一种测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的方法

摘要

本发明属于污染物测定技术领域，公开了一种测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的方法，主要步骤为：将作物可食部分冷冻、干燥、粉碎后作为样品，向样品中加入内标物混匀，然后加入解离剂进行解离反应，再加入四丁基硫酸氢氨和碳酸钠缓冲液，充分混匀后加入甲基叔丁基醚进行超声萃取，得萃取质；萃取质经装有石墨炭黑的WAX小柱固相萃取净化后，得上样检测液，再将上样检测液采用HPLC‑MS‑MS方法进行测定。本发明所述方法回收率高、精密度好、灵敏度高，且抗复杂基质干扰，同时适用于谷物类、根菜类、叶菜类、果菜类中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的测定。

说明书

技术领域

本发明涉及污染物测定技术领域，具体地，涉及一种测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的方法。

背景技术

由于具有极高的持久性、生物蓄积性和毒性，全氟化合物(PFCs)作为新型有机污染物引起了国际社会的极大担忧。全氟磺酸(Perfluoroalkyl sulfonic acids，PFSAs)是一类典型的全氟化合物，其分子中与碳原子连接的氢原子全部被氟原子取代，且在碳链端部连着一个磺酸基。PFSAs具有高惰性、稳定性及高表面活性，因此在过去的60年里，其被广泛作为表面活性剂、灭火泡沫、食品容器材料、及衣物、化妆品等的添加剂使用；致使大量PFSAs进入环境，并在各种环境介质、野生动物和人体中检出。PFSAs对人体有较高的毒性，可引起免疫毒性、内分泌干扰、甚至致癌性等。因此PFSAs，尤其是其频繁检出、毒性最大的同系物全氟辛磺酸(PFOS)已引起国际社会高度关注。挪威规定在纺织品、浸渍剂、灭火剂中PFOS的含量不能高于0.005％。欧盟则从2008年6月起就禁止使用PFOS及其前驱物。2009年，斯德哥尔摩会议将PFOS列入新的优控物质名单。之后，欧盟食品安全署把全氟化合物包括全氟磺酸化合物定义为食物链中的新型污染物，并规定PFOS在人体中的日耐受剂量为0.15μg/kg/d。同时，欧盟食品安全署呼吁其成员国应监控环境中的PFOS及其同系物和前体物质。

PFSAs具有高水溶性，因此其通过工业排放、污泥农用、污水灌溉和大气干湿沉降等方式进入农田土壤系统后，极易被作物吸收积累，进而通过食物链威胁人体健康。前人研究显示谷物、蔬菜、牧草等均可从污染土壤中吸收积累PFSAs，且土壤程度越重，作物吸收积累越多，同时作物地上部积累的PFOS含量大于其储存部分的含量。不同作物对PFSAs的富集能力有所不同，富集系数(作物浓度/土壤浓度)可高达3.8。需要注意的是，除了从污染土壤中积累外，作物还可从食物加工过程及食品包装材料中吸收积累PFOS。因此PFSAs可通过食物链(食用作物)显著威胁人体健康。

目前有关土壤-作物系统中PFSAs含量水平、污染特征、风险评价方面等方面的研究尚鲜见报道。这主要与作物尤其是其可食部分PFSAs含量多为痕量水平(ng/g)且作物基质成分(如糖类、叶绿素等)复杂对分析测定有较大干扰有关。同时现有的关于作物中PFSAs的分析方法主要针对一类或两类作物建立，针对多类作物(包括谷物类、根菜类、叶菜类、果菜类)尤其是其可食部分的抗基质效应且适用性强的分析方法尚未见报道。

因此，亟需建立一种高效、灵敏且广泛适用于多类作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸测定的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的。

一种测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的方法，包括如下步骤：

S1.样品的萃取与纯化：将作物可食部分冷冻、干燥、粉碎后作为样品，向样品中加入内标物混匀，然后加入解离剂进行解离反应，再加入四丁基硫酸氢氨和pH调节缓冲液，充分混匀后加入甲基叔丁基醚进行超声萃取，得萃取质；萃取质经装有石墨炭黑的WAX小柱固相萃取净化后，得上样检测液，其中，四丁基硫酸氢氨与样品的体积质量比为4～10mL：1g，甲基叔丁基醚与样品的体积质量比为10～20mL：1g；

S2.上样检测液采用HPLC-MS-MS方法进行测定。

本发明中使用的活性石墨碳黑(ENVI-Carb)可通过π-电子作用吸持芳环类物质(如叶绿素等)，但却与富含C-F键的PFSAs化合物无相互作用，因此，在固相萃取净化的基础上，进一步采用ENVI-Carb净化，可有效去除作物基质成分，提高目标PFSAs化合物的回收率。本发明通过将石墨炭黑直接装载于WAX小柱中，使固相萃取净化过程和ENVI-Carb的吸附过程同时在WAX小柱中完成，高效快捷，不同于现有技术中分别使用石墨碳黑小柱和固相萃取柱进去吸附和萃取。

优选地，所述石墨炭黑的用量为10～50mg。

更优选地，所述石墨炭黑的用量为10mg。

优选地，所述作物为谷物类、根菜类、叶菜类和果菜类中的一类或多类。

更优选地，所述谷物类为大米，根菜类为胡萝卜，叶菜类为生菜、白菜、芥菜或芹菜中的一种或多种，果菜类为南瓜。

优选地，所述解离剂为KOH或NaOH。

更优选地，所述解离剂为0.5M的氢氧化钠，氢氧化钠与样品的体积质量比为2～5mL：5g。

优选地，所述内标物为¹³C₄-PFOS。

优选地，所述萃取为加入甲基叔丁基醚进行超声萃取2～4次。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

S1.样品的萃取与纯化：将作物可食部分冷冻、干燥、粉碎后作为样品，向样品中加入内标物¹³C₄-PFOS混匀，然后加入0.5M的氢氧化钠进行解离反应6～10h，再加入四丁基硫酸氢氨和pH值为10的碳酸钠缓冲液，充分混匀后加入甲基叔丁基醚进行超声萃取，得萃取质；萃取质经装有10～50g石墨炭黑的WAX小柱固相萃取净化后，得上样检测液，其中，四丁基硫酸氢氨与样品的体积质量比为4mL：1g，甲基叔丁基醚与样品的体积质量比为10mL：1g；氢氧化钠与样品的体积质量比为2mL：5g。

S2.上样检测液采用HPLC-MS-MS方法进行测定。

更优选地，色谱条件为：进样量5μL，4.6×100mm，内径2.7μm的C₁₈柱，色谱分离，分离模式为梯度洗脱，洗脱液为甲醇-乙酸铵，甲醇在乙酸铵(10mM)中的线性梯度过程为3％开始(保留0.5min)，6min升至95％，9.5min时降回3％，总色谱时间12.5min；质谱条件为：电喷雾ESI离子源，负离子扫描，多离子反应检测模式(MRM)，气帘气氮气200psi，喷雾电压-4500V，雾化温度550℃，雾化气压力50psi，加热辅助气压力50kPa，碰撞气CAD为high。

作为一种优选地实施方式，所述测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的方法具体包括如下步骤：

S1.样品制备：将作物可食部分样品冷冻、干燥、研磨混匀；

S2.样品萃取和净化：取0.5g样品于离心管，加入50μL内标物质¹³C₄-PFOS，使其浓度为100ng/mL，混匀后加入0.2mL氢氧化钠(NaOH，0.5M)解离8h。之后加入2mL离子配对剂四丁基硫酸氢氨(TBA，0.25M)和4mL碳酸钠缓冲液(pH＝10)，涡旋2min后，加入5mL甲基叔丁基醚(MTBE)进行超声萃取10min，之后8000r/min离心分离10min，上清液转移至离心管，残渣再以MTBE超声萃取两次，合并三次萃取液以氮吹浓缩至1mL，即获得萃取质；将获得的浓缩萃取质用3mL高纯水稀释后引入装载了10mg石墨炭黑(ENVI-Carb)的WAX小柱进行固相萃取净化(净化前需用5mL甲醇和5mL高纯水活化)，之后再用高纯水润洗盛放萃取质的聚丙烯管2次，每次3mL高纯水，将润洗液也引入WAX小柱，上述过程的流出液均弃掉，之后依次用4mL甲醇和4mL体积分数为0.1％的氨水甲醇进行洗脱，收集洗脱液，用氮气浓缩至近干，重新定容于1mL甲醇，涡旋30s，过Pall-GHP滤膜(0.22μm)后备测。

S3.样品测定：采用高效液相色谱串联质谱仪(HPLC-MS-MS)测定步骤S2的前处理样品，获得PFOS和PFHxS的峰面积。色谱条件为：进样量5μL，C₁₈柱(4.6×100mm，内径2.7μm)色谱分离，分离模式为梯度洗脱，洗脱液为甲醇-乙酸铵，甲醇在乙酸铵(10mM)中的线性梯度过程为3％开始(保留0.5min)，6min升至95％，9.5min时降回3％，总色谱时间12.5min。质谱条件为：电喷雾ESI离子源，负离子扫描，多离子反应检测模式(MRM)，气帘气氮气200psi，喷雾电压-4500V，雾化温度550℃，雾化气压力50psi，加热辅助气压力50kPa，碰撞气CAD为high。

S4.根据步骤S3获得PFOS、PFHxS峰面积，以内标法进行定量。

另外，上述测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的方法在研究作物可食部分中全氟磺酸类化合物含量水平、污染特征、风险评价方面的应用亦在本发明保护范围内。

与现有技术变比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述方法回收率高、精密度好、灵敏度高，可抗基质成分干扰；本发明所述方法适用范围广，同时适用于谷物类、根菜类、叶菜类、果菜类可食部分全氟辛磺酸和全氟己磺酸的测定；本发明所述方法中全氟磺酸类化化合物的检出限为0.004～0.025ng/g(根、叶、果菜可食部分，鲜重)和0.031～0.130ng/g(谷物，鲜重)。

附图说明

图1为不同萃取剂对作物可食部分全氟辛磺酸和全氟己磺酸萃取回收率的影响。

图2为不同净化柱对作物可食部分全氟辛磺酸和全氟己磺酸萃取回收率的影响。

图3为不同活性炭黑用量对作物可食部分全氟辛磺酸和全氟己磺酸萃取回收率的影响。

图4为全氟辛磺酸和全氟己磺酸在溶剂(甲醇)、作物谷物(大米)、根菜(胡萝卜)、叶菜(生菜)和果菜(南瓜)中的色谱图，溶剂及作物中各全氟磺酸化合物的浓度分别为5ng/mL和5ng/g。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明所述高效测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的分析方法及其应用的思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明的保护范围，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1作物中2种全氟磺酸化合物(PFOS、PFHxS)前处理方法的优化

以叶菜类作物(生菜)可食部分为供试样品，通过加标回收率实验(10ng/g)考察萃取剂种类、净化柱种类及活性石墨碳黑用量对作物可食部分全氟磺酸化合物(PFOS、PFHxS)回收率的影响，从而获得优化的前处理方法。考察的萃取剂包括如下3种：TBA配对-MTBE萃取(TBA-MTBE)、乙腈/水混合溶液(90:10，v/v)和四氢呋喃(THF)/水混合溶液(75:25，v/v)；考察的净化柱包括WAX小柱、HLB小柱和弗罗里硅土小柱(Florisil)，考察的石墨碳黑用量包括0、10、25、50mg。

1.回收率实验的具体实施过程

(1)加标样品制备：生菜可食部分样品经冷冻、干燥、研磨混匀后，取一定量的样品向其中加入全氟磺酸化合物(PFOS、PFHxS)标准储备液(1000μg/L)，使样品加标浓度为10ng/g。

(2)样品萃取和净化：取0.5g加标样品于聚丙烯离心管，加入50μL内标物质(即¹³C₄-PFOS，100ng/mL)，混匀后加入0.2mL氢氧化钠(NaOH，0.5M)解离8h。之后加入2mL离子配对剂四丁基硫酸氢氨(TBA，0.25M)和4mL碳酸钠缓冲液(pH＝10)，涡旋2min后，加入5mL甲基叔丁基醚(MTBE)进行超声萃取(10min)，之后离心分离10min(8000r/min)，上清液转移至15mL聚丙烯管，残渣再以MTBE超声萃取两次，合并三次萃取液以氮吹浓缩至1mL，即获得萃取质；用3mL高纯水稀释后萃取质后，于装载了10mg石墨炭黑(ENVI-Carb)的WAX小柱进行固相萃取净化(净化前需用5mL甲醇和5mL高纯水活化)，之后再用高纯水润洗盛放萃取质的聚丙烯管2次，每次3mL高纯水，收集润洗液，同样于WAX小柱净化，弃掉上述过程的流出液，之后依次用4mL甲醇和4mL体积分数为0.1％的氨水甲醇进行洗脱，收集洗脱液，用氮气浓缩至近干，重新定容于1mL甲醇，涡旋30s，过Pall-GHP滤膜(0.22μm)，采用高效液相色谱串联质谱仪(HPLC-MS-MS)测定，获得PFOS和PFHxS的峰面积，并与内标物质比较以内标法进行定量。回收率以加标样品的测定值及其加标浓度比较获得，精密度则以加标样品(n＝5)的相对标准偏差表示。

2.结果

(1)如图1所示，以乙腈/水作萃取剂时PFHxS的回收率较差(141％)，而当以THF/水或TBA-MTBE萃取时，则两种目标全氟磺酸化合物的回收率均较好(78.3％～101.4％)。特别地，对于PFHxS而言，以TBA-MTBE萃取时回收率最好，这与带正电的TBA与带负电的目标全氟磺酸化合物形成中性离子配对物，易被低极性溶剂MTBE萃取有关。因此本方法以TBA-MTBE作为萃取剂。

(2)由图2可知，当以HLB小柱或Florisil小柱为净化柱时，PFHxS的回收率(146.4％～147.8％)和精密度(22.0％～55.3％)均较差，但与此不同；以二者为净化柱时，PFOS的回收率(82.2％～82.3％)和精密度(11.5％～31.6％)均较好。当以WAX小柱为净化柱时，两种目标全氟磺酸化合物均获得满意的回收率(70.4％～75.9％)和精密度(5.0％～11.5％)。这与WAX小柱的固相萃取分离机理包括反相色谱及阴离子交换，有利于有机阴离子高效分离、萃取有关。故本方法以WAX小柱为净化柱。

(3)由图3可知，与未使用ENVI-Carb相比(51.6％～82.9％)，使用ENVI-Carb(10～50mg)显著提高了目标PFSAs化合物的回收率(33.7％～48.1％)。然而，随着ENVI-Carb用量的增加，各目标PFSAs化合物的回收率显著下降，这可能与过量使用ENVI-Carb造成的目标PFSAs化合物共吸附作用有关。故本发明ENVI-Carb使用量为10mg。为进一步减少分离等过程造成的目标化合物损失，本发明直接将10mg ENVI-Carb装载于WAX萃取小柱，使得固相萃取净化过程和ENVI-Carb吸附净化过程同时在WAX小柱中完成。

通过实施例1的实施，提供了测定作物中2种目标PFSAs化合物(PFOS、PFHxS)的主要优化前处理方法，即以TBA-MTBE萃取，以载有ENVI-Carb(10mg)的WAX小柱进行净化。

实施例2优化前处理方法对不同种类作物可食部分的适用性验证

以谷物类作物(大米)、根菜(胡萝卜)、叶菜(生菜)、果菜(南瓜)的可食部分为供试材料，通过不同浓度加标回收率实验(0.5、10、25、50ng/g)考察实施例1建立优化前处理方法的适用性。

1.本实施例的具体实施过程

(1)样品制备：不同种类空白作物(大米、胡萝卜、生菜、南瓜)的可食部分样品分别经冷冻、干燥、研磨混匀后，储存于4℃冰箱中备用。

(2)各作物可食部分目标PFSAs化合物标准曲线的配置：分别取出不同种类空白作物可食部分样品，经过“实施例1中样品萃取和净化”过程，获得各作物可食部分的萃取基质。之后分别以各作物可食部分基质稀释目标PFSAs化合物标准储备液(1000μg/L)，获得各作物可食部分的系列基质加标样(0.5、1、2.5、5、10、25、50ng/mL)，以高效液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱仪(HPLC-Q-TRAP)测定，以内标法进行定量分析，并通过线性回归分析获得各作物可食部分的基质标线。由于各作物空白样品中均未检出目标PFSAs化合物，故目标PFSAs的方法检出限为其在各基质中的最小检出量，即3倍信噪比对应的检出浓度。

(2)目标PFSAs化合物选择性验证：分别取出不同种类空白作物样品，经过“实施例1中样品萃取和净化”过程，获得各作物可食部分的萃取基质。之后分别以各作物可食部分基质稀释目标PFSAs化合物标准储备液(1000μg/L)，获得各作物可食部分的基质加标样(5ng/g)，后以高效液相色谱串联质谱仪(HPLC-MS/MS)进行色谱分离、测定，根据所得色谱图中目标PFSAs化合物的分离度及其受基质杂峰干扰的程度判断本方法的选择性。

(2)目标PFSAs化合物回收率及精密度验证：分别取出不同种类空白作物可食部分样品，向其中分别加入目标PFSAs化合物标准储备液(1000μg/L)，获得各作物可食部分的不同浓度加标样品(0.5、10、25、50ng/g)，按照“实施例1所述的萃取和净化过程”进行前处理后，采用高效液相色谱串联质谱仪(HPLC～MS/MS)测定，并以内标法进行定量分析，回收率则以加标样品测定浓度与其加标浓度比较获得，精密度则由同一浓度加标样品测定值(同一浓度设置5个平行样)的相对标准偏差表示。

2.结果

(1)由表1可知，目标PFSAs化合物在0.5～50ng/mL均表现出满意的线性(R²>0.997)。目标PFSAs化合物在各作物可食部分基质中的方法检出限则为0.020～0.150ng/g(干重)，考虑到各作物的含水率(7％～99.5％)，则可计算出目标PFSAs合物在各作物鲜样可食部分基质中的方法检出限，即0.004～0.025ng/g(根、叶、果菜可食部分，鲜重)和0.031～0.130ng/g(大米，鲜重)。可见本发明所述方法可测定多种作物可食部分基质中ng/g级别的痕量PFSAs化合物(PFOS、PFHxS)，具有高灵敏度。

表1不同作物可食部分基质中PFOS和PFHxS的线性范围和检出限

注：^a为干重，表示为dw，^b为鲜重，表示为fw。

(2)由图4所示，目标PFSAs化合物在混标样中(5ng/mL)及各基质空白加标样(5ng/g)均可根据其保留时间和特征离子(m/z)有效分离，且在各作物可食部分基质空白加标样中未检出干扰目标PFSAs化合物具有的色谱峰，可见本发明提供方法具有较高的分离度和选择性。

(2)由表2可知，各作物可食部分基质中目标PFSAs化合物不同浓度(0.5、10、25、50ng/g)的加标回收率均在70.9％～114.6％之间，且相对标准偏差小于11.5％，符合国际准则(DG345SANCO/12459/2011)的要求(回收率70％～120％，相对标准偏差小于20％)。可见“实施例1”建立的优化前处理方法具有抗复杂基质的能力，在多种作物可食部分基质(谷物类、根菜、叶菜、果菜)中均有较好的适用性。

表2不同作物可食部分基质中PFOS和PFHxS的回收率(n＝5)和相对标准偏差

实施例3建立方法对实际样品的测定

为验证本发明方法的可行性，以此方法进行实际样品测定。实际样品采自我国南方某大城市氟化工厂周边的农田，所采样品包括白菜(2种)、生菜(7种)、芥菜(9种)、小白菜(3种)和芹菜(3种)。按照实施例1和实施例2的具体实施过程进行上述样品可食部分PFSAs(PFOS、PFHxS)的分析测定，同时测定上述样品可食部分的加标质控样(0.5、10、25、50ng/g)。测定结果如表3-1，3-2所示，实际样品可食部分的加标回收率为81～105％，相对标准偏差低于12％。目标PFSAs(PFOS、PFHxS)化合物在白菜(检出率50％)、生菜(检出率14％～57％)和小白菜(50％)中不同程度检出，检出总浓度为0.12～0.16ng/g。然而目标PFSAs(PFOS、PFHxS)化合物在芥菜和芹菜中的浓度均低于方法检出限。值得注意的是，检出样品中，以PFOS检出浓度较高，这与其较PFHxS使用更为广泛以及其普遍在农田土壤和灌溉水中检出有关。本实施例显示本方法具有较高的可行性和实用性。

表3-1实际样品(白菜、生菜、芥菜)中PFHxS和PFOS的检出浓度

表3-2实际样品(小白菜、芹菜)中PFHxS和PFOS的检出浓度

综上所述，本发明提供了一种测定作物可食部分全氟辛磺酸(PFOS)和全氟己磺酸(PFHxS)的高效分析方法，其以TBA-MTBE萃取，以载有ENVI-Carb(10mg)的WAX小柱固相萃取净化，以HPLC-MS/MS进行样品测定，以作物可食部分基质配置系列梯度标准曲线，并通过内标法进行定量。该方法可靠、精密、灵敏度高、抗复杂基质干扰能力强，可为开展土壤-作物系统中全氟磺酸化合物(PFOS和PFHxS)的污染特征和风险水平的研究提供可靠分析方法。

实施例4

一种测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的方法，包括如下步骤：

(1)样品制备：将待测生菜可食部分经冷冻、干燥、研磨混匀后，储存于4℃冰箱中备用。

(2)样品萃取和净化：取1g样品于聚丙烯离心管，加入50μL内标物质(即¹³C₄-PFOS，100ng/mL)，混匀后加入2mL氢氧化钠(NaOH，0.5M)解离6h。之后加入7mL离子配对剂四丁基硫酸氢氨(TBA，0.25M)和4mL碳酸钠缓冲液(pH＝10)，涡旋2min后，加入15mL甲基叔丁基醚(MTBE)进行超声萃取(10min)，之后离心分离10min(8000r/min)，上清液转移至15mL聚丙烯管，残渣再以MTBE超声萃取两次，合并三次萃取液以氮吹浓缩至1mL，即获得萃取质；用3mL高纯水稀释后萃取质后，于装载了10mg石墨炭黑(ENVI-Carb)的WAX小柱进行固相萃取净化(净化前需用5mL甲醇和5mL高纯水活化)，之后再用高纯水润洗盛放萃取质的聚丙烯管2次，每次3mL高纯水，收集润洗液，同样于WAX小柱净化，弃掉上述过程的流出液，之后依次用4mL甲醇和4mL体积分数为0.1％的氨水甲醇进行洗脱，收集洗脱液，用氮气浓缩至近干，重新定容于1mL甲醇，涡旋30s，过Pall-GHP滤膜(0.22μm)，待用。

(3)样品测定：同实施例1和实施例2。

实施例5

一种测定作物可食部分中全氟辛磺酸和全氟己磺酸的方法，包括如下步骤：

(1)样品制备：生菜可食部分样品经冷冻、干燥、研磨混匀后，储存于4℃冰箱中备用。

(2)样品萃取和净化：取1g样品于聚丙烯离心管，加入50μL内标物质(即¹³C₄-PFOS，100ng/mL)，混匀后加入1.2mL氢氧化钠(NaOH，0.5M)解离10h。之后加入10mL离子配对剂四丁基硫酸氢氨(TBA，0.25M)和4mL碳酸钠缓冲液(pH＝10)，涡旋2min后，加入20mL甲基叔丁基醚(MTBE)进行超声萃取(10min)，之后离心分离10min(8000r/min)，上清液转移至15mL聚丙烯管，残渣再以MTBE超声萃取两次，合并三次萃取液以氮吹浓缩至1mL，即获得萃取质；用3mL高纯水稀释后萃取质后，于装载了10mg石墨炭黑(ENVI-Carb)的WAX小柱进行固相萃取净化(净化前需用5mL甲醇和5mL高纯水活化)，之后再用高纯水润洗盛放萃取质的聚丙烯管2次，每次3mL高纯水，收集润洗液，同样于WAX小柱净化，弃掉上述过程的流出液，之后依次用4mL甲醇和4mL体积分数为0.1％的氨水甲醇进行洗脱，收集洗脱液，用氮气浓缩至近干，重新定容于1mL甲醇，涡旋30s，过Pall-GHP滤膜(0.22μm)，待用。

(3)样品测定：同实施例1和实施例2。