一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物及其制备方法和用途，所述神经酰胺纳米组合物以质量百分比计算由0.5％～8.0％神经酰胺、3.0％～10.0％磷脂、0.5％～5.0％胆固醇、0.5％～5.0％辛基十二醇、0.5％～5.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、10.0％～30.0％多元醇和余量纯化水组成，神经酰胺、磷脂、胆固醇、辛基十二醇制备的油相滴加至维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、多元醇、纯化水制备的水相中，通过高速剪切乳化、高压均质或高压微射流设备处理。所述神经酰胺纳米组合物载药量大，可促进神经酰胺透过皮肤并高浓度长时间滞留，同时具有良好的稳定性和安全性，制备方法简单易控，适合工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物及其制备方法和用途。

背景技术

神经酰胺化学名称为N-脂酰鞘氨醇，由长链鞘氨醇通过酰胺键与脂肪酸共价结合而成，其中鞘氨醇和脂肪酸碳链长度、饱和度和羟基数目都可变化。根据其结构中鞘氨醇和脂肪酸链的不同，神经酰胺可分为神经酰胺Ⅰ、神经酰胺Ⅱ、神经酰胺ⅢA、神经酰胺ⅢB和神经酰胺Ⅵ等。其中，神经酰胺Ⅰ具有修护皮脂膜，提升皮肤表层屏障功能，减少水分流失等功效；神经酰胺Ⅱ具有平衡水分，增强皮肤的自我保护功能等功效；神经酰胺ⅢA具有长效的保湿作用，同时，还能够抑制黑色素细胞中酪氨酸酶的活性，防止皮肤变黑；神经酰胺ⅢB可促进皮肤天然保护层的更新，修护敏感性与干性皮肤；神经酰胺Ⅵ可促进角质代谢，使皮肤平滑、柔嫩。因此，神经酰胺作为一类有效的护肤活性成分广泛应用于不同化妆品中。

但是，神经酰胺在化妆品中的应用存在以下三方面的缺陷和不足：一是神经酰胺为高结晶性物质，溶解度低、水分散性差，导致现有技术的神经酰胺乳剂或凝胶剂载药量低，乳剂或凝胶剂中神经酰胺的含量一般为0.5％，甚至0.05％，致使乳剂和凝胶剂护肤效果不佳；二是神经酰胺透皮性差，影响护肤效果；三是神经酰胺乳剂或凝胶剂在放置过程中易结晶析出，降低了神经酰胺化妆品的稳定性。

为了提高神经酰胺溶解性、改善水分散性和透皮性，现有技术已采用纳米脂质体技术制备出神经酰胺纳米组合物，其溶解性和水分散性得到较大提高。如：中国发明专利CN101214198A公开了一种神经酰胺脂质体制剂及其制备方法和用途；中国发明专利CN104546516A公开了一种复合神经酰胺脂质体的制备工艺及应用。

但是上述专利仍然存在明显的缺陷与不足：中国发明专利CN 104546516A虽然采用了纳米脂质体技术，但所制备的复合神经酰胺脂质体中神经酰胺Ⅵ的含量为0.1％～0.5％，神经酰胺ⅢB含量为0.1％～0.6％，活性成分的含量均非常低，护肤效果有限，其次，所制备的复合神经酰胺脂质体粒径大，阻碍神经酰胺透皮吸收；中国发明专利CN101214198A配方中的辅料为磷脂、甘油以及水，配方中缺少促进皮肤吸收的组分，会减缓活性成分的吸收，其次，所制备的神经酰胺脂质体粒径为100nm以下，并对粒径的下限未做限定，仅考虑到粒径与透皮性的关联性，并未全面考虑粒径与透皮性和滞留性之间的关联性，以及化妆品组分对滞留性的影响，神经酰胺化妆品起效的前提和物质基础是神经酰胺能透过皮肤并能在皮肤中高浓度长时间滞留，化妆品适宜的粒径也是护肤效果的重要前提条件之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物及其制备方法和用途，所制备的神经酰胺纳米组合物组分合理、粒径合适，能有效促进活性成分神经酰胺透过皮肤角质层进入皮肤深层组织，并在皮肤中能高浓度长时间滞留，同时，该纳米组合物具有载药量大、稳定性好、安全性高的优点，且制备方法简便易控。

实现本发明的技术方案是：

一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物，其组分及组分质量百分比为：

一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物，其组分的优选质量百分比为：

一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物，所述神经酰胺为神经酰胺Ⅰ、神经酰胺Ⅱ、神经酰胺ⅢA、神经酰胺ⅢB和神经酰胺Ⅵ中的一种或几种的混合物。

一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物，所述磷脂为天然磷脂或合成磷脂中的一种或几种的混合物，所述天然磷脂为大豆磷脂或蛋黄磷脂，所述合成磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。

一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物，所述多元醇为甘油、1,3-丁二醇、丙二醇、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、1,2-戊二醇中的一种或几种的混合物。

一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物，所述神经酰胺纳米组合物的粒径为30～110nm，优选粒径为30～80nm。

一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)制备油相:将3.0％～10.0％磷脂、0.5％～5.0％胆固醇、0.5％～5.0％辛基十二醇在65～90℃水浴温度条件熔融，熔融后再加入0.5％～8.0％神经酰胺，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将0.5％～5.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、10.0％～30.0％多元醇加入到配方量纯化水中，搅拌并加热65～90℃使维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、多元醇溶解，备用；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再4000～10000rpm高速剪切乳化1～10min，即制得微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的微米级分散体在45～70℃条件下保温，再通过高压均质设备或高压微射流设备处理，压力为500bar～1800bar，循环次数为2～10次，冷却，即得神经酰胺纳米组合物。

一种高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物在护肤化妆品中的应用。神经酰胺纳米组合物可以直接应用于各类化妆品中，如霜剂、乳液、精华液、面膜、凝胶等。

皮肤角质层是表皮的最外层，由5～10层已经死亡的扁角质细胞与其间的脂质成分形成多层致密膜结构，成为阻止外界因素进入人体的天然屏障。因此，护肤活性成分透皮吸收必须克服角质层的屏障作用。同时，护肤活性成分透过皮肤角质层，进入皮肤深层组织后，还必须在护肤靶部位(活性表皮和真皮组织)中高浓度长时间滞留，才能充分发挥其护肤功效。

本发明的发明人研究发现，高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物的组分和比例与其促进活性成分透过皮肤角质层和提高皮肤滞留性能，以及改善纳米组合物稳定性密切相关。组合物中磷脂和胆固醇组成的脂质体结构能够进入皮肤角质层细胞内部，与角蛋白相互作用，使角质层细胞的致密程度降低，并构成脂质通道，促进神经酰胺透过角质层。辛基十二醇既可作为O/W型乳化剂，又具有透皮促进作用，可促进透皮性能不好的神经酰胺透皮吸收，而且安全性好，对皮肤无刺激。维生素E琥珀酸聚乙二醇酯是水溶性的维生素E衍生物，由亲水的极性聚乙二醇链段和亲酯的非极性维生素E琥珀酸酯链段组成，能抑制皮肤细胞内的P-糖蛋白将护肤活性成分神经酰胺外排到血液中，减缓神经酰胺在皮肤组织中清除速度，从而延长神经酰胺在皮肤组织的滞留时间。同时，维生素E琥珀酸聚乙二醇酯也是一类良好的O/W型乳化剂，与辛基十二醇配合使用，其一改善神经酰胺的溶解性和水分散性，避免其在放置过程结晶析出，提高神经酰胺纳米组合物的稳定性，其二增强纳米组合物的透皮能力和延长神经酰胺的滞留时间。此外，纳米组合物中神经酰胺含量高，可以发挥储库作用，持续释放神经酰胺，可较长时间维持在有效浓度，更好地发挥护肤功效。

本发明的发明人研究还发现，高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物的皮肤滞留量与其粒径密切相关，存在显著的粒径效应，当纳米组合物粒径为30～80nm时神经酰胺皮肤透过和皮肤滞留效果最佳。粒径小于30nm，纳米组合物的载药量小，滞留量小，且纳米组合物的稳定性降低；粒径大于110nm时，皮肤透过和皮肤滞留效果明显变差。

本发明的有益效果在于：

1、通过合理组方提高了神经酰胺纳米组合物的皮肤透过性和滞留性：组方中磷脂和胆固醇能构成脂质通道促进护神经酰胺透过角质层；辛基十二醇能有效促进神经酰胺透皮吸收；维生素E琥珀酸聚乙二醇酯能够抑制皮肤细胞内的P-糖蛋白将护肤活性成分外排到血液中，减缓神经酰胺在皮肤组织中清除速度，延长神经酰胺的滞留时间。

2、本发明制备的神经酰胺纳米组物具有合适的粒径，平均粒径为30～110nm，该粒径既能保证神经酰胺透过角质层，又能保证神经酰胺在皮肤中有较长的滞留时间，可显著提高神经酰胺皮肤透过量和皮肤滞留量。

3、本发明神经酰胺纳米组合物载药量大，活性成分神经酰胺浓度可达8％，且神经酰胺纳米组合物具有良好的缓释性能，可以在皮肤组织中发挥储库的作用，持续释放活性成分，较长时间维持在有效浓度，更好地发挥护肤功效。

4、本发明的神经酰胺纳米组合物具有良好的稳定性，辛基十二醇与维生素E琥珀酸聚乙二醇酯联合使用，能改善神经酰胺的溶解性和水分散性，避免其在放置过程结晶析出，提高了组合物的稳定性。

附图说明

图1是实施例10神经酰胺纳米组合物粒径分布图。

图2是实施例10神经酰胺纳米组合物透射电镜图。

图3是神经酰胺纳米组合物体外释放曲线。

图4是神经酰胺纳米组合物体外皮肤累积透过曲线。

图5是神经酰胺纳米组合物体外皮肤累积透过量和滞留量比较。

图6是神经酰胺纳米组合物体外皮肤累计透过量与粒径的关系。

图7是神经酰胺纳米组合物体外皮肤累计滞留量与粒径的关系。

图8是小鼠使用神经酰胺纳米组合物前皮肤生理切片。

图9是小鼠使用神经酰胺纳米组合物后皮肤生理切片。

具体实施方式

下面以实施例方式对本发明作进一步说明，使本领域技术人员可以更好的理解本发明，本发明所优选的具体实施方式应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明。

一、本发明实施例部分

实施例1

(1)制备油相：将3.0％蛋黄磷脂、2.0％胆固醇、0.5％辛基十二醇，于65℃水浴使熔融，熔融后再加入0.5％神经酰胺I，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将5.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、15.0％1,3-丁二醇加入到74.0％水中，于65℃水浴搅拌溶解；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再4000rpm高速剪切乳化10min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在45℃条件下保温，再通过高压均质500bar循环10次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为59.3nm，包封率为84.7％。

实施例2

(1)制备油相：将5.0％大豆磷脂、3.0％胆固醇、1.0％辛基十二醇，于90℃水浴使熔融，熔融后再加入0.5％神经酰胺I、0.5％神经酰胺II，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将3.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、10.0％聚乙二醇400、20.0％丙二醇加入到57.0％水中，于90℃水浴搅拌溶解；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再6000rpm高速剪切乳化5min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在70℃条件下保温，再通过高压均质1800bar循环2次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为72.8nm，包封率90.5％。

实施例3

(1)制备油相：将2.0％蛋黄磷脂、5.0％二棕榈酰磷脂酰胆碱、1.0％二硬脂酰磷脂酰胆碱、5.0％辛基十二醇、5.0％胆固醇，于70℃水浴使熔融；熔融后再加入1.0％神经酰胺III A，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将0.5％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、10％丙二醇加入到70.5％水，于70℃水浴搅拌溶解；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再8000rpm高速剪切乳化3min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在50℃条件下保温，再通过高压均质500bar循环7次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为79.3nm，包封率78.5％。

实施例4

(1)制备油相：将3.0％大豆磷脂、7.0％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、5.0％辛基十二醇、2.0％胆固醇，于75℃水浴使熔融；熔融后再加入1.0％神经酰胺II、3.0％神经酰胺III B、1.0％神经酰胺VI，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将1.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、10.0％甘油、15.0％1,3-丁二醇加入到52.0％水中，于75℃水浴搅拌溶解；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再8000rpm高速剪切乳化7min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在55℃条件下保温，再通过高压均质1200bar循环4次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径51.5nm，包封率85.3％。

实施例5

(1)制备油相：将6.0％二硬脂酰磷脂酰胆碱、3.0％辛基十二醇、0.5％胆固醇，于70℃水浴使熔融；熔融后再加入1.0％神经酰胺VI，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将2.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、20.0％1,3-丁二醇、10.0％聚乙二醇400加入到57.5％水中，于70℃水浴搅拌溶解，

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再6000rpm高速剪切乳化5min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在60℃条件下保温，再通过高压均质800bar循环4次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为63.1nm，包封率94.1％。

实施例6

(1)制备油相：将5.0％大豆磷脂、4.0％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、4.0％辛基十二醇、1.5％胆固醇，于80℃水浴使熔融；熔融后再加入1.0％神经酰胺III A、1.0％神经酰胺III B，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将3.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、20.0％甘油、5.0％聚乙二醇400加入到55.5％水中，于70℃水浴搅拌溶解，

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再6000rpm高速剪切乳化4min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在60℃条件下保温，再通过高压均质1000bar循环3次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为74.5nm，包封率89.9％。

实施例7

(1)制备油相：将8.0％大豆磷脂、3.0％辛基十二醇、0.5％胆固醇，于85℃水浴使熔融；熔融后再加入3.0％神经酰胺III B，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将2.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、25.0％甘油加入到58.5％水中，于85℃水浴搅拌溶解；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再5000rpm高速剪切乳化6min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在65℃条件下保温，再通过高压微射流800bar循环4次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为80.6nm，包封率98.7％。

实施例8

(1)制备油相：将3.0％大豆磷脂、3.0％二棕榈酰磷脂酰胆碱、2.0％二硬脂酰磷脂酰胆碱、2.0％辛基十二醇、1.0％胆固醇，于70℃水浴使熔融；熔融后再加入3.0％神经酰胺III B，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将4.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、20.0％甘油、10.0％丙二醇加入到50.0％水中，于70℃水浴搅拌溶解；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再6000rpm高速剪切乳化5min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在60℃条件下保温，再通过高压均质800bar循环4次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为110.3nm，包封率96.5％。

实施例9

(1)制备油相：将6.0％大豆磷脂、3.0％辛基十二醇、0.5％胆固醇，于90℃水浴使熔融；熔融后再加入3.0％神经酰胺III B，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将1.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、15.0％甘油、10.0％1,2-戊二醇加入到61.5％水中，于70℃水浴搅拌溶解；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再6000rpm高速剪切乳化5min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在65℃条件下保温，再通过高压均质1200bar循环5次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为32.5nm，包封率64.4％。

实施例10

(1)制备油相：将10％大豆磷脂、4.0％辛基十二醇、1.0％胆固醇，于70℃水浴使熔融；熔融后再加入3.0％神经酰胺III B，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将1.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、25.0％甘油加入到56.0％水中，于70℃水浴搅拌溶解；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再6000rpm高速剪切乳化5min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在60℃条件下保温，再通过高压均质800bar循环4次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为63.8nm，包封率92.8％。

二、对比实施例部分

对比例1神经酰胺III B霜剂的制备

按照常规霜剂制备方法，以1.0％神经酰胺III B、3.0％硬脂酸、4.5％单硬脂酸甘油酯、5.0％十六十八醇、6.0％聚二甲基硅氧烷为油相，于75℃水浴中熔融；以10.0％甘油、5.0％丙二醇、0.3％三乙醇胺和65.2％纯化水作为水相，于75℃水浴中溶解；搅拌混合两相并乳化，冷却，即得含量为1.0％神经酰胺III B的霜剂，作为实施例7、实施例8、实施例9和实施例10的对照制剂。

对比例2纳米神经酰胺组合物霜剂的制备

按对比例1中的配方及方法制备的空白霜剂中加入30％的实施例10所制备的纳米神经酰胺组合物，获得含量为1％的神经酰胺IIIB纳米组合物霜剂。

对比例3

(1)制备油相：将2.0％蛋黄磷脂、5.0％大豆磷脂、3.0％胆固醇、2.0％辛基十二醇，于80℃水浴使熔融；熔融后再加入1.0％神经酰胺I、2.0％神经酰胺II、4.0％神经酰胺III A、1.0％神经酰胺III B，混合均匀，备用；

(2)制备水相：将3.0％维生素E琥珀酸聚乙二醇酯、10.0％甘油、5.0％1,2-戊二醇、10.0％丙二醇加入到52.0％水，于80℃水浴搅拌溶解；

(3)制备微米级分散体：将步骤(1)所制备的油相滴加至步骤(2)制备的水相中并不断搅拌，再10000rpm高速剪切乳化1min，制成微米级分散体；

(4)制备纳米组合物：将步骤(3)所制备的纳米分散体在65℃条件下保温，再通过高压均质1500bar循环4次，得神经酰胺纳米组合物。该神经酰胺纳米组合物粒径为19.0nm，包封率54.3％。

三、实验例部分

实验例1神经酰胺纳米组合物的稳定性对比分析

实施例1～10高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物在密闭容器在室温的中放置30天后，检查样品的性状及粒径。

表1实施例1～10及对比例3神经酰胺纳米组合物稳定性结果

试验结果表明：本发明所制备的实施例1～10及对比例3样品无团聚现象，所制备的样品放置30天后，性状及粒径未发生显著变化，仍满足实际应用需求，表明按照本发明所使用的组分和含量制备神经酰胺纳米组合物性状稳定，尤其在药物浓度高的情况下仍然稳定，未发现神经酰胺结晶析出现象，在放置过程中也无药物泄漏现象。

实验例2神经酰胺体外释放比较

分别取实施例7～10、对比例1、对比例2所制备的样品1g于透析袋内，置于50mL2％SDS-20％乙醇-生理盐水中振摇释放，并于1h，2h，4h，6h，8h，10h，24h各取样1mL，再迅速补充1mL相同温度下的空白释放介质。样品用0.22μm有机滤膜过滤后，高效液相色谱法测定，计算药物不同时间的累积释放量。

如图3所示，高皮肤滞留神经酰胺纳米组合物及对比例2的释放度均高于对比例1，粒径较小的实施例7相对于其他实施例8、9、10相对较快，并且对比例2的释放行为与神经酰胺纳米组合物基本一致。

实验例3神经酰胺纳米组合物的皮肤透过性和滞留性的对比分析

以体重为200～250g雄性SD大鼠腹部皮肤为透皮试验的障碍层。将完整无破损的皮肤固定于接收池和供给池之间(皮肤内层面向接收池)。扩散池参数：有效扩散面积3.14cm2，接收池容积约8.0ml，磁力搅拌速度600rpm。在接收池内充满释放介质2％SDS-20％乙醇-生理盐水，排除气泡，开启搅拌，并恒温至(37.0±0.5)℃。向皮肤表面分别均匀涂布样品约1g(n＝8)，于1、2、4、6、8、10、12h、24h吸取接收液0.5ml，并补充释放介质0.5ml。用HPLC测定经0.22μm滤膜过滤的接收液中神经酰胺的浓度。计算不同时间药物累积透过量。

按以下公式计算神经酰胺单位面积累积透皮量：

其中，Q：累积透皮量；S：有效扩散面积；V：接收池中生理盐水体积；Ci：第1次至上次取样时接收液中药物浓度；Cn：该次取样时接收液中药物浓度；m₀：样品理论称样量；m：样品实际称样量。

将本发明实施例7～10样品、对比例1样品进行透皮试验。试验结果参见图4和图5。从图4中可以看出，实施例7～10及对比例3样品的皮肤累积透过量均高于对比例1样品，且对比例3样品的皮肤累积透过量高于实施例7～10。从图5中可以看出本发明实施例7～10的24h累积透过量分别为2617.7μg/cm²、1658.1μg/cm²、3769.6μg/cm²、3117.7μg/cm²，对比例1仅为215.4μg/cm²，对比例3约为4569.3μg/cm²；本发明实施例7～10的24小时滞留量分别为285.21μg/cm²、166.8μg/cm²、130.5μg/cm²、327.6μg/cm²；对比例1仅为30.4μg/cm²，对比例3约为85.9μg/cm²。显然，本发明的神经酰胺纳米组合物具有很高的皮肤累积透过量和滞留量，因而具有优良的护肤效果。

图6和图7为本发明实施例7～10的粒径与透过量和粒径与滞留量的关系分析：从图6中可以看出，当粒径由32.5nm增大至110.3nm时，皮肤累积透过量由3769.6μg/cm²降低至1658.1μg/cm²，对比例3的粒径为19.0nm，皮肤累积透过量高达4569.3μg/cm²，说明粒径越小，透过量越大；从图7中可以看出，粒径为32.5nm的实施例9较粒径为110.3nm的实施例8的滞留量小，对比例3的粒径最小，且滞留量仅为85.9μg/cm²，低于实施例7～10。综合考虑粒径与皮肤累积透过量和累积滞留量的关系，本发明选择的粒径范围在30～110nm之间，优选粒径为30～80nm，能够较好的兼顾皮肤透过量和皮肤滞留量，以起到更好的皮肤屏障修护、保湿等护肤效果。

实验例4皮肤功效评价

小鼠皮肤每天涂抹实施例10与对比例1中空白霜剂1：1复配制得对比例2，1次/天，30天后处死小鼠，取其皮肤制备皮肤生理切片，进行护肤功效评价。小鼠皮肤组织一般形态学如图8、图9所示。

结果显示，涂抹神经酰胺纳米组合物的小鼠皮肤结构完整，层次较清晰，表皮基底层与真皮层结构清晰真皮层纤维组织排列排列整齐，呈现波浪状，细胞分层较清晰，细胞间质分布均匀。与比涂抹前比较，小鼠皮肤组织一般形态有明显改善。

实验例5皮肤刺激性评价

取健康家兔18只，体重(2.0±0.2)kg，随机分为6组，每组动物3只，于实验前24h将家兔背部皮肤两侧去毛，去毛后24h检查去毛皮肤是否受伤，受伤皮肤不宜做皮肤刺激性试验。每天涂抹3次，连续涂抹7天。包括空白霜剂组(不给予任何药物)、比较实施例7～10分别与霜剂基质1:1复配进行皮肤刺激性试验，试验结果见表2。

表2实施例7～10及空白组皮肤刺激性观察结果

“+”家兔皮肤充血、红肿；“++”表示充血、红肿现象仍在，但有增加趋势；“—”表示无充血、红肿现象。

试验结果表明：本发明实施例7～10分别与对比例1空白霜剂1:1复配的样品涂抹于家兔皮肤无充血、红肿现象，表明实施例7～10与霜剂均无刺激性。