一种基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法

摘要

本发明公开了一种基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法，其采用核磁共振波谱技术对大豆种子提取物中的代谢物进行绝对定量分析，得到代谢物归属图谱，并基于建立的偏最小二乘法多元回归模型，筛选特定代谢物，继而利用得到的大豆种子中特定代谢物的绝对含量值判别其活力高低，为大豆种子活力判别及抗老化大豆种质资源的筛选提供参考。本发明操作简单快速、结果可靠，可为具有抗老化潜力的优质大豆种质资源的判定和筛选提供参考。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，更具体地讲，涉及一种基于核磁共振波谱技术的代谢组学技术判别大豆种子活力的方法。

背景技术

种子在储藏过程中均会发生不同程度的老化，并直接导致种子活力降低，抑制种胚正常发育以及幼苗生长，由此造成植物生产水平与品质的大幅下降。因此，农业生产前必须对种子活力进行检测，保证采用高活力的种子进行播种，减少因种子失活带来的生产损失。

以抗老化优质大豆品种的选育为例：种子在生物多样性保护、农林牧业生产和植物群落重建、演替中具有举足轻重的作用。一般来讲，具有正常生理活性的种子能够在干燥条件下保持一定时间的活力，但随着贮存时间的延长，种子劣变老化将不可逆、不可避免地发生，其品质的优劣直接影响了农作物、饲草、林木等的生产、经济与遗传资源有效利用、土壤种子库稳态维持。抗老化大豆品种的选育迫在眉睫。

抗老化大豆品种的评价，多通过检测种子活力判断，常规方法有籽粒的萌发实验、生理测定、加速老化法、电导率测定法和生化测定法等，这些方法都具有周期长、用量大的缺点，还存在人为等不稳定因素对最终结果的干扰，导致评价耗时费力，尤其是对于稀有供试材料的活力判别，难以快速达到预期目的，因此，实践中亟需一种快速的、准确的，不易受外界不定因素干扰的种子活力检测方法。

定量核磁共振技术是一种可以通过准确定量代谢物的绝对浓度值来获得种子内部信息的一项技术。与传统鉴别种子活力的方法相比，该技术前处理简便，可通过核磁共振波谱技术实现对待测大豆籽粒中各代谢物的全面分析。结合统计分析法，找出种子活力差异显著的大豆籽粒中各表征代谢物，并建立可行性强，准确度高的判别模型，可为种子活力的判别提供强有力的技术支撑。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于核磁共振手段判别不同大豆种子活力的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种基于核磁共振手段判别不同大豆种子活力的方法，通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量，并筛选出对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物，建立所述一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物与大豆种子活力之间的关联，检测待测大豆种子中所述一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物的绝对含量并根据所述关联判别待测大豆种子的活力。

根据本发明的一些实施例，所述对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物包括：精氨酸、色氨酸、次黄嘌呤、异丙醇、丙二醇、磷酸胆碱、丙三醇磷酸胆碱和二甲基尿酸盐。

本发明的优选方法筛选出8种对大豆种子活力影响显著的代谢物，并用同品种不同年份的大豆种子对这些代谢物进行t检验，不同年份大豆种子之间差异显著，证明这8种代谢物能够很好的表征大豆种子的活力。将这些代谢物与大豆种子活力建立关联，根据本发明的一些实施例证实，建立的关联模型能简便、准确的判别大豆种子活力。因而，利用本发明的方法，一旦建立模型，每次只需要检测大豆种子中上述8种代谢物的绝对含量，代入关联模型，即可获得种子活力结果。不需要检测所有代谢物含量，也不需要耗时较长的萌芽实验或酶活性检测实验。

根据本发明的一些实施例，所述通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量的步骤，包括大豆种子提取液的制备和核磁共振分析，并以DSS-d6的浓度和峰面积为标准，根据大豆种子提取液的分析图谱获得大豆种子中多种代谢物的绝对含量。

作为优选，所述通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量的步骤具体包括：

a、将待测大豆种子样本液氮研磨后得到豆粉，(将所述豆粉储存于-80～-70℃的环境下备用)取所述豆粉置于冷冻干燥机中干燥，再称取豆粉置于样本管中，加入甲醇水溶液，密封震荡后进行冰水浴超声提取，离心后取上清液并将上清液氮吹、冻干，复溶后将所得样品在-80～-70℃下保存待测；

b、对样品进行¹H-NMR分析，获得所述待测大豆种子样本的核磁共振分析谱图，即为所述大豆代谢物靶向代谢图谱；

c、以DSS-d6(sodium 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonate-d6，氘代4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)的浓度和峰面积为标准，根据步骤b的分析图谱获得大豆种子中多种代谢物的绝对含量。

其中，在本发明的一些实施例中，步骤c利用所述分析图谱计算得到各种代谢物的绝对含量的步骤包括以下子步骤：将¹H-NMR自由感应衰减(free>1H-NMR谱图中信号的相关信息(如化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等)，以DSS-d6的浓度和谱峰面积为标准，结合Chenomx自带数据库对样本谱图的信号逐一比对分析，获得代谢物的绝对浓度值。

作为进一步的优选，在上述步骤b中，¹H-NMR的具体参数条件包括：采用metnoesy脉冲序列，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率599.83MHz，谱宽7225.434Hz，采样时间4.089s，脉冲延缓时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536。

根据本发明的一些实施例，步骤c检测的大豆种子中多种代谢物包括12个有机酸(羟基异丁酸、氨基丁酸、羟基苯丙氨酸、醋酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、葡萄糖酸、丙二酸盐、琥珀酸盐)，2个糖类(粘酸、蔗糖)，15个氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甜菜碱、谷氨酸盐、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、葫芦巴碱、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷酰基苯丙氨酸、甲基组氨酸)，4个核酸类(腺嘌呤、腺苷、次黄嘌呤、尿苷)及10个其它类别的化合物，共计43种代谢物。

根据本发明的一些实施例，所述筛选出对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物的步骤，包括：

i、将检测得到的大豆种子中多种代谢物的绝对含量形成一个变量矩阵；

ii、将步骤i所述矩阵中的变量进行标度化后利用正交偏最小二乘-判别分析方法对数据矩阵进行统计分析，筛选对分类有重要贡献的代谢物；

iii、对步骤ii筛选出的代谢物进行t检验，结合实际检测种子活力表型选出含量差异显著的代谢物，并将其作为对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物。

根据本发明的一些实施例，对大豆种子活力影响显著的代谢物为8种：精氨酸、色氨酸、次黄嘌呤、异丙醇、丙二醇、磷酸胆碱、丙三醇磷酸胆碱和二甲基尿酸盐。

建立对大豆种子活力影响显著的代谢物与大豆种子活力之间的关联的步骤，包括将对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物及其含量的原始数据信息导入到SPSS，利用Fisher判别法建立高活力种子、中活力种子、低活力种子的判别模型。

根据本发明的一个实施例，根据现有的大豆种子样本信息将所述对大豆种子活力影响显著的代谢物及其绝对含量与大豆种子活力建立关联，形成判别标准，其中高活力种子、中活力种子、低活力种子的判别模型如下：

y₁＝1490.702X₁+5812.922X₂-4900.809X₃+140324.202X₄+83872.242X₅+22931.467X₆+27.417X₇+1631.271-2511.587X₈>

y₂＝817.358X₁+3652.585X₂-2932.726X₃+61130.981X₄+63426.771X₅+10336.592X₆+565.5X₇+1329.877X₈-934.047>

y₃＝1021.601X₁+2311.24X₂+86.253X₃+34297.452X₄+149154.18X₅-704.895X₆+1318.243X₇+2024.429X₈-2206.192>

y₁代表高活力种子，y₂代表中活力种子，y₃代表低活力种子。

X₁为Arginine精氨酸的绝对含量；X₂为Tryptophan色氨酸的绝对含量；X₃为Hypoxanthine次黄嘌呤的绝对含量；X₄为Isopropanol异丙醇的绝对含量；X₅为Propylene>6为O-Phosphocholine磷酸胆碱的绝对含量；X₇为sn-Glycero-3-phosphocholine丙三醇磷酸胆碱的绝对含量；X₈为1,3-Dimethylurate二甲基尿酸盐的绝对含量，含量单位为mg/g。将X₁～X₈带入所述模型，计算出y₁～y₃的值，数值最大者代表待测大豆种子的活力类型。

根据本发明的一些实施例，所述检测待测大豆种子中所述一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物的绝对含量并根据所述关联判别其活力的步骤，包括：

a)、对样品进行¹H-NMR分析，获得一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物的绝对含量；

b)、将步骤a)获得的一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物的绝对含量代入活力种子的判别模型，计算结果并判别待测大豆种子的活力。

根据本发明的一些实施例，利用核磁共振波谱技术检测待测样品中8中代谢物的绝对含量，将含量数值分别带入上述①②③3个模型，计算y₁，y₂，y₃值，三者中的最大值代表待测大豆种子活力所属类别，例如y₁，y₂，y₃值中y₃值最大，则代表该待测大豆种子为低活力种子。

本发明所述的利用核磁共振波谱技术判别大豆种子活力的方法可用于筛选抗老化潜力的优质大豆种质资源。

与现有技术相比，本发明采用核磁共振波谱技术标定测试样本中各代谢物的绝对含量，样本前处理、分析测试工作均采用标准化程序处理，操作简单、误差小，数据可靠。采用基于核磁共振技术的代谢组学研究平台，尤其是代谢物图谱的应用，可有效实现微量代谢物含量的准确测定；新型多元回归建模方法正交偏最小二乘-判别分析(O2PLS-DA)的应用，与传统方法相比，该方法能去除波谱数据中的干扰信号，剔除与样品成分浓度含量无关的主成分，使得所提取的成分对浓度数据有较大的贡献率，预测精度更高。此外，本发明操作简单便捷、结果准确可靠且样品用量少，可为大豆种子活力分析及相关的研究提供借鉴。

附图说明

图1是实施例1的样品JP06-H24的提取物获得的大豆种子代谢物归属谱图；

图2是实施例1中针对4种大豆种子样本构建模型得到的得分矩阵图；每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值；

图3是实施例1中针对4种大豆种子样本构建模型得到的载荷矩阵图。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法进行详细的说明，但不应将其解释为本发明仅限于这些实例，凡是基于本发明的内容进行的组合，简单替换，顺序调换等得到的技术方案都属于本发明保护的范畴。

总体地讲，本发明是一种基于核磁共振技术进行大豆种子代谢物归属谱图分析，然后用多变量统计方法区分不同活力的大豆种子数据并发现对表型差异有重要贡献的化合物，从而对不同活性大豆种子代谢物差异进行研究的方法。该方法具有操作简单快速、结果可靠的优点，可以为具有抗老化潜力的优质大豆种质资源的判定、筛选提供参考，并为大豆抗老化机理的深入研究提供依据。

根据本发明的示例性实施例，所述基于核磁共振手段判别不同活性大豆种子的方法是通过检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量并筛选出对大豆种子的活力影响显著的一种或多种代谢物，利用所述一种或多种对大豆种子的活力影响显著的代谢物及其绝对含量对所述大豆种子的活力进行判别，获得具有抗老化潜力的大豆种质资源。

根据本发明基于核磁共振手段判别不同大豆种子活力的方法的一个实施例，将所述对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物及其含量的原始数据信息导入到SPSS，利用Fisher判别法建立高活力种子、中活力种子、低活力种子的判别模型，所得模型如下：

y₁＝1490.702X₁+5812.922X₂-4900.809X₃+140324.202X₄+83872.242X₅+22931.467X₆+27.417X₇+1631.271-2511.587X₈>

y₂＝817.358X₁+3652.585X₂-2932.726X₃+61130.981X₄+63426.771X₅+10336.592X₆+565.5X₇+1329.877X₈-934.047>

y₃＝1021.601X₁+2311.24X₂+86.253X₃+34297.452X₄+149154.18X₅-704.895X₆+1318.243X₇+2024.429X₈-2206.192>

y₁代表高活力种子，y₂代表中活力种子，y₃代表低活力种子。

X₁为Arginine精氨酸；X₂为Tryptophan色氨酸；X₃为Hypoxanthine次黄嘌呤；X₄为Isopropanol异丙醇；X₅为Propylene>6为O-Phosphocholine磷酸胆碱；X₇为sn-Glycero-3-phosphocholine丙三醇磷酸胆碱；X₈为1,3-Dimethylurate二甲基尿酸盐，含量单位为mg/g。

根据本发明基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法的一个实施例，利用核磁共振波谱技术检测待测样品中能表征大豆活力的代谢物的绝对含量，并将含量数值分别带入上述①②③3个模型，计算y₁，y₂，y₃值，三者中的最大值代表待测大豆种子活力所属类别(例如y₁，y₂，y₃值中y₃值最大，则代表该待测大豆种子为低活力种子)。

下面先对本发明检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量的具体步骤进行说明。

根据本发明，所述检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量的步骤包括采用核磁共振波谱技术对待测大豆种子样本中的代谢物含量进行分析并得到代谢物归属谱图的步骤和利用所述代谢物归属谱图计算得到各种代谢物的绝对含量的步骤：

a、将待测大豆种子样本液氮研磨后得到豆粉，(将所述豆粉储存于-80～-70℃的环境下备用)，取所述豆粉置于冷冻干燥机中干燥，再称取豆粉置于样本管中，加入甲醇水溶液并控制料液比为1:1，密封震荡后进行冰水浴超声提取，离心后取上清液并将上清液经过滤膜过滤后于核磁管中，将所得样品在-70～-20℃下保存待测；

b、对样品进行¹H-NMR分析，获得所述待测大豆种子样本的核磁共振分析谱图，即为所述大豆代谢物靶向代谢图谱；

c、以DSS-d₆的浓度和峰面积为标准，根据步骤b的分析图谱获得大豆种子中多种代谢物的绝对含量。

上述步骤c中，核磁共振系统的参数条件包括：采用metnoesy脉冲序列，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率599.83MHz，谱宽7225.434Hz，采样时间4.089s，脉冲延缓时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536；

其中，在本发明的一些实施例中，步骤c利用所述分析图谱计算得到各种代谢物的绝对含量的步骤包括以下子步骤：将¹H-NMR自由感应衰减(free>6峰(0.0ppm)作为全部谱图化学位移的标准，并对其进行反转卷积操作，调整谱图峰形(CSI)。根据1H-NMR谱图中信号的相关信息(如化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等)，以DSS-d₆的浓度和谱峰面积为标准，结合Chenomx自带数据库对60张样本谱图的信号逐一比对分析，获得代谢物的绝对浓度值。

在获得大豆种子样本中各种代谢物的绝对含量之后，需对其进行分析和识别，从而筛选出对大豆的抗老化潜力影响显著的一种或多种代谢物：

i、将检测得到的大豆种子中多种代谢物的绝对含量形成一个变量矩阵，其中，所述大豆代谢物包括12个有机酸，2个糖类，15个氨基酸，4个核酸类及10个其它类别的化合物，共计43种代谢物，具体在实施例1的表2中列出；

ii、将步骤i所述矩阵中的变量进行标度化后利用正交偏最小二乘-判别分析方法对数据矩阵进行统计分析，筛选对分类有重要贡献的代谢物；

iii、对步骤ii筛选出的代谢物进行t检验，结合实际检测种子活力表型选出含量差异显著的代谢物，并将其作为对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物。

进而，建立对大豆种子活力影响显著的代谢物与大豆种子活力之间的关联，包括将对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物及其含量的原始数据信息导入到SPSS，利用Fisher判别法建立高活力种子、中活力种子、低活力种子的判别模型。

由此可以根据大豆种子样本中8种代谢物及其绝对含量来快速、高效地评价大豆种子的活力。

下面结合实施例对本发明的基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法作进一步说明。

实施例1

本实施例选用不同年份的黄豆和黑豆种子，大豆种子样本信息如表1所示。

表1 样本的材料信息

材料编号来源收获年份种皮颜色JP6-H24日本北海道2012黑豆JP6-H25日本北海道2013黑豆JP16-H24日本北海道2012黄豆JP16-H26日本北海道2014黄豆

首先，将4个样本材料用液氮研磨粉碎并使用冻干机冻干24小时，再将所得豆粉储存于-80℃的超低温冰箱中备用。

其次，各样本的冻干粉末分析步骤如下：

1)准确称量500.0mg大豆样品的冻干粉末，置于样本管中，加入体积浓度为50％的甲醇水溶液1mL(控制料液比为1:1)；密封后置于漩涡振荡器中震荡60s，再于冰水浴下超声(40KHz，300w)萃取30s，13000×g离心15min，取上清液约0.7mL于离心管，氮吹样本60min，放入-80度冰箱中冰冻1个小时；之后将样本放入到冻干机中冻干1小时，加入0.45mL纯水，涡旋60s，进行复溶；取ACDSS试剂50μL于上述离心管中，涡旋10s，4摄氏度，13000×g离心2min，取0.48mL上清液于核磁管中，置于-20℃的环境下保存待测。

2)核磁共振谱仪(Agilent DD2 600MHz spectrometer equipped with a triple-resonance cryoprobe)采集核磁数据的具体参数条件：采用metnoesy脉冲序列，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率599.83MHz，谱宽7225.434Hz，采样时间4.089s，脉冲延缓时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536；

3)代谢物定量分析：将¹H-NMR自由感应衰减(free>6峰(0.0ppm)作为全部谱图化学位移的标准，并对其进行反转卷积操作，调整谱图峰形(CSI)。根据1H-NMR谱图中信号的相关信息(如化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等)，以DSS-d₆的浓度和谱峰面积为标准，结合Chenomx自带数据库对样本谱图的信号逐一比对分析，获得代谢物的绝对浓度值(见表2)。

表2 不同样本代谢物绝对浓度值及方差分析

注：表中标明的不同小写字母a，b，c代表值差异达0.01显著水平

4)将步骤3)中获得的4个大豆样本的43代谢物含量数据，形成一个4×43的数据矩阵，将数据矩阵中的变量进行标度化后导入SIMCA-P软件(V 13.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)，利用主成份分析和正交偏最小二乘-判别分析(O2PLS-DA)方法对数据矩阵进行模式识别多变量分析，根据每个样本在主成分上的投影，得到得分矩阵图，具体如图2所示。从图2可知，4种大豆种子样本的投影在得分矩阵图上可以得到很好的分离，这表明，不同种子活力的大豆之间存在明显的区别。之后，再根据每个变量在主成分上的投影，得到载荷矩阵图，具体如图3所示。其中，与得分矩阵图对应的载荷矩阵图(图3)反映出导致样本对组间分开作出了贡献的差异代谢物，Arginine为精氨酸，Tryptophan为色氨酸，Hypoxanthine为次黄嘌呤，Isopropanol为异丙醇，Propylene glycol为丙二醇，O-Phosphocholine为磷酸胆碱，sn-Glycero-3-phosphocholine丙三醇磷酸胆碱离中心点较远，且在相同品种储存前后代谢物的差异中VIP(variable influence in projection，变量重要性投影)值均>1(图3)，因此其对区分样本所做贡献较大，为表征代谢物。将上述8个代谢物的信息导入到SPSS，在同品种不同年份的大豆种子间做样本t检验，p<0.05，通过t检验，认为对不同抗老化潜力大豆种质资源的代谢有显著性差异。基于上述8个代谢物含量的原始数据，利用Fisher判别法建立高活力种子、中活力种子、低活力种子的判别模型，所得模型如下：

y₁＝1490.702X₁+5812.922X₂-4900.809X₃+140324.202X₄+83872.242X₅+22931.467X₆+27.417X₇+1631.271-2511.587X₈>

y₂＝817.358X₁+3652.585X₂-2932.726X₃+61130.981X₄+63426.771X₅+10336.592X₆+565.5X₇+1329.877X₈-934.047>

y₃＝1021.601X₁+2311.24X₂+86.253X₃+34297.452X₄+149154.18X₅-704.895X₆+1318.243X₇+2024.429X₈-2206.192>

y₁代表高活力种子，y₂代表中活力种子，y₃代表低活力种子。

X₁为Arginine精氨酸；X₂为Tryptophan色氨酸；X₃为Hypoxanthine次黄嘌呤；X₄为Isopropanol异丙醇；X₅为Propylene>6为O-Phosphocholine磷酸胆碱；X₇为sn-Glycero-3-phosphocholine丙三醇磷酸胆碱；X₈为1,3-Dimethylurate二甲基尿酸盐，含量单位为mg/g。

使用方法：利用核磁共振技术检测待测样品中上述8种代谢物的含量，将含量数值分别带入上述3个模型，计算y₁，y₂，y₃值，三者中的最大值代表待测大豆种子活力所属类别(例如y₁，y₂，y₃值中y₃值最大，则代表该待测大豆种子为低活力种子)。

仅建模所需时间为0.5h。

实施例2

本实施例待测大豆样本选择均为2012年购入的黄豆样品JP16-H24和黑豆样品JP6-H24为实验材料，大豆种子样本信息如表3所示。

表3 2种不同大豆的材料信息

材料编号来源收获年份种皮颜色JP6-H24日本北海道2012黑豆JP16-H24日本北海道2012黄豆

首先，将上述2个样本材料用液氮研磨粉碎并使用冻干机冻干24小时，再将所得豆粉储存于-80℃的超低温冰箱中备用。

其次，各样本的冻干粉末分析步骤如下：

1)准确称量50.0mg大豆样品的冻干粉末，置于样本管中，加入体积浓度为50％的甲醇水溶液1mL(控制料液比为1:1)；密封后置于漩涡振荡器中震荡60s，再于冰水浴下超声(40KHz，300w)萃取30s，13000×g离心15min，取上清液约0.7mL于离心管，氮吹样本60min，放入-80度冰箱中冰冻1个小时；之后将样本放入到冻干机中冻干1小时，加入0.45mL纯水，涡旋60s，进行复溶；取ACDSS试剂50μL于上述离心管中，涡旋10s，4摄氏度，13000×g离心2min，取0.48mL上清液于核磁管中，置于-20℃的环境下保存待测。

2)核磁共振谱仪(Agilent DD2 600MHz spectrometer equipped with a triple-resonance cryoprobe)采集核磁数据的具体参数条件：采用metnoesy脉冲序列，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率599.83MHz，谱宽7225.434Hz，采样时间4.089s，脉冲延缓时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536；

3)代谢物定量分析：将¹H-NMR自由感应衰减(free>6峰(0.0ppm)作为全部谱图化学位移的标准，并对其进行反转卷积操作，调整谱图峰形(CSI)。根据¹H-NMR谱图中信号的相关信息(如化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等)，以DSS-d₆的浓度和谱峰面积为标准，结合Chenomx自带数据库对样本谱图的信号逐一比对分析，获得8种表征代谢物的绝对浓度值(见表4)。

表4 样本JP16-H24和JP6-H24表征代谢物含量

将数值分别代入上述的Fisher判别模型①②③中，得出结果：

对于JP16-H24：y₁＝795.2907，y₂＝1421.4093，y₃＝2185.4049，其中y₃的数值最大，所以JP16-H24为低活力种子；

对于JP6-H24：y₁＝467.2959，y₂＝961.3330，y₃＝201.2072，其中y₂的数值最大，所以JP6-H24为中活力种子。

完成待测样品检测全过程所需时间为48h。

实施例3

本实施例待测大豆样本选择分别购自2012年和2014年的相同的黄豆材料JP16为实验样品，大豆种子样本信息如表5所示。

表5 2种不同大豆的材料信息

材料编号来源收获年份种皮颜色JP16-H24日本北海道2012黄豆JP16-H26日本北海道2014黄豆

首先，将上述2个样本材料用液氮研磨粉碎并使用冻干机冻干24小时，再将所得豆粉储存于-80℃的超低温冰箱中备用。

其次，各样本的冻干粉末分析步骤如下：

1)准确称量50.0mg大豆样品的冻干粉末，置于样本管中，加入体积浓度为50％的甲醇水溶液1mL(控制料液比为1:1)；密封后置于漩涡振荡器中震荡60s，再于冰水浴下超声(40KHz，300w)萃取30s，13000×g离心15min，取上清液约0.7mL于离心管，氮吹样本60min，放入-80度冰箱中冰冻1个小时；之后将样本放入到冻干机中冻干1小时，加入0.45mL纯水，涡旋60s，进行复溶；取ACDSS试剂50μL于上述离心管中，涡旋10s，4摄氏度，13000×g离心2min，取0.48mL上清液于核磁管中，置于-20℃的环境下保存待测。

2)核磁共振谱仪(Agilent DD2 600MHz spectrometer equipped with a triple-resonance cryoprobe)采集核磁数据的具体参数条件：采用metnoesy脉冲序列，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率599.83MHz，谱宽7225.434Hz，采样时间4.089s，脉冲延缓时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536；

3)靶向代谢物定量分析：将¹H-NMR自由感应衰减(free>6峰(0.0ppm)作为全部谱图化学位移的标准，并对其进行反转卷积操作，调整谱图峰形(CSI)。根据¹H-NMR谱图中信号的相关信息(如化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等)，以DSS-d₆的浓度和谱峰面积为标准，结合Chenomx自带数据库对样本谱图的信号逐一比对分析，获得8种表征代谢物的绝对浓度值(见表6)。

表6 样本JP16-H24和JP16-H26表征代谢物含量

将数值分别代入上述的Fisher判别模型①②③中，得出结果：

对于JP16-H24：y₁＝795.2907，y₂＝1421.4093，y₃＝2185.4049，其中y₃的数值最大，所以JP16-H24为低活力种子；

对于JP16-H26：y₁＝803.9595，y₂＝1225.7729，y₃＝1008.9630，其中y₂的数值最大，所以JP16-H26为中活力种子。

完成待测样品检测全过程所需时间为48h。

实施例4

本实施例待测大豆样本选择分别购自2012年和2013年的相同的黑豆材料JP6为实验样品，大豆种子样本信息如表7所示。

表7 2种不同大豆的材料信息

材料编号来源收获年份种皮颜色JP6-H24日本北海道2012黑豆JP6-H25日本北海道2013黑豆

首先，将上述2个样本材料用液氮研磨粉碎并使用冻干机冻干24小时，再将所得豆粉储存于-80℃的超低温冰箱中备用。

其次，各样本的冻干粉末分析步骤如下：

1)准确称量50.0mg大豆样品的冻干粉末，置于样本管中，加入体积浓度为50％的甲醇水溶液1mL(控制料液比为1:1)；密封后置于漩涡振荡器中震荡60s，再于冰水浴下超声(40KHz，300w)萃取30s，13000×g离心15min，取上清液约0.7mL于离心管，氮吹样本60分钟，放入-80摄氏度冰箱中冰冻1个小时；之后将样本放入到冻干机中冻干1小时，加入0.45mL纯水，涡旋60s，进行复溶；取ACDSS试剂50μL于上述离心管中，涡旋10s，4摄氏度，13000×g离心2min，取0.48mL上清液于核磁管中，置于-20℃的环境下保存待测。

2)核磁共振谱仪(Agilent DD2 600MHz spectrometer equipped with a triple-resonance cryoprobe)采集核磁数据的具体参数条件：采用metnoesy脉冲序列，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率599.83MHz，谱宽7225.434Hz，采样时间4.089s，脉冲延缓时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536；

3)靶向代谢物定量分析：将¹H-NMR自由感应衰减(free>6峰(0.0ppm)作为全部谱图化学位移的标准，并对其进行反转卷积操作，调整谱图峰形(CSI)。根据¹H-NMR谱图中信号的相关信息(如化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等)，以DSS-d₆的浓度和谱峰面积为标准，结合Chenomx自带数据库对样本谱图的信号逐一比对分析，获得8种表征代谢物的绝对浓度值(见表8)。

表8 样本JP6-H24和JP6-H25表征代谢物含量

将数值分别代入上述的Fisher判别模型①②③中，得出结果：

对于JP6-H24：y₁＝467.2959，y₂＝961.3330，y₃＝201.2072，其中y₂的数值最大，所以JP6-H24为中活力种子；

对于JP6-H25：y₁＝2426.8227，y₂＝1955.6688，y₃＝1034.0725，其中y₁的数值最大，所以JP16-H26为高活力种子。

完成待测样品检测全过程所需时间为48h。

实施例5

本实施例选用与实施例1中相同的大豆材料，大豆种子样本信息如表1所示。

首先，将所有大豆种子用75％的乙醇溶液进行消毒，消毒完成后开始发芽试验。试验进行7天，其中，发芽盘采用直径12cm的培养皿，先用0.1％的KMnO₄溶液浸泡消毒10min，然后蒸馏水浸泡12h以去除残留溶液；在洗净后的培养皿内铺2层滤纸，每皿播种25粒，每个样本设置5次重复。将各处理放入培养箱中培养，温度控制在20℃-25℃，相对湿度控制在75％-80％。每日以蒸馏水补充蒸发的水分，并从播种开始计时，每24h统计大豆发芽数1次，如发现有霉变的大豆则及时用蒸馏水清洗，严重者及时清除。试验结束时计算以下生理指标，并测定种苗伸长量(单位为cm)：

(Dt：发芽试验天数；Gt：该天数对应的发芽种子数)

(S：种苗生长量，单位：cm；Gi：萌发指数)

最终结果如表9所示：

表9 各供试品种生理指标测定结果

(平均值±标准误，n＝5)

GP：发芽率；GE：发芽势；GI：发芽指数；S：种苗生长量；VI：活力指数

根据评价标准，VI≥50的种子为高活力种子，50＞VI＞10的种子为中活力种子，VI<5的种子为低活力种子。得到结果：JP06-H25为高活力种子；JP06-H24、JP16-H26为中活力种子；JP16-H24为低活力种子。该方法与实施例2～4的NMR方法所得结果相同。

两种方法经过验证后结果一致，但发芽试验所用时间明显长的多，加上前面的消毒和最后和数据计算，至少需要9天的时间；且步骤繁琐，需要人工每天统计种子的发芽数，若不小心看错看漏，则会导致结果出现偏差；若在试验中进行发芽数统计或补充水分等过程中不注意卫生，易造成种子霉变甚至死亡；另外，试验过程需要严格控制外界条件，如温度、湿度等，若碰上停电等不可控因素，则需要重新开始，浪费时间和资源；每次试验所需重复数目较多(n5)，不适用于珍贵种质资源种子活力的评价。