一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法

摘要

本发明提供一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法；具体包括样品松质骨总蛋白的提取、蛋白浓度的测定、双向凝胶电泳分析、凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析、差异蛋白的MALDI‑TOF‑MS质谱分析以及蛋白质数据库检索及鉴定、确定差异蛋白、通过Western‑Blot、RT‑PCR对部分差异蛋白质进行鉴定并与血清中的差异蛋白ELISA检测结果互相验证，表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白可以用作肾阳虚证动物模型鉴定的生物标志物。本发明有助于为动物实验中肾阳虚证型提供鉴别指标，为进一步发现肾阳虚生物标志物提供了基础。

说明书

技术领域

本发明属于基础研究领域，具体涉及一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法。

背景技术

“证”是中医学理论体系的核心，中医临床首重辨证论治，但辨证很大程度上受医家自身（如对中医药知识的理解、临床经验等）及患者主观因素的影响，难以客观化和定量化，造成辨证结果不统一，影响治法的确立、选方用药及临床疗效的评价，阻碍中医学的研究及发展。中医基础研究中采用动物模型可以模拟疾病的真实过程，与“证”的生理和病理状态相似，因此借助肾阳虚证动物模型是研究肾虚证实质的必由之路。

本实验采用氢化可的松肌肉注射所模拟出的肾阳虚证模型大鼠的症状、体征和血清cAMP、cGMP含量检测及cAMP/cGMP比值结果符合目前常用的肾阳虚证模型的鉴定要求，表明本研究的肾阳虚模型制作是成功的，但以上评价方法以主观评价为主，评价指标缺乏特异性、客观性，研究结果能否科学阐明中医“证”的实质以及所复制的动物证候模型是否具有代表性，同样涉及辨证的客观化和定量化的问题。因此寻找具有一定特异性的客观指标来判别鉴定肾阳虚模型是否成功，是进行后续相关实验的关键。

基于中医“肾主骨”的理论，骨组织作为“肾”功能的外在表现部位之一，其内在生物学特征的变化与“肾”的功能状态必然存在着密切联系。蛋白质是体现组织细胞功能与执行生命活动最直接的活性物质，骨组织的结构与功能状态最终体现于其内在功能蛋白质组和基因组的表达状态。随着对疾病中医“证”与蛋白质组相关研究的深入，目前已经认识到：中医“证”的表现实质是疾病个体特定的功能蛋白质组及其基因组的表达水平；疾病不同中医证型之间区别的实质是功能蛋白质组及其基因组表达水平的差异。因此，通过对骨组织差异蛋白质组表达水平的检测，有望从骨组织功能蛋白质组层面上进一步揭示中医肾阳虚证候的实质。

基于以上理论基础与研究背景，本研究借助于蛋白质组学研究思路和技术上的优势，以大鼠的骨组织（松质骨）为研究对象，分别展示它们在肾阳虚与正常状态下松质骨的蛋白质组图谱，比较它们之间存在的差异表达蛋白质，从松质骨功能蛋白质组层面深入探讨中医肾阳虚证的实质，进一步深化对中医“肾”与骨内在关联的认识。同时，这些差异表达的蛋白质可能在肾阳虚证发生发展过程中发挥重要作用，可能是肾阳虚证诊断的潜在生物标志物。由于生物标记物的发现是冗长而又繁杂的过程，需借助多种实验技术，从多层面多角度反复鉴定、验证及确认。故对于初步筛选的差异蛋白，我们需要从蛋白水平、基因水平进一步对靶定蛋白进行验证，以规避单一实验方法的局限，保证前期蛋白质组学检验结果的准确性。如何选取感兴趣的候选蛋白，对其进一步研究，探讨其与肾阳虚证的密切联系，并同时证明本生物标志物筛选方法的可行性是本研究的重点。

当今科技正步入云媒体、大数据的时代，各种信息蜂拥而至，经云计算、大数据挖掘，一些功能强大、内容丰富、更新频繁的在线蛋白质相互作用数据库(PPI Database)应运而生，已成为研究预测蛋白质功能重要手段之一。本部分研究利用免费在线PPI Database–String10对前期所鉴定出已知蛋白进行系统综合分析，筛选候选蛋白作进一步研究。该数据库覆盖面广、整合度高、更新频率快，并能对蛋白质之间直接和间接相互作用的关系能做出一定的预测，从而可初步在生物信息学层面对所鉴定的差异蛋白在疾病中的作用进行预测，为对后续的验证性研究提供思路。借助于String数据库检索提供的生物学信息提示，同时我们查阅相关文献结合前期研究结果，我们推测肾阳虚证症状和体征的改变可能与某几个关键差异蛋白所在蛋白调控网络的调控密切相关。因此我们挑选了Ⅰ型胶原α-1链和GDP解离抑制因子1作为验证对象。

此外，在基础实验中，动物模型的骨骼标本不易获取，相对而言血标本获取较为便捷且容易保存。血液检测已是临床上预防和诊治疾病最普遍的辅助手段之一。血液几乎涵盖来自机体各器官组织的蛋白，既然在肾阳虚与正常大鼠骨组织（松质骨）之间存在差异蛋白质，那么在血液中是否也存在这种差异。鉴于此，我们还试图抽取两组实验大鼠血液测定相应蛋白质的含量，并分析其浓度与骨组织（松质骨）相应蛋白表达水平的一致性，参照临床上的“医学参考值范围”的定义：将肾阳虚大鼠模型的ELISA测定结果与正常组大鼠的数值进行比较，观察测定值是否超出了正常大鼠相应指标的波动范围，我们选用正态分布资料双侧95%参考值范围的公式（±1.96S）计算出正常组大鼠血清中相应蛋白含量的波动范围，作为判别测定结果的重要参考，探寻肾阳虚证诊断的潜在血液标志物。

基于以上所述，本研究以大鼠的骨组织（松质骨）为研究对象，在前期蛋白质组学实验基础上，选取在肾阳虚证发生发展过程中可能起到重要作用的差异蛋白质，使用Western-Blot和RT-PCR技术从蛋白及基因水平进行双重验证，进一步明确肾阳虚证的骨组织（松质骨）差异蛋白质。同时，采用ELISA测定相应蛋白在肾阳虚证与正常大鼠的血液中含量，为基础实验中肾阳虚证模型的评价奠定研究基础。

发明内容

本发明的目的是为克服目前肾阳虚证辨证技术未客观化的不足，应用双向凝胶电泳（2DE）及MALDI-TOF/MS技术，获取肾阳虚证及正常组大鼠骨组织蛋白图谱，经质谱分析及鉴定，筛选出松质骨中存在差异表达的蛋白，并且选取可能在肾阳虚证发生发展过程中发挥重要作用的部分蛋白进行Western-Blot和RT-PCR技术从蛋白及基因水平双重验证，并结合血清中相关蛋白的ELISA检测，最终靶定可以成为肾阳虚证动物模型的潜在生物标志物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及方法，其具体步骤如下：

（1）肾阳虚证大鼠模型的建立；用于构建动物模型的大鼠为WISTAR大鼠。

（2）差异蛋白的筛选。具体包括如下步骤：

a)大鼠松质骨总蛋白的提取；

b)测定蛋白浓度；

c)双向凝胶电泳分析；

d)凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析；

e)差异蛋白的MALDI-TOF-MS质谱分析；

f)蛋白质数据库检索及鉴定，确定差异蛋白。

（3）部分差异蛋白的验证。具体采用以下两种方法进行差异蛋白的验证：

a)应用Western-Blot方法从蛋白质水平对标志物进行验证；

b)应用RT-PCR方法从基因水平对标志物进行验证。

（4）肾阳虚证动物模型生物标志物的确定。其确定方法为：将血清蛋白的ELISA检测结果与Western-Blot、RT-PCR检测对比分析，选取表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白作为生物标志物。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

（1）根据中医“肾主骨”理论，以肾阳虚证状态下骨组织作为研究对象，采用蛋白组学等先进研究方法，深化了对“肾主骨”理论的科学认识。

（2）本发明建立在完整的蛋白组学方法基础之上，经过反复验证和筛选，挑选出的待测蛋白能反应肾阳虚证的病理本质。

（3）血液涵盖了几乎来自全身机体组织的蛋白质，因此血液检测是临床上最普遍的辅助诊疗手段之一；而ELISA技术可直接用于检测体液中大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。本发明将二者有机结合，筛选出的肾阳虚证的标志蛋白，可应用ELISA方法检测其在血液中含量，并运用正态分布资料双侧95%参考值范围的公式（±1.96S）计算出正常组大鼠血清中相应蛋白含量的波动范围，作为判别测定结果的重要参考，因此可十分简便高效地对实验动物肾阳虚的状态进行判断，筛选符合需求的动物模型。

（4）本发明可以进一步推动中医诊断的便捷、客观化，促进基础实验中动物模型的科学评定。

附图说明

图1正常组-肾阳虚组大鼠股骨干松质骨差异蛋白点标识。

图2 GDP解离抑制因子1（Arhgdia）的MAIDI-TOF-TOF/MS质谱图。

图3 Ⅰ型胶原α-1链（Col1a1）的MAIDI-TOF-TOF/MS质谱图。

图4正常组-肾阳虚组大鼠松质骨中Col1a1和Arhgdia 蛋白表达的比较。

图5正常组-肾阳虚组大鼠松质骨中Col1a1 mRNA表达的比较。

图6正常组-肾阳虚组大鼠松质骨中Arhgdia mRNA表达的比较。

图7正常组-肾阳虚组大鼠血清中Col1a1和Arhgdia含量表达的比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明内容进行详细说明：

实施例一：

肾阳虚证模型大鼠的建立和鉴定：

1 实验耗材

1.1 实验动物

雄性3月龄健康SPF（Specific Pathogen Free）级WISTAR大鼠共40只，体重200~240 g，由福建中医药大学实验动物中心代购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002，实验动物质量合格证编号：2007000548015。福建中医药大学实验动物中心实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2014-0001。

1.2 主要试剂及药物

表1 主要试剂及药物

1.3 主要仪器

表2 主要仪器

2 实验方法

2.1 动物分组

40只WISTAR大鼠适应性喂养一周，采用随机数字表法分为正常组、肾阳虚组，每组20只。肾阳虚大鼠连续造模15 d后，模型稳定观察21 d，两组大鼠均正常饲养。

2.2 肾阳虚证大鼠模型造模方法

2.2. 1 肾阳虚证大鼠模型

氢化可的松注射液充分混匀后，按照2.5 mg／100g比例于大鼠后肢肌肉注射，每日1次，正常饮食、饮水，连续15d。

2.3 大鼠模型鉴定及模型稳定性观察方法

2.3.1一般状态观察

观察模型大鼠一般状态、日常活动、精神状态、反应灵敏、弓背情况，毛发爪甲色泽，粪便质地等方面并记录大鼠体重与体温的变化。

2.3.2大鼠血清中环核苷酸系统的变化检测

造模结束时，取肾阳虚及正常组大鼠，乙醚麻醉后，眶后静脉丛进行采血1-1.5 ml。4℃冰箱放置4 h后，2000 rpm离心10 min取上清，使用cAMP和cGMP ELISA试剂盒检测大鼠血清中cAMP、cGMP含量。具体操作步骤按试剂盒说明书操作。

造模结束后21 d，腹主动脉采血3~5 ml。具体检测方法同造模结束时。

2.4 松质骨标本的获取

造模结束后21 d，取肾阳虚模型稳定大鼠及正常大鼠，腹腔麻醉，放血处死，在冰上快速切取各组大鼠双侧股骨髁，对半剖开股骨髁，刮匙刮取松质骨，放入5 ml EP管，标记后置于液氮罐中，快速转存于-80℃冰箱，备用。

实施例二：

差异蛋白的筛选，它包括以下步骤：

1.松质骨总蛋白的提取

①将冰冻新鲜股骨干用骨剪剪开，用超纯水将骨髓冲洗干净，并用刮匙将股骨干松质骨轻轻刮入研钵（提前液氮预冷）中，往研钵中加入液氮并迅速研磨粉碎，重复研磨3～5次，取粉末并称取质量，然后按照1 g骨组织加1.8 mL裂解液的比例加入蛋白样品裂解液，置于4℃冰箱裂解提取蛋白4 h（每隔1h充分混匀1次）；②将盛有骨组织混悬液的EP管置于低温高速离心机中，4℃ 100000 rpm离心1 h，吸取上清液；③加核酸酶：每1 ml裂解液加入2 ulDnase和2 ul Rnase，冰上放置15 min；④超声：用超声清洗仪超声致液体不黏稠为止。然后置低温高速离心机中，4℃ 100000 rpm离心30 min，吸取上清液；⑤2-D clean-up试剂盒提纯浓缩蛋白。

2 Bradford法测定蛋白浓度并计算上样蛋白体积

参照Bio-Rad公司Bradford蛋白定量试剂盒操作说明书操作，按照蛋白上样总质量为2500 ug计算所需蛋白样本体积为：2500ug/蛋白浓度。

表3 蛋白定量标准曲线上样体系

3.双向凝胶电泳

双向电泳主要参照美国Bio-Rad公司的2-DE操作指南进行操作。

3.1上样量及电泳条件 吸取（2500ug/蛋白浓度）蛋白样本与适量水化上样缓冲液充分混合，总体积为380 ul。胶条在20℃，50 V低电压条件下泡胀12 h后，进行等电聚焦。泡胀和等电聚焦参数见表4。

表4 IEF参数设置

3.2灌制12%的垂直板SDS-PAGE凝胶 按表5中配方比例配制凝胶溶液。

表5 12%SDS-PAGE凝胶配方

3.3胶条平衡 分别在胶条平衡缓冲液、中平衡润洗15分钟，滤干并转移至二向凝胶上。

3.4第二向SDS-PAGE凝胶电泳

设置循环水温度10℃进行SDS-PAGE，电泳条件为：接通电源，起初以100 V的恒电压40min，后换用300 V恒电压4.5 h进行电泳，当溴酚蓝跑至距凝胶底部约1 cm处时停止电泳。

4.凝胶染色与扫描显示

电泳结束后取出凝胶，并作好标记。考马斯亮蓝染色后用Image Scanner扫描仪获取2-DE凝胶图片。

5.凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析

利用Bio-Rad公司提供的PD Quest 8.0分析软件进行骨组织（松质骨）双向电泳凝胶图谱蛋白点检测及差异蛋白点显示分析。设置faint spot、small spot和large spot三个参数并去除背景及横纵条纹等进行蛋白点的自动检测。待检测完毕后，设置点的匹配分析参数，以点的体积作为蛋白点含量的测量值，设定蛋白点相对标准化体积变化达1.5倍以上作为差异蛋白点的匹配分析的基本参数并设置t检验达99%为有统计学意义。初步匹配完成后，进行手动人工校正，对每个匹配的蛋白点进行放大观察，以排除一些非真实的蛋白点。

6.质谱样品制备及差异蛋白的MALDI-TOF-MS质谱分析

将差异蛋白点手动切胶，酶解，除盐点样后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术定性各组间松质骨差异表达的蛋白质，并通过生物信息学检索对差异表达蛋白的功能进行初步分析。

7.蛋白质数据库检索及鉴定

使用MASCOT（V3.2，Matrix Science，London，U.K）搜库软件对每个差异蛋白样品的一级和二级质谱数据进行蛋白质数据库检索并鉴定蛋白质。

8 蛋白质相关功能的生物信息学检索

在Uniprot及NCBI蛋白质数据库中查找质谱鉴定得到的已知蛋白的相关信息，包括蛋白的基因名称、蛋白家族、氨基酸序列、主要功能等。

实施例三：

Western Blot和RT-PCR技术从蛋白及基因水平双重验证，它包括以下步骤：

1.各组大鼠股骨干松质骨相关蛋白的Western Blot的检测

1.1松质骨总蛋白的提取

从﹣80℃冰柜中每组随机抽取8只大鼠股骨干松质骨取出，置于冰上，迅速用咬骨钳将骨组织剪碎，放入事先预冷的研磨器中，迅速研磨至粉末状，研磨过程中适时加入液氮冷却，然后转移至Eppendorf管中，称取重量；按比例1 g骨组织加1 ml裂解液，微型涡旋器震荡5 s，而后置于4 ℃冰箱，每隔30 min涡旋震荡一次，4 h后取出；转入低温高速离心机中，设置程序4 ℃，14000 rpm，离心20 min，吸取上清液。

1.2 BCA法测定蛋白浓度

（1）配制蛋白标准溶品（25 mg/ml）：将0.8 ml蛋白标准配制液加入20 mg 牛血清蛋白（BSA）完全溶解后，分装备用；

（2）稀释蛋白标准品（0.5 mg/ml）：取适量配置好的蛋白标准品（25 mg/ml），用磷酸缓冲盐溶液（PBS）将其稀释至0.5 mg/ml浓度；

（3）配制BCA工作液：根据所需样品的数量，将BCA试剂A液、B液按50:1比例，充分涡旋混匀；

（4）按0，1，2，4，8，12，16，20 µl将标准品（0.5 mg/ml）依次加到96孔板蛋白标准品孔中，每孔补足PBS缓冲液至20 µl；

（5）加适当蛋白样品，用PBS缓冲液稀释5倍、10倍、20倍，每孔补足至20 µl；

（6）各孔均加入200 µl BCA工作液；

（7）37 ℃孵育30 min；

（8）测定波长570 nm，读取吸光度（OD）值；

（9）依据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

1.3松质骨总蛋白变性

取适量蛋白样品按5:1比例和SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（6×）涡旋混匀，置恒温金属浴100 ℃ 5 min，变性后迅速置于冰上冷却，存于-80 ℃冰箱备用。

1.4溶液的配制

（1）裂解液 取适量RIPA裂解液和PMSF（l00 mM）按99:1比例混合均匀，使PMSF的最终浓度为1 mM，冰上保存待用。

（2）电泳液 将5×的电泳液用超纯水稀释5倍，配成1×的电泳液。

（3）10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵加超纯水定容至1 ml，完全溶解混匀，现配现用；

（4）TBST洗涤液 将50 ml TBS（20×）和1 ml吐温一起置于烧杯中混匀，用超纯水定容至1 L，充分混匀，4 ℃冰箱保存备用。

（5）BeyoECL Plus工作液 按1:1比例分别取适量BeyoECL Plus A液和B液混匀，现配现用，操作时避光。

1.5 SDS-PAGE凝胶配制

按照表6依序加入相应体积的凝胶试剂，室温下凝固约20 min后，置于电泳液中存于4℃冰箱备用，一般提前一天配制SDS-PAGE凝胶。

表6 SDS-PAGE凝胶配制所需各成分体积（ml）

1.6上样 根据BCA测定的样品浓度，按每孔30 ug的加样量计算出样品所需上样体积，依次将待测蛋白缓慢匀速加样，并加入标准品Marker 4 ul。未上样的边缘孔加上SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（1×）10 ul。

1.7蛋白电泳 盖上电极盖，接通电源，初始以恒压20 V跑10 min确保孔道中漂浮的蛋白下沉，再以恒压60 V跑20 min，最后以80 V跑100 min，待溴酚蓝染料到达胶的底部，停止电泳。

1.8半干转 在恒定电压25 V下根据膜面积设定电流，整块胶限制电流1.3 A，1条胶时电流0.7 A。根据目的蛋白分子量调整转膜时长（见表7）；转膜结束后，将胶置于考马斯亮蓝染液染中摇床过夜，第二天将其脱色至透明，检查蛋白是否完全转移。

表7目的蛋白转膜时长

1.9膜的封闭 转膜结束后，用镊子夹marker处，取出PVDF膜标记好正面，用超纯水漂洗5 min ×3次，将PVDF膜放入装有5 ml封闭液的自封袋中，置于室温，水平摇床孵育2 h。

1.10一抗孵育 根据说明书见表8的一抗稀释倍数，用WB一抗稀释液稀释一抗，稀释后总体积约为5 ml，将封闭后的PVDF膜置于含有一抗工作液的自封袋中，在水平摇床上4℃孵育过夜。

表8 抗体稀释倍数

1.11二抗孵育 一抗孵育结束后，将膜放入装有TBST的洗膜盒中，在室温下水平摇床上漂洗5 min×3次；洗膜结束后，根据一抗来源配制相应二抗工作液，将膜置于二抗工作液中，在水平摇床上缓慢摇动、室温孵育1 h。

1.12ECL化学发光检测 二抗孵育结束后用TBST漂洗滤膜5 min×3次，洗去未结合的二抗。避光配制BeyoECL Plus工作液（A液：B液=1：1），充分混匀，在化学发光成像仪上将膜覆于显影垫片上，用滤纸将多余液体吸干，用滚轴去除膜下气泡，将显影液均匀滴于膜上，在室温中待膜与之反应1 min后显影。

1.13定量分析 采用Bio-Rad image lab 3.0软件分析蛋白条带，计算各组目的蛋白与相应β-actin蛋白显色积分的光密度比值，即各目的蛋白相对表达量。

2.各组大鼠股骨干松质骨相关蛋白的基因检测

2.1骨组织处理 骨组织研磨至粉末状过程同蛋白提取，迅速用1.5 ml无RNA酶Eppendorf管（以下Eppendorf管均为无RNA酶）沿钵底将骨粉抠出，称取约100 mg。

2.2用Trizol法提取总RNA

2.3总RNA浓度检测 在超微量核酸蛋白测定仪主画面点选Nucleic Acid，调零后，加1μl待测样品于侦测台上，测定260/280 nm的吸光度比值，得出所提取RNA的浓度。

2.4逆转录反应（Reverse Transcription，RT） 根据以上所测得总核糖核酸的浓度，计算出2 µg 总核糖核酸所需的上样体积V_RNA，按表9体系配制逆转录反应体系；于42>

表9逆转录反应体系

2.5引物的设计与合成

本实验所用目的基因引物、GAPDH RT-PCR引物合成均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成（表10）。

表 10 实验相关引物列表

2.6聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR） 严格按照PCR试剂盒说明书操作，将以上反应得到的cDNA用来配制PCR扩增体系（表11）。

表11 PCR扩增体系

注：2×AceTaqMaster Mix中包含Taq^TMDNA聚合酶、MgCl₂、dNTPs、反应缓冲液

将配制好的反应体系混匀离心后放入基因扩增仪中，按以下反应条件设置反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s（各体系退火温度为所加引物的退火温度），72℃延伸60s，35个循环；72℃终延伸10min，4℃下保存。

2.7琼脂糖凝胶电泳 取PCR产物各3 µl进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90 V，15min；电泳后染色并采用GEL DOC 2000凝胶成像系统Quantity One 465软件分析图像，得到相应蛋白表达的光密度值与对应内参照基因（GAPDH）光密度值的比值。

实施例四：

ELISA测定相关蛋白在正常与肾阳虚大鼠的血液中含量，包括以下步骤：

1.各组大鼠血清的制备

各组大鼠血清制备，同造模结束后21 d。见实施例一2.3.2。

2.各组大鼠血清中相关蛋白含量的检测

2.1.ELISA法主要试剂的配制：按照ELISA试剂盒说明书操作。

2.2.ELISA检测方法

（1）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl（样品最终稀释度为5倍）加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

（2）温育：用封板膜封板后置温育箱静置37 ℃ 40 min；

（3）洗板：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，向滤纸上印干；

（4）加酶：每孔均加入酶标试剂50 μl，除空白孔外；

（5）温育：方法同（2）；

（6）洗板：方法同（3）；

（7）显色：每孔均先后加入显色A、显色B各50 μl，轻轻震荡混匀，静置于温箱37 ℃ 避光孵育，显色15 min；

（8）终止：每孔均加入终止液50 μl，此时颜色转变由蓝转黄，终止反应；

（9）测定：以空白调零，测定波长450 nm，读取吸光度值。应在加终止液后15 min以内完成。

实施例五：

通过上述实验进行反复验证，将血清蛋白的ELISA检测结果与Western-Blot、RT-PCR检测结果对比分析，选取表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白差异蛋白作为肾阳虚证生物标志物。

上述试验可得如下实验结果：

1.动物模型的建立及鉴定结果

造模结束后21d内，肾阳虚组3只大鼠由于体质过于虚弱，采食及饮水量不足等因素，耗竭而亡。所以最后正常组数量不变，肾阳虚组余17只。造模结束后21d，与正常组大鼠比较，肾阳虚组大鼠依旧耳廓爪甲无血色，喜弓背蜷曲、扎堆，活动量少，便溏，体重减轻，体温降低，血清cAMP含量及cAMP/cGMP比值均下降。以上症状、体征和血清cAMP及cAMP/cGMP比值结果均符合肾阳虚证模型的鉴定要求，提示本实验动物造模是成功的。

2.差异蛋白筛选结果

2.1凝胶蛋白点差异的辨识与分析

2.1.1凝胶蛋白点的检测 通过Bio-Rad公司PDQuest软件分析，各凝胶蛋白图谱可辨识的蛋白点均为560个。

2.1.2凝胶蛋白点差异的辨识与分析 通过对正常组与肾阳虚组骨组织（松质骨）蛋白质组双向电泳凝胶图谱比较分析，检测到29个明显差异表达的蛋白质点，以正常组为参考，标记出差异表达的蛋白质点，点3、7均为下调表达蛋白（见图1）。

2.2差异蛋白的MALDI-TOF-MS质谱鉴定

将29个差异表达蛋白质点从凝胶上手工切下，经胰蛋白酶酶解消化后进行MALDI-TOF-MS质谱分析。获得的肽质量指纹图谱信号强且基线较平稳，噪音低，适于进行数据库检索。以下列举部分肽段的MS和MS/MS质谱图信息（见图2，3），使用MASCOT搜库软件进行蛋白质鉴定，表12为质谱鉴定的部分蛋白点相关信息，包括蛋白质的登记编码、种类、等电点、分子量、得分。

表12 部分差异蛋白点MALDI-TOF-MS鉴定结果

2.3差异蛋白相关功能的生物信息学检索

将质谱鉴定确立的差异蛋白质名称输入UniProt及NCBI蛋白质数据库中进行蛋白相关功能的生物信息学检索，结果详见表13。借助String数据库检索提供的生物学信息提示，同时我们查阅相关文献结合研究结果，我们推测肾阳虚证症状体征的改变可能与GDP解离抑制因子1、Ⅰ型胶原α-1链有关。

表13 部分蛋白质相关功能的生物信息学检索结果

3.正常组-肾阳虚组大鼠股骨松质骨中Colla1和Arhgdia蛋白表达的检测

3.1 Western bolt检测显示：与正常组比较，肾阳虚组Colla1表达降低，有显著性差异（P＜0.05）；与正常组比较，肾阳虚组Arhgdia表达降低，有显著性差异（P＜0.05）。见表14，图4。

表14两组大鼠松质骨中Col1a1和Arhgdia蛋白表达的比较（±S）

注：与正常组比较，a>＜0.05。

3.2 正常组-肾阳虚组大鼠股骨干松质骨Col1a1和Arhgdia mRNA表达的检测

两组均可见Colla1的mRNA的表达。与正常组比较，肾阳虚组大鼠Colla1表达下降，有显著性差异(P＜0.05)；与正常组比较，肾阳虚大鼠Arhgdia表达下降，有显著性差异(P＜0.05)。见表15，图5、6。

表15 两组大鼠松质骨中Col1a1和Arhgdia mRNA表达的比较（±S）

注：与正常组比较，a>＜0.05。

3.3 正常组-肾阳虚组大鼠血清中Col1a1和Arhgdia含量的检测

ELISA方法检测正常组及肾阳虚组大鼠血清中Colla1含量测定情况显示：两组均可检测定出Colla1的表达。与正常组比较，肾阳虚大鼠Colla1表达下降，有显著性差异(P＜0.05)>P＜0.05)。见表16，图7。

表16 两组大鼠血液中Col1a1和Arhgdia 蛋白表达的比较（±S）

注：与正常组比较，a P＜0.05。

3.4 正常组大鼠血清中Col1a1、Arhgdia含量的参考值范围

根据正常组中三个蛋白的ELISA检测结果，我们计算出参考值范围。见表17。

表17 大鼠血液中Col1a1、Arhgdia的含量的参考值范围（pmol•mL^-1）

4. 初步筛选确认可用作肾阳虚证标志物的蛋白。

经过Western blot和RT-PCR验证结果表明：在肾阳虚及正常组大鼠松质骨骨组织中，Colla1、Arhgdia在蛋白及基因水平表达趋势均与前期蛋白质组学结果一致，表现为：肾阳虚组中Colla1、Arhgdia呈显著性低表达。表明前期研究结果的准确性可靠性，可作为肾阳虚证在骨组织中的生物标志物。

ELISA检测结果表明，在外周血中Colla1及Arhgdia与股骨干松质骨中蛋白表达一致，与正常组比较有显著性差异，含量均低于正常参考值范围，提示Colla1及Arhgdia下降可能与肾阳虚证密切相关，可以作为肾阳虚证诊断的血液潜在标志物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的蛋白筛选及确定，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建中医药大学

<120> 一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagacgcca gtagactcca cgac 24

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