马尾松枝桠中一种乌苏烷型三萜皂苷及其制备工艺

摘要

本发明属于林业剩余物的次生代谢成分清洁高效制备领域，具体涉及一种文献中从未报道过的乌苏烷型三萜皂苷即乌苏酸3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β‑D‑吡喃葡萄糖基(1″′→3′))‑β‑D‑吡喃葡萄糖醛酸基‑28‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷及其制备工艺。本发明提出的制备工艺具有简单规范易于操作、制备过程清洁高效、制备产物成分不被破坏且纯度高、原料成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明属于林木加工剩余物的次生代谢成分制备领域，具体涉及一种文献中从未报道过的乌苏烷型三萜皂苷即乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(其对应英文名为ursolicacid3-O-β-D-glucopyranosyl(1″→2′)(β-D-glucopyranosyl(1″′→3′))-β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside)及其清洁高效制备工艺。

背景技术

马尾松(Pinus massoniana Lamb.)为松科(Pinaceae)常绿乔木，其拥有宽大圆形树冠，树高可达25～45米。马尾松广泛分布于我国南方各省区，在秦岭以南的广大地域尤为常见，是我国最重要的松科树木之一。马尾松的松树皮、松花粉、松树针等在我国民间广泛入药，用以祛风活血、明目安神、活血止痛、解毒、止痒、舒筋等。此外，马尾松原料在保健品、食品、添加剂等方面应用广泛。现代药理研究也充分表明马尾松化学成分具有显著的抗肿瘤、抗炎、抗氧化、祛痰、抗突变、止咳、镇静、调血脂、平喘、镇痛、抑菌等作用(肖云川，等，中草药，2015，46(23)：3460～3465)。

三萜皂苷是由三萜皂苷元和糖、糖醛酸或其他有机酸组成，至今已发现至少30余种类型，除了个别是无环三萜、二环三萜及三环三萜外，三萜皂苷主要是四环三萜和五环三萜两大类。三萜皂苷目前已成为天然产物研究中进展最快和最活跃的领域。三萜皂苷在植物中分布广泛，且具有多种重要的生物活性和广泛的药理作用，如抗肿瘤，抗炎、降低胆固醇、抗病毒、抗过敏、治疗白血病、降血糖、防治心脑血管疾病等(张云峰，等，中成药，2006，28(9)，1349～1353)。研究表明三萜皂苷广泛分布于商陆科、葫芦科、七叶树科、伞形科、山茶科、五加科、桔梗科、木犀科、豆科、远志科等植物中，许多常用中药如人参、合欢、甘草、麦冬、知母、夏枯草、黄芪、三七、牛膝、天师栗、白头翁、柴胡、绞股蓝等都含有三萜皂苷化合物(陈颖，等，中国野生植物资，2012，31(6)，15～17)。

本发明利用液液萃取、柱色谱分离及重结晶技术从马尾松枝桠中制备得到一种文献中从未报道过的乌苏烷型三萜皂苷化合物，制备工艺清洁高效。

发明内容

本发明的目的是提供一种文献中从未报道过的乌苏烷型三萜皂苷，即乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，该乌苏烷型三萜皂苷对应的英文化学名为ursolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl(1″→2′)(β-D-glucopyranosyl(1″′→3′))-β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside。

本发明的第二个目的是提供从马尾松枝桠中清洁高效制备乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的工艺。

本发明的技术方案概述如下：

下述结构式为乌苏烷型三萜皂苷化合物乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷：

从马尾松枝桠中清洁高效制备乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的工艺，包括如下步骤：

步骤1：取干燥并粉碎的马尾松枝桠，按质量比为1∶1～1∶6加入体积百分浓度为80％～99％的二氯甲烷水溶液，常温提取或加热提取或超声波辅助提取1～5次，每次1～100h，过滤，滤液减压浓缩至原体积的2％～10％，得粗提物；

步骤2：加入粗提物质量1～5倍的水，搅拌，加入粗提物质量1～5倍的正丁醇萃取1～5次，分离掉正丁醇层，向剩余水层中加入粗提物质量1～5倍的石油醚萃取1～5次，分离掉石油醚层，向剩余水层中加入粗提物质量1～5倍的乙酸乙酯萃取1～5次，分离出乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层减压浓缩得乙酸乙酯萃取相；

步骤3：乙酸乙酯萃取相经硅胶柱层析或Sephadex LH-20柱层析之至少一种并结合ODS真空柱层析制备得到乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗分；

步骤4：乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗分经重结晶精制后得到乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

实验表明本发明的乌苏烷型三萜皂苷的分子式为C₅₄H₈₆O₂₄，化学名为乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，其对应的英文名为ursolic>-10.6°(c，0.5，MeOH)。MALDI-TOF MS：[M+Na]⁺为m/z>+为m/z>+为m/z>

表1.乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的¹H(400MHz)及¹³C>6)

本发明提出的制备工艺具有简单规范易于操作、制备过程清洁高效、制备产物成分不被破坏且纯度高、原料成本低等优点。

具体实施方式

参考下列实施例将更全面、更容易地理解本发明，给出实施例是为了更清楚地阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1：从马尾松枝桠中制备乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

步骤1：取干燥并粉碎的马尾松枝桠，按质量比为1∶5加入体积百分浓度为85％的二氯甲烷水溶液，常温提取4次，每次96h，过滤，滤液减压浓缩至原体积的3％，得粗提物；

步骤2：加入粗提物质量4倍的水，搅拌，加入粗提物质量4倍的正丁醇萃取2次，分离掉正丁醇层，向剩余水层中加入粗提物质量4倍的石油醚萃取2次，分离掉石油醚层，向剩余水层中加入粗提物质量4倍的乙酸乙酯萃取2次，分离出乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层减压浓缩得乙酸乙酯萃取相；

步骤3：乙酸乙酯萃取相经硅胶柱层析并结合ODS真空柱层析制备得到乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗分；

步骤4：乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗分经重结晶精制后得到乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

本发明乌苏烷型三萜皂苷化合物的结构鉴定：

该化合物为微黄色，其旋光度为-10.6°(c，0.5，MeOH)，熔点为198～200℃。在薄层色谱(TLC)展开试验中，以叔丁醇-冰乙酸-水体积比3∶1∶1的溶剂系统展开时该化合物的R_f值约为0.82。该化合物经MALDI-TOF质谱实验显示其[M+Na]⁺为m/z>+为m/z1157、[2M+Na]⁺为m/z>1H和¹³C核磁共振图谱数据得出其分子式为C₅₄H₈₆O₂₄。该化合物的红外光谱在3400、1925、1725、1060和1035处有强吸收峰。以质量百分比为10％的硫酸乙醇溶液进行TLC薄层色谱喷雾显色，反应呈紫色，表明该化合物可能为萜类化合物(Houghton>

在¹H>H>H>H>H>C>

在该化合物的¹H>H>H>13CNMR谱中于δ_C173.06给出特征峰(Si，et>

该化合物其余三个葡萄糖单元的端基质子在其¹H>H>13C>C>

该化合物的HMBC谱中，葡萄糖醛酸单元端基质子H-1′(δ_H>H5.05，1H)分别与乌苏酸苷元的C-3(δ_C>C>H>H>C78.12)and>C>

如表1所示的该化合物的DEPT实验结果表明，该化合物中含有54个碳信号，其中7个甲基、12个亚甲基、27个次甲基和8个三级碳，而且其中的每个碳信号与乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷相关位置皆对应。

综合上述各实验结果，该化合物的化学结构式被确定为乌苏烷型三萜皂苷，即乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。经检索，该化合物为新的乌苏烷型三萜皂苷类化合物。

实施例2：从马尾松枝桠中制备乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

步骤1：取干燥并粉碎的马尾松枝桠，按质量比为1∶4加入体积百分浓度为90％的二氯甲烷水溶液，加热提取3次，每次48h，过滤，滤液减压浓缩至原体积的5％，得粗提物；

步骤2：加入粗提物质量3倍的水，搅拌，加入粗提物质量3倍的正丁醇萃取3次，分离掉正丁醇层，向剩余水层中加入粗提物质量3倍的石油醚萃取3次，分离掉石油醚层，向剩余水层中加入粗提物质量3倍的乙酸乙酯萃取3次，分离出乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层减压浓缩得乙酸乙酯萃取相；

步骤3：乙酸乙酯萃取相经Sephadex LH-20柱层析并结合ODS真空柱层析制备得到乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗分；

步骤4：乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗分经重结晶精制后得到乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

实施例3：从马尾松枝桠中制备乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

步骤1：取干燥并粉碎的马尾松枝桠，按质量比为1∶3加入体积百分浓度为95％的二氯甲烷水溶液，超声波辅助提取2次，每次2h，过滤，滤液减压浓缩至原体积的8％，得粗提物；

步骤2：加入粗提物质量2倍的水，搅拌，加入粗提物质量2倍的正丁醇萃取4次，分离掉正丁醇层，向剩余水层中加入粗提物质量2倍的石油醚萃取4次，分离掉石油醚层，向剩余水层中加入粗提物质量2倍的乙酸乙酯萃取4次，分离出乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层减压浓缩得乙酸乙酯萃取相；

步骤3：乙酸乙酯萃取相经硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱层析并结合ODS真空柱层析制备得到乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗分；

步骤4：乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗分经重结晶精制后得到乌苏酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1″→2′)(β-D-吡喃葡萄糖基(1″′→3′))-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。