-喹啉-羧酸酯的DE值获得的RDP值，显示通过应用新方法，可以从IR实时获得相同的值，而不必加入试剂。这在方法的简单性和易于实施的方面以及在成本方面都是巨大的优点。

图24显示了来自图23中所示的四个光谱的去卷积的积分谱带面积，显示了与碳水化合物的RDP值非常好的统计学相关性。

实施例8表明红外光谱可用于建立糖化期间溶解的碳水化合物的总量的良好值。除此之外，本实施例10表明本发明可用于精确测定总溶解的糖的平均聚合度，其是不能通过任何其它方法快速获得的值。

实施例11

如上文实施例10中所讨论的，麦芽糖糊精通常通过其DE值来表征。然而，单独的DE值不能完全描述麦芽糖糊精，因为α-(1-4)和α-(1-6)糖苷键的比例可以独立于DE值而变化。例如校准研究中使用的麦芽糖糊精必须具有α-(1-4)和α-(1-6)糖苷键的现实分布。淀粉主要由与α-(1-4)糖苷键连接的葡萄糖组成，这使得大多数葡萄糖苷键为α-(1-4)型。然而，特别是淀粉的支链淀粉部分由于较小量的α-(1-6)糖苷键而支化。由于这种分支，典型淀粉中大约5％的糖苷键是α-(1-6)，而其余的是α-(1-4)。由于大多数淀粉酶只能水解α-(1-4)糖苷，淀粉中的大部分天然α-(1-6)-糖苷键在水解过程中保持完整，因为它们对大多数淀粉酶攻击更耐受。因此，在大多数淀粉的最终水解中α-(1-6)糖苷键残基的量对未水解的低聚糖的糖苷键有显著贡献，并且从光谱的观点不能忽略。

因此，使用异麦芽三糖(α-D-吡喃葡萄糖-(1,6)-α-D-吡喃葡萄糖-(1,6)-D-葡萄糖，Sigma-Aldrich)的溶液作为α-1,6-糖苷键的纯光谱特征的参照。此外，商业和食品批准的α-(1,6)-葡萄糖-低聚糖VitaFiber购自不同的分销商。虽然Vitafiber主要由α-(1,6)-葡萄糖-低聚糖和较小部分的混合α-(1,6)/α-(1,4)葡萄糖-低聚糖组成。然后将这两种α-(1,6)糖苷化合物与商业麦芽糖糊精(ADP＝5,54，sigma)和纯麦芽三糖进行比较。

图25显示异麦芽三糖，VitaFiber低聚糖，SigmaAldrich麦芽糖糊精，麦芽三糖和水的12.5w/v％溶液的光谱。在约1000-1030cm^-1处的吸收的差异显示α-(1,4)和α-(1,6)糖苷键的光谱特征之间的显著不同。

很显然，分离的α-(1,6)键是完全不同的，α-(1,4)-麦芽三糖和异麦芽三糖显示出显著的差异。特别是在约1025cm^-1处，缩醛振动模式的吸收在α-(1,6)异构体中显著更强。此外，反对称糖苷C-O-C伸缩模式的1155cm^-1模式稍微移动到约1160cm^-1。

发现Vitafiber和短的商业麦芽糖糊精都存在于两种纯样品(异麦芽三糖和麦芽三糖)之间，表明它们都含有显著量的两种类型的糖苷键。特别是由于麦芽糖糊精通过天然淀粉的部分水解制备，因此它是在真实糖化过程中麦芽糖糊精开发的非常现实的模型。因此，得出结论，从Sigma-Aldrich购买的低ADP麦芽糖糊精将作为具有α-(1,6)/α-(1,4)糖苷键的现实比例的现实模型。此外，该实施例表明，在正确的情况下，本发明能够区分和定量混合物中不同类型的糖苷。特别考虑到实施例9，结合去卷积和/或统计分析，上述结果可用于构建多元化模型，其在糖化过程期间可以实时区分和定量除了ADP值之外的糖苷键的类型。

实施例12

在过去的50年期间，在聚合碳水化合物中糖苷振动的确切位置已经被大大地讨论。多年来，基于论点和指标提出了几个争议，关于在何处定位糖苷键的特征频率，没有来自实验的任何坚实证据。因此，显然不可能对碳水化合物的红外光谱的指纹区域进行深入分析，甚至对于同时是光谱学和化学领域的技术人员也是如此。这对于与聚合度相关的特征尤其如此。

文献中的先前实例未能使用诸如偏最小二乘(PLS)分析的统计分析，以基于实验红外数据区分相似的二糖和三糖如麦芽糖和麦芽三糖。当以前的研究的其他公认的统计技术，以区分非常简单的碳水化合物的混合物，已经失败时，产生了不可能使用红外以区分糖类型和它们的聚合程度的假设。

从电子结构可以计算分子的量子力学一般模式，以及作为一般模式的函数的振荡偶极子的良好估计。这意味着可以从电子结构产生非常现实的红外光谱。这允许对实验光谱的更多合格的解释，因为实验光谱中的每个谱带可以用量子机械充分描述的正常模式分配。

使用对葡萄糖，麦芽糖和麦芽四糖的密度泛函理论，对直链淀粉的一般模式进行量子力学研究。首先，通过使用B3LYP功能和使用市售软件包的6-31G(d)基组来最小化每种碳水化合物的电子结构的能量。然后计算红外光谱，并且根据文献中的常规实践，以0.98的比例因子对所计算的光谱进行协调校准。

理论光谱与实验谱带良好一致，并揭示了糖苷键涉及几种特征振动模式。在1155cm^-1处的中强谱带归属于糖苷谱带的反对称C-O-C振动。尽管葡萄糖和非还原性端在相同区域也具有吸收，由但是于C4-O伸缩，这些振动发生在稍低的波数和显著更低的强度处。在约1035-1000cm^-1处的强谱带可以与包括在吡喃糖环的缩醛基周围的O-C-O伸缩模式的强振动的模式相关。α-(1,4)糖苷键产生中等强的吸收，而在α-(1,6)糖苷键的情况下的类似模式具有甚至更强的吸收，这再次解释了如图25中所示的对于麦芽三糖和异麦芽三糖所呈现的光谱的差异。

实施例13

制备三种茎溶液：15％w/v葡萄糖(无水，含水量<1％)，麦芽糖(相对于麦芽糖一水合物的质量为15％w/v，Sigma Aldrich)和麦芽糖糊精(ADP＝5.54，购自Sigma-Aldrich)。然后通过用高精度自动移液管混合，制备根据表2的这些的混合物。使用水平10反射锗45°ATR单元和Nicolet iS5光谱仪记录21个校准标准中的每一个的FTIR光谱。对于所有样品，使用1.36的折射率对所有光谱进行ATR校准。所有21个样品的去卷积分析类似于实施例10中所述的方法进行，但使用稍微调整的参数。此外，用于生成差谱的水背景是通过更高次多项式的解析近似。此外，通过分析来自碳水化合物特征的总吸收较低的较高和较低波长处的几个吸收，应用校准来自漂移的光谱的算法。

表2

在实施例10中，显示IR可以确定纯二糖和低聚糖的ADP值。然而，在大多数糖化的技术情况下，ADP值的差异要小得多。

在图27和28中，10个谱带或谱带面积的组合以混合物的RDP的函数表述。

图27-28示出了图26中光谱的去卷积的带面积和在不同波长下相对聚合度之间的相关性。不同的回归图比较了去除了分别含有葡萄糖或麦芽糖糊精的样品的全数据集。

选择所给出的图，因为它们都显示与RDP值的公平到良好的相关性，而仅显示非常差的统计相关性的图没有显示。特别是对于显示RDP和1078+1081cm^-1，1110cm^-1和1078+1081+1110+1130cm^-1总和谱带面积之间的相关性的曲线图分别都显示非常好的相关性；所有的R²值接近或高于0.98。这些谱带在实施例9中显示与对α或β-D-吡喃葡萄糖-主链特异性的C-O伸缩+OH/CH弯曲相关。在这种情况下，这些谱带似乎是通用描述符的总体优选，以确定在某一时间的糖化期间的RDP，而不考虑具体的碳水化合物组成。在该实施例中，1036cm^-1处的谱带也表现出与RDP非常好的相关性，但稍后将显示，这仅在特定情况下是真实的。稍后将示出如何利用1036cm^-1谱带来提供关于样品组成的另外的化合物特定信息。

数据集的不同部分用于统计分析，以与RPD值的特定化合物相关性进行比较。RDP和上述谱带(1078+1081cm^-1，1110cm^-1，1078+1081+1110+1130cm^-1和1036cm^-1)之间的相关性在包括在数据集中的样品的变化方面没有显示出显著的变化。这进一步表明，在葡萄糖，麦芽糖和麦芽糖糊精的混合物的情况下，它们是RDP的良好通用描述符，而不考虑具体的样品组成如何。

然而，它大大增加了本发明的有用性，上述普遍趋势不适用于所有积分谱带和RDP相关性。对于1003cm^-1，1022cm^-1谱带的RDP和谱带面积的相关性以及两者的和的情况，与上述谱带(1078+1081cm-1，1110cm-1，1078+1081+1110+1130cm-1和1036cm-1)相比，整体相关性首先似乎较差并且噪杂。

然而，当只有部分数据集被考虑到时，图片是非常不同的。特别是在回归之前所有含有葡萄糖的样品被除去的情况下，相关性变得明显更好(R²从0.85增加到约0.975)，并且描述相关性的方程以显着不同的斜率变化。类似地，当除去含有麦芽糖糊精的所有样品时，相关性提高。这清楚地表明，这些谱带的数据的表观分散不是噪声。这些谱带在某种程度上与总体RDP相关之外，非常依赖于样品的特定碳水化合物组成。从这个表示的分析，显然这些谱带在含淀粉原料的糖化过程中的多元校准中发挥特殊作用，其中除裸平均聚合度之外，它在葡萄糖浓度的估计中似乎特别强大。

在多元校准中利用嵌入在1003cm^-1和1022cm^-1谱段中的化合物特定信息的实例可以是比较用1003-1022cm^-1谱段和上述使用的1078-1130cm^-1谱段获得的RDP值的差异：1078-1130cm^-1谱带似乎在其淀粉糖化中的RDP值的可预测性方面更加通用。

虽然葡萄糖和麦芽糖都是可发酵的糖，但是葡萄糖以高浓度(总碳水化合物的10-30％)存在于最终麦芽浆中，并且通常是麦芽糖之后麦芽浆中第二丰富的碳水化合物。在不存在大量的麦芽糖糊精情况下，低葡萄糖与麦芽糖的比例将导致相对高的RDP值，而反之亦然。因此，能够估计混合物中的葡萄糖浓度的多元建模的上述原理在糖化过程中，特别是在酿造工业中具有很大的技术重要性。RDP的精确值以及葡萄糖浓度的良好估计将有助于糖化期间实际发酵度的实时计算，这对于酿造者具有很大的技术价值。

最后，将所有样品分别稀释至11％w/v和7％w/v，所有样品以其稀释状态记录。以与上述相同的方式处理数据，并且发现统计与上述呈现的相关性接近相同，这表明RDP校准方法确实提供了浓度独立校准。

实施例14

前面的实施例13显示了本发明如何能够给出RDP值以及葡萄糖浓度的估计，其可以用于估计发酵度。相关的挑战来自出现麦芽三糖，从光谱的角度来看，与麦芽糖相似。在大多数基于淀粉的原料的糖化过程中，显著量的麦芽三糖作为副产物产生(高达总碳水化合物的5-20％)。特别是在酿造工业的糖化过程的情况下，估计麦芽三糖的浓度将具有很大的技术重要性。这是特别相关的，因为对于由大多数类型的酵母它是不可发酵的，因此有助于最终产品的味道，并且通常在酿造工业中被称为一般麦芽糖糊精。

因此，根据实施例13中所述的程序进行另一个校准集，此时包括不同浓度的麦芽三糖，使得四种混合的碳水化合物成为用于实际淀粉糖化的非常现实的模型系统。样品组成可以在表3中看到，记录的光谱在图29中显示。

表3

对所有去卷积和标准化的谱带面积进行相同的统计分析，如实施例13中所述。回归分析的结果可以在图30-33中看出。图30-31类似于图27-28中所呈现的数据，并且显示了与RDP不同的谱带面积相关性，分别排除了含有葡萄糖，麦芽糖糊精和麦芽三糖的样品。去卷积模型参数已经相对于先前呈现的稍微调整。对于漂移校正算法以及水减法程序也是这样，其现在使用实验背景而不是分析近似。

使用新数据集非常好地再现了前一实施例中呈现的统计趋势。在图30-31中可以看到关于1078+1081cm^-1，1110cm^-1和1078+1081+1110+1130cm^-1谱带之间的相关性的趋势，这次由于更大尺寸的数据集具有非常好的统计学证据。所有这些相关性非常好，并且当将全数据集与其中排除部分数据集的情况进行比较时，所得到的方程几乎相同。1148+1153cm^-1谱带也与前面的实施例表现相同，并且对于RDP看起来仍然是良好的描述符，尽管它稍微有些噪声。似乎所述数据集也揭示了该谱带可以包括一些更多的化合物特定细节，在所得等式中有一些变化，然而分析的样品的数量太小，以至于分析对于1148+1153cm^-1谱带是决定性的。

1003cm^-1，022cm^-1和1003+1022cm^-1谱带面积与RDP的相关性的分析显示了实施例13中给出的结果的非常精确的再现，并且证实这些谱带在样品中的葡萄糖的辨别中是非常有用的。然而，有趣的是注意到麦芽三糖的排除导致几乎相同的方程作为1003cm^-1,1022cm^-1和1003+1022cm^-1谱带面积与RDP相关的整个数据集。

与RDP相关的1036cm^-1谱带面积与前面实施例中呈现的麦芽三糖游离研究非常不同。在前面的实施例中，对于整个数据集，以及在排除葡萄糖和麦芽糖糊精的两种情况下，1036cm^-1谱带面积与RDP非常好地相关。这里，整个数据集的相关性最初似乎总体上差且噪杂，R²＝0.82。然而，通过排除富含麦芽三糖的样品(设定点5％)，趋势显著变化；表观噪声减少，其余数据现在与RDP很好地相关，R²＝0.943。

为了详细研究麦芽三糖对所述数据集的影响，通过排除麦芽三糖少的样品，还通过研究RDP与谱带面积的相关性，进一步详细研究了富含麦芽三糖的样品。这些曲线图如图32-33中所示。

谱带面积992cm^-1，1003cm^-1，1022cm^-1，1003+1022cm^-1，1078+1081cm^-1，1110cm^-1，1130cm^-1，(1078+1081+1110+1130cm^-1)，1148+1153cm^-1相关性是恒定的，不管数据集是否包括所有样品，麦芽三糖少的样品或富含麦芽三糖的样品。然而，与RDP相关的1036cm^-1谱带面积显示对麦芽三糖的浓度非常敏感。甚至包括含有低至碳水化合物总量的10和15％麦芽三糖的所有样品，显示改善相关性的统计以及改变所得方程的斜率。

图32-33示出了表3中光谱的去卷积的带面积和在不同波长下相对聚合度之间的相关性。不同的回归曲线图比较全数据集的谱带面积对RDP，谱带面积其中只包括富含麦芽三糖的样品。

实施例15

在该实施例中，通过混合12％v/w水溶液葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖和麦芽糖糊精来使用150个样品。实验的目的是增强多元校准的准确性，其允许更好地估计每种特定的碳水化合物。以允许一定范围的不同RDP值的方式混合样品。校准集包括每30个样品的5个子集；第一子集包含所有四种碳水化合物组分(葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖和麦芽糖糊精)。在随后的四个子集中，仅包括每个子集中的三种化合物，排除最后的碳水化合物组分。即5个子集包括30个样品，其具有导致一定范围的RDP值的单个化合物的一系列不同组合：

1)葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖和麦芽糖糊精

2)麦芽糖，麦芽三糖和麦芽糖糊精

3)葡萄糖，麦芽三糖和麦芽糖糊精

4)葡萄糖，麦芽糖和麦芽糖糊精

5)葡萄糖，麦芽糖和麦芽三糖

对于每个样品获得ATR-IR光谱，并且其ATR校准的差光谱根据实施例14进行处理和去卷积。然而，与实施例13和14相比，进行部分最小二乘回归(PLS)代替手动比较线性回归分析。随着PLS的改进的统计，建立多元模型是可能的，其可以应用于在各种淀粉的糖化期间的在线/实时监测。多元模型实时应用于糖化液体以提供总溶解碳水化合物和RDP的准确估计以及来自上述的四种单独碳水化合物(葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖和麦芽糖糊精)的估计。这些值还用于计算麦芽浆的可发酵度的精确实时估计。

实施例16

根据实施例13-15中的程序产生包括280个样品溶液的另一个校准。然而，加入麦芽四糖作为第五组分，以及长链麦芽糖糊精(低DE值)作为第六组分。麦芽四糖从商业高麦芽四糖玉米糖浆获得，其具有非常高的麦芽四糖含量，含有少量麦芽三糖和麦芽糖五糖，并且几乎不含葡萄糖和麦芽糖。使用制造商提供的HPLC证书，可以计算每个样品中麦芽四糖和麦芽三糖的精确量。校准集被分成七个子集，每个子集包括具有六个组分的不同混合物的40个单独样品：

1)葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，高麦芽三糖浆，麦芽糖糊精(DE≈18)和麦芽糖糊精(DE≈5)

2)麦芽糖，麦芽三糖，高麦芽三糖浆，麦芽糖糊精(DE≈18)和麦芽糖糊精(DE≈5)

3)葡萄糖，麦芽三糖，高麦芽三糖浆，麦芽糖糊精(DE≈18)和麦芽糖糊精(DE≈5)

4)葡萄糖，麦芽糖，高麦芽三糖浆，麦芽糖糊精(DE≈18)和麦芽糖糊精(DE≈5)

5)葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽糖糊精(DE≈18)和麦芽糖糊精(DE≈5)

6)葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，高麦芽三糖浆和麦芽糖糊精(DE≈5)

7)葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，高麦芽三糖浆，麦芽糖糊精(DE≈18)

再次，将光谱数据去卷积并进行PLS分析，以建立多元模型。多元模型可以再次实时应用以提供总溶解的碳水化合物和RDP的准确评估以及来自上面的四种单独碳水化合物(葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖和麦芽糖糊精)的评估。这些值还用于计算麦芽浆的可发酵度的精确实时评估。此外，该多元模型可以对麦芽糖糊精的分数进行一些合理的评估。麦芽糖糊精的长度在酿造工业中通常是重要的，因为短麦芽糊精如麦芽三糖和麦芽四糖比具有更高聚合度的麦芽糖糊精显著更甜。

实施例17

制备10.0％w/v的果糖，葡萄糖，蔗糖和1：1葡萄糖-果糖混合物的溶液，并使其平衡。记录使用金门ATR装置的样品的ATR-IR光谱并显示在图34中。所述3种糖的光谱显示非常不同的光谱特征。有趣的是葡萄糖-果糖的1：1混合物与蔗糖明显不同。该实施例与上述实施例结合，清楚地表明了本发明如何可以明显地应用于在转化糖浆的生产中或在从葡萄糖浆酶生产果糖糖浆中监测蔗糖水解。

实施例18

构造类似于图11C所示的糖化分析器的版本。糖化分析器连接到实际尺寸的糖化罐。通过回路，将糖化单元中的浆液连续泵送到分析仪中嵌入的ATR-IR分光单元上，每分钟记录一次光谱。ATR-IR单元中的ATR池倾斜到足够大的角度，以允许取样区域在非操作期间通过重力自动排出。糖浆罐填充有水，通过加入约0.25重量％柠檬酸调节pH，然后将水加热至57℃。在机械搅拌下将发芽大麦加入糖化罐中加热的水中。根据前述实施例中描述的方法和校准，实时分析红外光谱。根据分析，如图35所示，实时地给出了白利糖度中的ADP和总糖，其中三角形显示了从红外光谱获得的糖化期间产生的总碳水化合物(右侧标度)，圆圈显示基于红外谱带的分析的ADP值(左侧标度)。虚线示出了糖化中使用的温度曲线。

标号

100 糖化单元

102 溶液/麦芽浆

104 搅拌单元

106 波导/光学连接路径

108 糖化罐中的侧通道

110 计算机

112 显示器

114 光学探针

116 连接到光学探针的纤维

118 罐中的孔

120 提取和/或再循环阀

122 废物罐

124 泵单元(任选的)

126 提取探针

127 再循环探针

128 入口

130 出口

132 过滤器

134 提取探针的一部分

136 容器安装件

200 红外光谱仪

202 盒

203 ATR-IR单元

204 入射红外光

206 光学部件/反射镜

207 ATR-IR板中的晶体

208 夹具

210 背向反射红外光

212 O形环

300 分析室/ATR-IR池

302 连接器入口

304 连接器出口

400 分光单元

401 密封安装件单元

402 分光附件

403 ATR-IR单元

404 板

406 分光光度计

407 晶体

409 显示器

408 计算机

410 天线

411 盖

412 罐安装件

414 密封件

416 夹具

500 泵送单元

501 壳

502 发动机

504 泵头

506 流动池

602 过滤单元

602 软管