一种单纯疱疹病毒I型和II型抗原联检试剂盒

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒I型和II型抗原联检试剂盒。所述试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线和质控线的反应膜，所述反应膜靠近检测线的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，所述反应膜靠近质控线的一端叠加粘贴有吸收垫，所述反应膜上有两条检测线，分别包被了单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体，所述反应膜上质控线包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠源抗单纯疱疹I型和II型单克隆抗体。本发明试剂盒可快速联检单纯疱疹病毒I型和II型抗原，并且检测结果灵敏度、准确度高，稳定性好，特异性强。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒I型和II型抗原联检试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)属于人类疱疹病毒α亚科，是DNA双链病毒，人类是其唯一自然宿主。根据其抗原性质的不同，可分为单纯疱疹病毒I型(HSV-1型)型和单纯疱疹病毒II型(HSV-2型)，两者之间的基因同源序列约为50％。HSV-1型多感染口、面、眼等腰部以上部位，而HSV-2型则通常感染生殖器及肛周等腰以下部位。疱疹的典型临床表现出皮肤粘膜上出现集簇性水疱、脓疱。溃疡和结痂。

生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒感染泌尿生殖器及肛门部位皮肤粘膜而引起的一种常见性转播疾病。在生殖器疱疹的病原体中，HSV-2型约占80％，HSV-1型约占10～40％。

近年来，生殖器部位溃疡性疾病的发病率大幅上升，其中，可供临床普遍应用的疱疹诊断试剂非常缺乏。目前，疱疹的诊断仍主要依靠医生的临床经验，或通过排除梅毒的实验诊断方法来进行间接诊断，误诊率好，常延误患者的及时准确治疗。并且目前常用的方式是分别单独检测单纯疱疹病毒I型和II型，再综合分析检测结果，但是这样的操作过程繁琐，因此有必要研发一种可以快速联检单纯疱疹病毒I型和II型抗原的方法。

目前，单纯疱疹病毒的实验室诊断方法有细胞培养、抗原检测、PCR、血清抗体检测等。细胞培养及PCR方法对实验场地等实验条件及人员的要求较高，均不能在大部分的实验室开展。检测抗原的直接免疫荧光或ELISA方法均需依赖相应的仪器设备，而且试剂多为进口，价格昂贵。血清抗体或抗原检测如常用的胶体金免疫层析法，其特异性强、灵敏度高、操作简捷等优点而并广泛应用，但是胶体金免疫层析法的反应过程是一个由胶体金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程，在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败，其中制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在胶体金免疫层析法快速试验中非常关键。如果胶体金颗粒直径的变异范围太大就会影响到检测的稳定性和重复性，如果胶体金颗粒的形状不规则或粒径不均一，使得胶体金标记颗粒容易解离和沉淀而产生胶体金标记颗粒扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象。胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是柠檬酸三钠法，其原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的柠檬酸三钠使金离子还原成金原子。柠檬酸三钠还原法作为制备胶体金的经典方法，工艺简便，成本低廉，但在实际应用过程中很容易出现颗粒聚集、颗粒大少不均一等不足，严重影响胶体金在免疫分析中的应用。颗粒均一、单分散性胶体金的制备与还原剂的加入量、反应时间、pH值、加热方式等因素有密切的关系。另外，由于胶体金具有强烈的电荷性，通过静电吸附抗体或蛋白，在pH等变化下，很容易造成抗体和蛋白的脱离，并且吸附抗体或蛋白后的胶体金不稳定，导致试剂盒的稳定性和灵敏性无法保障。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题(如柠檬酸三钠法制得的胶体金颗粒的形状不规则或粒径不均一，导致胶体金的应用效果不佳，影响检测过程和结果等)，本发明提供了一种单纯疱疹病毒I型和II型抗原联检试剂盒，该试剂盒可快速联检单纯疱疹病毒I型和II型抗原，并且检测结果灵敏度、准确度高，稳定性好，特异性强。

本发明提供的一种单纯疱疹病毒I型和II型抗原联检试剂盒，所述试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线和质控线的反应膜，所述反应膜靠近检测线的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，所述反应膜靠近质控线的一端叠加粘贴有吸收垫，所述反应膜上有两条检测线(T₁线和T₂线)，分别包被了单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体，所述反应膜上质控线(C线)包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠源抗单纯疱疹I型和II型单克隆抗体；

所述反应膜由以下方法制得：用缓冲液将单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体分别稀释至包被浓度为0.8～1.2mg/mL，将羊抗鼠IgG抗体稀释至包被浓度为1.5～1.8mg/mL，在反应膜上分别划线单纯疱疹病毒I型、II型多克隆抗体检测线和羊抗鼠IgG抗体质控线，划线后将反应膜置于干燥间，温度20～25℃，湿度小于30％，干燥4～5小时；

所述胶体金垫由以下方法制得：取100mL 0.01％氯金酸与2.0～3.0mL 1％柠檬酸三钠充分混匀后，调节pH值为7.5～8.5，加入椰油酰胺丙基甜菜碱，然后置于微波炉中加热搅拌15～20min，待其冷却后用双蒸水补至原体积(即0.01％氯金酸、1％柠檬酸三钠和椰油酰胺丙基甜菜碱混合后的总体积)，制得胶体金溶液，取100mL胶体金液放在烧杯内，用0.2MK₂CO₃调至pH8.0，按100mL胶体金溶液加入1.5mg鼠源抗单纯疱疹I型单克隆抗体和1.5mg鼠源抗单纯疱疹II型单克隆抗体，再缓慢添加0.2M>2CO₃将胶体金溶液调至pH9.5，添加K₂CO₃的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/mL牛血清白蛋白，1mg/mL聚乙烯吡咯烷酮封闭20～30min，12000r/m离心30min，弃上清，用缓冲液复溶至50mL，按1mL溶液铺20cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温度20～25℃，湿度小于30％，干燥4～5小时。

进一步的，所述缓冲液为0.1mol/L pH8.5磷酸盐缓冲溶液。

进一步的，所述椰油酰胺丙基甜菜碱的加入量为2～5g。

进一步的，所述微波加热的功率为600～700w。

进一步的，所述胶体金溶液制备中的搅拌速度为60～80r/min。

进一步的，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

进一步的，所述样品垫为玻璃纤维膜。

在本发明的技术方案中，在胶体金溶液的制备中应用了椰油酰胺丙基甜菜碱，椰油酰胺丙基甜菜碱是一种两性离子表面活性剂，在酸性及碱性条件下均具有优良的稳定性，分别呈现阳和阴离子性，并且其易溶于水，具有很好的起泡性能，而发明人意外地发现在胶体金溶液的制备中使用椰油酰胺丙基甜菜碱，同时控制还原剂的加入量、反应时间、pH值、加热温度等，可制得颗粒大少在18～22nm、大小均一、稳定性高的单分散性胶体金；并且椰油酰胺丙基甜菜碱能提高胶体金标记物的稳定性，从而延长试剂盒的使用期限。这可能是因为在氯金酸和柠檬酸三钠反应的过程中，椰油酰胺丙基甜菜碱的发泡性使得形成的胶体金均匀分散，从而使其粒径分布集中、大小均一，同时椰油酰胺丙基甜菜碱的在碱性条件下呈现的阴离子表面活性，加强了胶体金的静电作用，一方面使胶体金颗粒间不容易聚结，提高胶体金颗粒的分散性和稳定性，另一方面增强了胶体金对标记物的吸附作用，使得胶体金与标记物稳定结合，减弱pH值等对胶体金标记物的影响，从而延长试剂盒的使用期限，并且保障检测结果的灵敏度、准确度和稳定性。另外，椰油酰胺丙基甜菜碱加入不会影响到试剂盒检测结果的特异性。

本发明试剂盒的检测方法为：1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸盒，平放；2)10μI血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液(生理盐水或PBS)，5～10分钟内可判定结果。3)检测结果分析：阳性：出现紫红色质控线(C线)和检测线(T₁线)或检测线(T₂线)两条条带；阴性：只出现一条紫红色质控线(C线)条带；无效：未出现紫红色质控线(C线)条带，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏，实验无效，30分钟后检验结果也无效。

因此，与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明单纯疱疹病毒I型和II型抗原联检试剂盒可同时对单纯疱疹病毒I型和II型进行检测，简单快速、准确灵敏；并且通过对胶体金制备的优化，制得了颗粒大少分布集中、大小均一、稳定性高的单分散性胶体金，提高了胶体金标记物的稳定性，保障检测结果的灵敏度、准确度和稳定性，并且延长试剂盒的使用期效。

具体实施方式

下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

在本发明实施例和对比例中的原料均源于市售，如单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体、鼠源抗单纯疱疹I型和II型单克隆抗体均购自南京黎明生物制品有限公司，羊抗鼠IgG抗体购自杭州启泰生物技术有限公司，椰油酰胺丙基甜菜碱(活性物含量30wt％)购自上海金山经纬化工有限公司。

实施例1、本发明单纯疱疹病毒I型和II型抗原联检试剂盒

本实施例试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条的宽度为4mm，其包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线和质控线的反应膜，所述反应膜靠近检测线的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，所述反应膜靠近质控线的一端叠加粘贴有吸收垫，所述反应膜上有两条检测线(T₁线和T₂线)，分别包被了单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体，所述反应膜上质控线(C线)包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠源抗单纯疱疹I型和II型单克隆抗体；

所述反应膜由以下方法制得：用缓冲液将单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体分别稀释至包被浓度为0.8mg/mL，将羊抗鼠IgG抗体稀释至包被浓度为1.5mg/mL，在反应膜上分别划线单纯疱疹病毒I型、II型多克隆抗体检测线和羊抗鼠IgG抗体质控线，划线后将反应膜置于干燥间，温度20℃，湿度小于30％，干燥5小时；

所述胶体金垫由以下方法制得：取100mL 0.01％氯金酸与2.0mL 1％柠檬酸三钠充分混匀后，调节pH值为7.5，加入2g椰油酰胺丙基甜菜碱，然后置于微波炉中加热，并以60r/min转速搅拌15min，待其冷却后用双蒸水补至原体积，制得胶体金溶液，取100mL胶体金液放在烧杯内，用0.2M>2CO₃调至pH8.0，按100mL胶体金溶液加入1.5mg鼠源抗单纯疱疹I型单克隆抗体和1.5mg鼠源抗单纯疱疹II型单克隆抗体，再缓慢添加0.2M>2CO₃将胶体金溶液调至pH9.5，添加K₂CO₃的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/mL牛血清白蛋白，1mg/mL聚乙烯吡咯烷酮封闭20min，12000r/m离心30min，弃上清，用缓冲液复溶至50mL，按1mL溶液铺20cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温度20℃，湿度小于30％，干燥5小时。

所述缓冲液为0.1mol/L pH8.5磷酸盐缓冲溶液。所述微波加热的功率为600w。所述反应膜为硝酸纤维素膜。所述样品垫为玻璃纤维膜。

实施例2、本发明单纯疱疹病毒I型和II型抗原联检试剂盒

本实施例试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条的宽度为4mm，其包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线和质控线的反应膜，所述反应膜靠近检测线的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，所述反应膜靠近质控线的一端叠加粘贴有吸收垫，所述反应膜上有两条检测线(T₁线和T₂线)，分别包被了单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体，所述反应膜上质控线(C线)包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠源抗单纯疱疹I型和II型单克隆抗体；

所述反应膜由以下方法制得：用缓冲液将单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体分别稀释至包被浓度为1.2mg/mL，将羊抗鼠IgG抗体稀释至包被浓度为1.8mg/mL，在反应膜上分别划线单纯疱疹病毒I型、II型多克隆抗体检测线和羊抗鼠IgG抗体质控线，划线后将反应膜置于干燥间，温度25℃，湿度小于30％，干燥4小时；

所述胶体金垫由以下方法制得：取100mL 0.01％氯金酸与3.0mL 1％柠檬酸三钠充分混匀后，调节pH值为8.5，加入5g椰油酰胺丙基甜菜碱，然后置于微波炉中加热，并以80r/min转速搅拌20min，待其冷却后用双蒸水补至原体积，制得胶体金溶液，取100mL胶体金液放在烧杯内，用0.2M>2CO₃调至pH8.0，按100mL胶体金溶液加入1.5mg鼠源抗单纯疱疹I型单克隆抗体和1.5mg鼠源抗单纯疱疹II型单克隆抗体，再缓慢添加0.2M>2CO₃将胶体金溶液调至pH9.5，添加K₂CO₃的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/mL牛血清白蛋白，1mg/mL聚乙烯吡咯烷酮封闭30min，12000r/m离心30min，弃上清，用缓冲液复溶至50mL，按1mL溶液铺20cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温度25℃，湿度小于30％，干燥4小时。

所述缓冲液为0.1mol/L pH8.5磷酸盐缓冲溶液。所述微波加热的功率为700w。所述反应膜为硝酸纤维素膜。所述样品垫为玻璃纤维膜。

实施例3、本发明单纯疱疹病毒I型和II型抗原联检试剂盒

本实施例试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条的宽度为4mm，其包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线和质控线的反应膜，所述反应膜靠近检测线的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，所述反应膜靠近质控线的一端叠加粘贴有吸收垫，所述反应膜上有两条检测线(T₁线和T₂线)，分别包被了单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体，所述反应膜上质控线(C线)包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠源抗单纯疱疹I型和II型单克隆抗体；

所述反应膜由以下方法制得：用缓冲液将单纯疱疹病毒I型和II型多克隆抗体分别稀释至包被浓度为1.0mg/mL，将羊抗鼠IgG抗体稀释至包被浓度为1.6mg/mL，在反应膜上分别划线单纯疱疹病毒I型、II型多克隆抗体检测线和羊抗鼠IgG抗体质控线，划线后将反应膜置于干燥间，温度25℃，湿度小于30％，干燥4小时；

所述胶体金垫由以下方法制得：取100mL 0.01％氯金酸与2.6mL 1％柠檬酸三钠充分混匀后，调节pH值为8.0，加入3g椰油酰胺丙基甜菜碱，然后置于微波炉中加热，并以70r/min转速搅拌15min，待其冷却后用双蒸水补至原体积，制得胶体金溶液，取100mL胶体金液放在烧杯内，用0.2M>2CO₃调至pH8.0，按100mL胶体金溶液加入1.5mg鼠源抗单纯疱疹I型单克隆抗体和1.5mg鼠源抗单纯疱疹II型单克隆抗体，再缓慢添加0.2M>2CO₃将胶体金溶液调至pH9.5，添加K₂CO₃的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/mL牛血清白蛋白，1mg/mL聚乙烯吡咯烷酮封闭25min，12000r/m离心30min，弃上清，用缓冲液复溶至50mL，按1mL溶液铺20cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温度25℃，湿度小于30％，干燥4小时。

所述缓冲液为0.1mol/L pH8.5磷酸盐缓冲溶液。所述微波加热的功率为700w。所述反应膜为硝酸纤维素膜。所述样品垫为玻璃纤维膜。

对比例1

与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：胶体金溶液的制备中不添加椰油酰胺丙基甜菜碱。

对比例2

与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：胶体金溶液的制备中加入7g椰油酰胺丙基甜菜碱。

对比例3

与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：胶体金溶液的制备中调节pH值为9.0。

试验例一

对实施例1～3和对比例1～3制得的胶体金溶液质量进行评价：

(1)透射电镜评价胶体金质量：将胶体金溶液滴在覆有Formvar膜的铜网上，在室温下放置24h阴干。在透射电镜下观察胶体金颗粒的大少是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。拍片放大后测量胶体金颗粒直径大少，取50个点计算胶体金颗粒的平均直径及标准偏差，前者反映颗粒的大少，后者说明颗粒是否均匀一致。

(2)可见光光谱评价胶体金质量：利用紫外可见分光光度计对胶体金颗粒在可见光范围内(400～700nm)进行扫描，获得胶体金可见光吸收光谱，记录最大吸收波长。

结果见下表1：

表1

由上表1可知：

(1)本发明实施例1～3制得的胶体金溶液为紫红色、透明的均匀溶液，其中的胶体金颗粒呈现良好的分散状态，无椭圆形及多角形，并大少均匀一致；

(2)对比例1胶体金溶液的制备中不添加椰油酰胺丙基甜菜碱，对比例2胶体金溶液的制备中加入较大比例的椰油酰胺丙基甜菜碱，其制得的胶体金颗粒的最大吸收波长向长波方向发生红移，颗粒出现的部分团聚，溶液的颜色加深、变浑浊，同时颗粒有椭圆形及多角形，标准偏差大，粒径不均匀；而对比例3改变了胶体金溶液的制备中的pH值，胶体金颗粒出现部分团聚，粒径不均匀，体系变浑浊。

试验例二

对实施例1～3和对比例1～3制得的胶体金溶液的稳定性进行评价：

将胶体金溶液分别在4℃、22℃、37℃和自然光照下贮存1个月，分别于第1、14、22、30天取胶体金溶液进行可见光谱扫描，根据胶体金溶液的可见光谱图，绘制其最大吸收峰波长随贮存时间的变化曲线图，对其贮存稳定性进行分析。

胶体金溶液在不同条件下贮存1个月后的可见光谱变化情况见下表2：

表2

注：“-”表示光谱基本无变化；“+”表示光谱稍有变化；“++”表示光谱变化较明显；“+++”表示光谱变化明显；“++++”表示光谱变化很明显。

由上表2可知：本发明实施例1～3的胶体金溶液在4℃和22℃条件下贮存1个月后光谱基本无变化，说明胶体金溶液能很好地保持稳定，而在37℃和自然光照条件下贮存1个月后光谱变化较明显，但与对比例1～3相比，对比例1～3在22℃、37℃和自然光照下贮存1个月后光谱均有不同程度的变化，并且变化程度比实施例的明显。

试验例三

对本发明实施例1～3的试剂盒进行评价：

对照试剂：中山大学达安基因股份有限公司单纯疱疹病毒I型核酸扩增(PCR)荧光定量测定试剂盒和单纯疱疹病毒II型核酸扩增(PCR)荧光定量测定试剂盒。按照试剂盒说明书进行操作。

(1)分析特异性：分别用1×10⁷org(CFU)/ml的金黄色葡萄球菌、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、白色念珠菌、解脲衣原体、人体衣原体测试实施例1～3的试剂盒，观察是否出现交叉反应。

结果：与1×10⁷org(CFU)/ml的金黄色葡萄球菌、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、白色念珠菌、解脲衣原体、人体衣原体均无交叉反应。

(2)应用效果：以达安基因的单纯疱疹病毒I型和II型核酸扩增(PCR)荧光定量测定试剂盒检测结果为金标准，对50例HSV阳性样本进行检测，结果如下：

方法HSV-1HSV-2HSV-1+2总例数对照试剂739450本发明实施例3试剂盒435342

可见，本发明实施例3试剂盒检出PCR阳性的84.0％，敏感性较高。另外同样以达安基因的单纯疱疹病毒I型和II型核酸扩增(PCR)荧光定量测定试剂盒检测结果为金标准，实施例3试剂盒的特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为98.2％、96.3％、92.1％和93.5％。

(3)使用期限：对本发明实施例1～3的试剂盒的使用期限进行考察，结果：常温贮存(5℃-30℃)，有效期24个月。而对比例1和2试剂盒的有效期为12个月，对比例3试剂盒的有效期为14个月。

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。