一种大白花杓兰叶片愈伤组织再生植株诱导培养基

摘要

一种大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基，它涉及一种植物再生植株诱导培养基。它解决了大白花杓兰自然繁殖系数低，且现有再生诱导培养基培养植株分化率低问题。大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基成分包括大量元素组分、微量元素组分和有机质组分，pH值为5.5～6.0。利用本发明大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基对大白花杓兰幼叶进行再生植株诱导培养，大白花杓兰幼叶在本发明诱导分化培养基上很容易被诱导形成愈伤组织，愈伤组织诱导率可达到90％以上；再将诱导出的淡绿色愈伤组织转接至本发明继代培养基上进行继代培养，愈伤组织诱导成植株的几率高，再生植株诱导率可达70％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物再生植株诱导培养基。

背景技术

野生珍稀花卉大白花杓兰(Cypripedium macranthum Sw.f.)为杓兰属中的一个重要变种，多年生宿根植物，分布于我国东北。株高35～50cm，根状茎粗壮，茎生叶3～6枚，广椭圆形。花大型，长3～5cm，有香气，单生于茎顶。花梗稍弯，花纯白色。唇瓣似女士的托鞋，故又称托鞋兰。大白花杓兰能散发香气，花形奇异，具有极高的观赏价值。大白花杓兰生于海拔400～2400米的林下、林缘或草坡上腐殖质丰富和排水良好之地。在中国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、山东、台湾以及日本、朝鲜半岛和俄罗斯均有分布。因其为野生花卉，适应北方严寒气候，可露地越冬，因此特别适合高纬度城市园林种植，而且与其他园林花卉配置具有画龙点睛的效果。

但大白花杓兰一般每隔三年才分株一次，繁殖系数低，严重的制约了大白花杓兰的广泛种植。目前采用现有再生诱导培养基(如MS培养基或1/2MS培养基)培养大白花杓兰存在植株分化率低问题，植株分化率仅为30％～50％。

发明内容

本发明是为了解决大白花杓兰自然繁殖系数低，且现有再生诱导培养基培养植株分化率低问题，而提供的一种大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基。

大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基成分包括大量元素组分、微量元素组分和有机质组分，pH值为5.5～6.0；

大量元素组分由NH₄NO₃、KNO₃、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和CaCl₂·2H₂O组成，大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中NH₄NO₃的浓度为400mg/L、KNO₃的浓度为1050mg/L、KH₂PO₄的浓度为170mg/L、MgSO₄·7H₂O的投加浓度为370mg/L、CaCl₂·2H₂O的投加浓度为210mg/L；

微量元素组分由H₃BO₃、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O和CuSO₄·5H₂O组成，大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中H₃BO₃的浓度为6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O的投加浓度为22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O的投加浓度为8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O的投加浓度为0.025mg/L、CuSO₄·5H₂O的投加浓度为0.25mg/L；

有机质组分由Na₂·EDTA、FeSO₄·7H₂O、环已六醇、维生素B₃、盐酸硫胺素、盐酸呲哆素、氨基乙酸组成，大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中Na₂·EDTA的浓度为37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O的投加浓度为27.8mg/L、环已六醇的浓度为100mg/L、维生素B₃的浓度为0.5mg/L、盐酸硫胺素的浓度为0.1mg/L、盐酸呲哆素的浓度为0.5mg/L、氨基乙酸的浓度为2mg/L。

大白花杓兰叶片再生植株生根培养基成分包括大量元素组分、微量元素组分、有机质组分、吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖，pH值为5.8；

大量元素组分由NH₄NO₃、KNO₃、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和CaCl₂·2H₂O组成，大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中NH₄NO₃的浓度为400mg/L、KNO₃的浓度为1050mg/L、KH₂PO₄的浓度为170mg/L、MgSO₄·7H₂O的投加浓度为370mg/L、CaCl₂·2H₂O的投加浓度为210mg/L；

微量元素组分由H₃BO₃、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O和CuSO₄·5H₂O组成，大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中H₃BO₃的浓度为3.1mg/L、MnSO₄·4H₂O的投加浓度为11.15mg/L、ZnSO₄·7H₂O的投加浓度为4.3mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O的投加浓度为0.012mg/L、CuSO₄·5H₂O的投加浓度为0.125mg/L；

有机质组分由Na₂·EDTA、FeSO₄·7H₂O、环已六醇、维生素B₃、盐酸硫胺素、盐酸呲哆素、氨基乙酸组成，大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中Na₂·EDTA的浓度为37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O的投加浓度为27.8mg/L、环已六醇的浓度为100mg/L、维生素B₃的浓度为0.5mg/L、盐酸硫胺素的浓度为0.1mg/L、盐酸呲哆素的浓度为0.5mg/L、氨基乙酸的浓度为2mg/L；

大白花杓兰叶片再生植株生根培养基中吲哚丁酸的浓度为0.1mg/L、萘乙酸的浓度为0.05mg/L、蔗糖的浓度为0.5mg/L。

培养基中还包括苄氨基腺嘌呤、激动素、萘乙酸和蔗糖作为大白花杓兰叶片诱导分化培养基；其中，培养基中苄氨基腺嘌呤的浓度为1.0mg/L、激动素的浓度为0.1mg/L、萘乙酸的浓度为0.1mg/L、蔗糖的浓度为200mg/L。

培养基中还包括苄氨基腺嘌呤、激动素、萘乙酸和蔗糖作为大白花杓兰叶片继代培养基；其中，培养基中苄氨基腺嘌呤的浓度为0.05mg/L、激动素的浓度为0.2mg/L、萘乙酸的浓度为0.5mg/L、蔗糖的浓度为200mg/L。

本发明培养基用于大白花杓兰叶片的再生植株诱导培养，加入特定的激素分别形成诱导分化和继代培养基。利用野生珍稀花卉大白花杓兰幼叶作为外植体在本发明培养基上进行分化诱导、继代增殖、生根，从而获得再生植株，具有组织资源丰富，可快速、高效的繁育出大量种苗的特点。

利用本发明大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基对大白花杓兰幼叶进行再生植株诱导培养，大白花杓兰幼叶在本发明诱导分化培养基上很容易被诱导形成愈伤组织，愈伤组织诱导率可达到90％以上；再将诱导出的淡绿色愈伤组织转接至本发明继代培养基上进行继代培养，愈伤组织诱导成植株的几率高，再生植株诱导率(即植株分化率)可达70％。以MS培养基为基础培养基的再生植株诱导培养，大白花杓兰幼叶的植株分化率仅为50％。以1/2MS培养基为基础培养基的再生植株诱导培养，大白花杓兰幼叶的植株分化率仅为30％。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式获得大白花杓兰叶片再生植株：

一、大白花杓兰叶片的采集与处理

大白花杓兰采自黑龙江省江山娇实验林场，母本为多年生草本，生长健壮；外植体类型为当年生叶片，采集季节为大白花杓兰生长季节5月中上旬，采集时间选在晴朗的上午9～10点进行。将采集的叶片放置冷藏箱中备用。

二、消毒方法

将低温冷藏的叶片取出，先将叶片用洗涤剂作表面清洗，去除表面尘土，再清水冲洗，然后放在超净工作台上用75％的乙醇灭菌10s，再无菌水冲洗3～5次，之后用0.1％的升汞液消毒5min，再无菌水冲洗3～5次，而后放在滤纸上吸干表面水分备用。

三、用解剖刀将经过消毒处理的叶片分割成0.5～1cm×0.5～1cm小块，接种到培养基上，每瓶接种3～5个，每个处理重复3次。接种后采用光照培养和暗培养相结合的方法。光照培养光源采用日光灯，培养室内白天温度为24～28℃，照明12～14h，光照强度15μmol·m^-2·s^-1～20μmol·m^-2·s^-1，暗培养温度控制在24～26℃。先暗培养7d后转入光照培养。

大白花杓兰幼叶先在诱导分化培养基上被诱导形成愈伤组织，再将诱导出的淡绿色愈伤组织转接至继代培养基上进行培养。步骤四分成三组，第一组采用本发明大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基，第二组采用MS培养基，第三组采用1/2MS培养基，三组培养基中诱导分化、继代培养、生根培养采用相同的激素，且激素含量相同。

第一组培养基pH值为5.8。第一组大白花杓兰叶片再生植株生根培养基成分包括大量元素组分、微量元素组分、有机质组分、吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖；

大量元素组分由NH₄NO₃、KNO₃、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和CaCl₂·2H₂O组成，大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中NH₄NO₃的浓度为400mg/L、KNO₃的浓度为1050mg/L、KH₂PO₄的浓度为170mg/L、MgSO₄·7H₂O的投加浓度为370mg/L、CaCl₂·2H₂O的投加浓度为210mg/L；

微量元素组分由H₃BO₃、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O和CuSO₄·5H₂O组成，大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中H₃BO₃的浓度为3.1mg/L、MnSO₄·4H₂O的投加浓度为11.15mg/L、ZnSO₄·7H₂O的投加浓度为4.3mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O的投加浓度为0.012mg/L、CuSO₄·5H₂O的投加浓度为0.125mg/L；

有机质组分由Na₂·EDTA、FeSO₄·7H₂O、环已六醇、维生素B₃、盐酸硫胺素、盐酸呲哆素、氨基乙酸组成，大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中Na₂·EDTA的浓度为37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O的投加浓度为27.8mg/L、环已六醇的浓度为100mg/L、维生素B₃的浓度为0.5mg/L、盐酸硫胺素的浓度为0.1mg/L、盐酸呲哆素的浓度为0.5mg/L、氨基乙酸的浓度为2mg/L；

大白花杓兰叶片再生植株生根培养基中吲哚丁酸的浓度为0.1mg/L、萘乙酸的浓度为0.05mg/L、蔗糖的浓度为0.5mg/L。

培养基中还包括苄氨基腺嘌呤、激动素、萘乙酸和蔗糖作为大白花杓兰叶片诱导分化培养基；其中，培养基中苄氨基腺嘌呤的浓度为1.0mg/L、激动素的浓度为0.1mg/L、萘乙酸的浓度为0.1mg/L、蔗糖的浓度为200mg/L。

培养基中还包括苄氨基腺嘌呤、激动素、萘乙酸和蔗糖作为大白花杓兰叶片继代培养基；其中，培养基中苄氨基腺嘌呤的浓度为0.05mg/L、激动素的浓度为0.2mg/L、萘乙酸的浓度为0.5mg/L、蔗糖的浓度为200mg/L。

试验结果：

第一组愈伤组织诱导率均达到90％以上，再生植株诱导率(即植株分化率)为70％。

第二组愈伤组织诱导率均达到50％以上，再生植株诱导率(即植株分化率)为50％。

第三组愈伤组织诱导率均达到20％以上，再生植株诱导率(即植株分化率)为30％。

本发明大白花杓兰叶片再生植株诱导培养基中无机盐的浓度低于现有MS培养基、高于1/2MS培养基无机盐浓度，符合大白花杓兰叶片器官分化的需要，大幅提高了大白花杓兰叶片诱导再生植株的成功率，而且与MS培养基相比可节省约30％的成本。

实验对比发现第一组芽增殖明显高于第二组和第三组。

第一组获得的组培苗移栽植株生长与性状测定，种性纯度达98％以上，表现出高度一致性和丰产性，能够达到快速繁殖优良大白花杓兰种苗的目的。