一种鉴定脊尾白虾近交家系的微卫星标记引物及方法

摘要

一种鉴定脊尾白虾近交家系的微卫星标记引物及方法，属于分子生物学领域，所述微卫星标记名称为ES034、ES096，本发明还提供一种利用上述引物进行脊尾白虾近交家系鉴定的方法，本发明利用两对微卫星引物对脊尾白虾群体内个体间的亲缘关系进行鉴定，判别群体内个体间的近交程度，当所有个体在146bp、263bp具有单态性片段时，则所鉴定的群体满足近交系培育的要求。本发明方法为近交系的判定提供依据。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一种应用微卫星标记鉴定脊尾白虾近交家系的方法。

背景技术

脊尾白虾属于长臂虾科、白虾属，俗称白虾、小白虾和迎春虾。主要分布于中国大陆沿岸和朝鲜半岛西岸的浅海低盐水域，以黄渤海产量最大，是我国重要的中小型经济虾类。脊尾白虾具有环境适应性广、食性杂、繁殖周期短、抗病力强等优点，大大降低了脊尾白虾全人工室内繁殖的难度，同时，脊尾白虾成虾个体小，体色透明易于实验操作。脊尾白虾的这些特点使其具备成为甲壳类实验动物的可能。

按遗传学控制方法，根据基因纯合程度，可将实验动物分为近交系、突变系、杂交群、封闭群四类。其中近交系动物因其基因型的纯合一致性，在实验的可重复性和可比性上具有明显的优势，因此，在实验动物的研究多集中在近交系动物。近交使一个种群达到接近完全纯合程度，即所有同源染色体的相对位置都具有相同基因的状态。在近交的过程中主要有以下几方面的变化：第一，增多纯合性，使基因位点变为纯合子，使其表现型趋向一致性，第二，近交可将群体分离为不同基因型的品系；第三，近交可引起近交衰退，亲缘接近的交配所产生的后代常常会出现生长、成活、生育、抗病、适应环境等能力的减退。如何克服和解决近交衰退的问题，是培育近交系动物的关键所在。

近交系实验动物的显著特点是其基因纯合性及遗传稳定性，但在培育、保种及繁殖生产过程中，存在着发生遗传变异或遗传污染的可能，所以需要对近交系进行严格、定时的遗传检测。对于脊尾白虾而言，以培育理想的实验动物为目的的高度近交系研究尚处于起步阶段，因此近交系的遗传检测也是近交系培育工作的需要。有关实验动物的国家标准规定了利用皮肤移植法、免疫标记基因检测法和生化基因标记检测法等进行常规检测。近年来分子生物学技术发展迅速,可以直接检验动物基因组核酸的改变,为脊尾白虾近交系的遗传检测提供了直接、客观的途径。

微卫星，是指少数几个核苷酸为单位多次串联重复的DNA序列，其广泛分布于真核生物的基因组中，大约每隔10-15kb就存在一个微卫星标记。微卫星标记在近交系培育的过程中具有以下的优势：采样微量化、方便化；快速、高效、准确性高；可长期使用；可直接识别出任何个体的基因型，从而对群体中不期望存在的基因变异体淘汰。所以，用微卫星标记技术选出具品系特异性的多态位点，可准确、快速、灵敏地应用于近交系实验动物培育过程中的鉴别、遗传质量监测等方面。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种鉴定脊尾白虾近交家系的微卫星标记引物及方法，本发明方法应用2个微卫星标记鉴定脊尾白虾近交家系。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种鉴定脊尾白虾近交家系的微卫星标记引物，所述微卫星标记名称为ES034、ES096，其引物分别如下：

ES034

正向引物：5'ACTTCATCCACAAGCAGAGGT 3'，

反向引物：5'GAAGAAGAGGAAGGTGGGGC3'；

ES096；

正向引物：5'GCAATTTGCCTGTTCGGTCT 3'，

反向引物：5'GGTAGGGGTAAGGGGGTGAT 3'。

利用上述引物进行脊尾白虾近交家系鉴定的方法，具体步骤如下：

从待测脊尾白虾群体中随机抽样得到待测样本，以待测脊尾白虾的基因组DNA为模板，利用具有由所述各个标记的一对引物进行PCR扩增，然后检测待测样本的PCR产物的片段大小，如果满足如下(1)至(3)的所有标准，待测脊尾白虾为候选的脊尾白虾近交家系：

(1)所述方法中，从待测脊尾白虾群体中随机抽样得到30尾以上待测样本；

(2)所述脊尾白虾待测样本属于F₈或F₈以上的世代；

(3)用标记ES034、ES096的每对引物检测的待测脊尾白虾群体时，群体内的所有样品具有相同的基因型，且片段大小分别为146bp、263bp。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明利用两对微卫星引物对脊尾白虾群体进行遗传检测，可以明确的区分出脊尾白虾的近交系群体，维持脊尾白虾近交系的纯合性和同基因性，淘汰在脊尾白虾近交系建立过程中发生遗传变异或遗传污染的群体。本发明方法不仅可以进行纯合位点的判定，而且能对基因的变异情况进行分析，为近交系的遗传检测提供依据。

附图说明

图1脊尾白虾野生群体在微卫星座位ES034的STR检测结果；

图2脊尾白虾近交F₁代在微卫星座位ES034的STR检测结果；

图3脊尾白虾近交F₇代在微卫星座位ES034的STR检测结果；

图4脊尾白虾近交F₈代在微卫星座位ES034的STR检测结果；

图5脊尾白虾近交F₉代在微卫星座位ES034的STR检测结果；

图6脊尾白虾野生群体在微卫星座位ES096的STR检测结果；

图7脊尾白虾近交F₁代在微卫星座位ES096的STR检测结果；

图8脊尾白虾近交F₇代在微卫星座位ES096的STR检测结果；

图9脊尾白虾近交F₈代在微卫星座位ES096的STR检测结果；

图10脊尾白虾近交F₉代在微卫星座位ES096的STR检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店可以购买得到的。

实施例1

材料

研究对象脊尾白虾近交家系群体F₇、F₈、F₉世代是由中国水产科学研究院黄海水产研究所李健课题组采用全人工室内培育的脊尾白虾家系。脊尾白虾野生群体采自于江苏海域，F₁代群体为野生群体后代，每个群体随机抽样30尾。

引物

本实验通过筛选获得2对微卫星标记用于检测鉴定脊尾白虾家系。扩增微卫星座位ES034、ES096的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列为：

ES034

正向引物：5'ACTTCATCCACAAGCAGAGGT 3'，

反向引物：5'GAAGAAGAGGAAGGTGGGGC3'。

ES096

正向引物：5'GCAATTTGCCTGTTCGGTCT 3'，

反向引物：5'GGTAGGGGTAAGGGGGTGAT 3'。

基因组DNA从上述待测脊尾白虾的肌肉组织中提取，提取方法参照传统酚氯仿法，加以改进。以提取的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下，分别进行PCR扩增，反应体系为20μL。其中模板为30-50ng，上下游引物各1μL，2×TSINGKE Master Mix(来自于北京擎科新业生物技术有限公司)为10μL，ddH₂O>

近交家系F₇、F₈、F₉世代群体、野生群体和F₁代群体的STR分型的比较结果表明ES034、ES096在近交系群体F₈、F₉中具有相同的特异等位基因，大小分别为146bp、263bp。而在其它群体中2个位点均表现为多态性,其中在野生群体中表现为较高的多态性。

因此本实验方案实验了脊尾白虾近交家系快速的基因分型，可用于脊尾白虾近交系培养过程中的遗传质量检测和品系的鉴定。

表1 ES034、ES096在群体中的多态性信息含量

SEQUENCE LISTING

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>一种鉴定脊尾白虾近交家系的微卫星标记引物及方法

<130>无

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工设计的引物ES034正向引物

<400>1

acttcatcca caagcagagg t 21

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工设计的ES034反向引物

<400>2

gaagaagagg aaggtggggc 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>ES096正向引物

<400>3

gcaatttgcc tgttcggtct 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>ES096反向引物

<400>4

ggtaggggta agggggtgat 20