一种基于红细胞光镊拉曼光谱技术的人体血型鉴别方法

摘要

本发明涉及人体血型鉴别技术领域，具体涉及一种基于红细胞光镊拉曼光谱技术的人体血型鉴别方法，利用光镊拉曼光谱技术对单个活性红细胞进行拉曼光谱检测实现血型的快速准确鉴别。具体包括：利用光镊拉曼光谱技术实现在接近人体生理环境下对红活细胞进行实时拉曼光谱检测，获得不同血型红细胞的特征拉曼光谱信号；利用主成分分析以及线性判别分析的诊断算法，深度挖掘不同血型红细胞拉曼光谱特征指纹图谱信息，实现对不同血型的快速分辨。本发明优点包括：非标记地检测活细胞可最大限度维持红细胞的性质；检测过程快速；判别结果客观、可靠、准确。本发明可为临床人体血型快速鉴别提供一种新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及激光光谱技术的医学诊断应用与细胞生物学领域。更具体地说，本发明涉及使用光镊拉曼光谱技术对不同血型的单个活性红细胞进行拉曼光谱检测，能够实现快速准确的人体血型鉴别。

背景技术

人体血型主要包括A型、B型、AB型与O型四个大类，不同血型的血液中包含着不同的红细胞，这个差异主要表现为红细胞（RBC）外表面上存在着不同的抗原。例如A型血液中的RBC外表面只有抗原A；B型血液中的RBC外表面只有抗原B；而AB型血液中的RBC外表面同时存在抗原A与B。在临床实践中，人体血型鉴别是一个极其重要的检测项目。输血错误，即输入不相容的血液会导致严重的输血反应，危及生命。此外，最近的许多文献都报道了血型与传染性疾病（恶性疟疾、霍乱弧菌、大肠杆菌）、心血管疾病（静脉血栓栓塞、心肌梗塞、缺血性卒中、外周动脉病变）以及其他神经性疾病（帕金森、认知损害）有着潜在的关联。特别的是，一些流行病学研究表明人体血型竟然与某种癌症的发生风险也存在一定的联系。例如，A型血的人群患胃癌的风险较高；O型血的人群则具有对抗胰腺癌的某种保护机制。

目前临床的血型鉴定方法（玻片法、试管法、凝胶微柱法等）主要基于免疫学的原理，来确定红细胞的表面存在着何种抗原。这些方法存在一定的不足，例如：反应时间长、需要引入外源性的单克隆抗体物质，这可能会影响红细胞的原始性质；对于抗体效价低的检测样本时容易造成漏诊；依靠医师的经验主观地判断凝集反应的发生，容易造成漏诊与误诊。因此，发展一种基于RBC分析的非标记、简便、灵敏、准确、客观的ABO血型鉴别方法具有极其重要的临床价值。

基于非弹性散射的拉曼光谱技术是一种极具潜力的无损、灵敏的光学检测方法，它能提供生化样本的分子指纹信息，已广泛应用于大分子、细胞、体液以及组织样本的生物医学检测。其中，拉曼光谱技术特别适合活细胞的检测研究，因为在拉曼的指纹光谱波段中几乎没有水的干扰信号，可实现液体环境中活细胞的监测。但是由于细胞在培养液中做类似布朗运动，常规拉曼技术无法实现在生理环境中对活细胞的长时间的动态监测，虽然通过化学与物理方法可将细胞固定于基板来解决布朗运动带来的检测困难，但是这样的处理方法会干扰细胞的正常生理性质，还会受到强烈的背景信号的干扰。

光镊拉曼光谱（LTRS）技术的出现极大地克服了常规拉曼光谱技术的缺陷，极大地拓展、促进了该技术在细胞检测中的应用。LTRS可同时实现单细胞捕获、操纵以及生化信息的获取，提供了一种非标记、快速、无损的活细胞检测方法。利用LTRS对红细胞进行检测分析进而进行血型鉴定的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前人体血型鉴别诊断中存在的问题：反应时间长、需要引入外源性的单克隆抗体物质、对于抗体效价低的检测样本检测准确率低、检测结果极大程度依赖于医师的主观判断，提出一种基于红细胞光镊拉曼光谱技术的人体血型鉴别方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于红细胞光镊拉曼光谱检测的人体血型鉴别方法，其是利用光镊拉曼光谱技术对新鲜人体血液中分离出的单个活性红细胞在生理环境下进行拉曼光谱检测，获得不同血型（A型、B型、AB型、O型）的红细胞高质量的、特征性的拉曼光谱信号，并利用主成分分析（PCA）以及线性判别分析（LDA）对获得的拉曼光谱数据进行多元统计分析，根据不同血型的红细胞的特征光谱信息，实现对不同血型的非标记、快速、客观、准确的检测鉴别。

本发明所述基于红细胞光镊拉曼光谱技术的人体血型鉴别方法，包括以下步骤：

（1）红细胞样品的获取：采集不同血型人群的新鲜血液，所述血型包括A型、B型、AB型以及O型，将采集到的4种不同血型人群的新鲜血液分别与磷酸盐缓冲液混合、离心，并重复至少三次去除血液红细胞中的其它杂质，最后将纯净的活性红细胞与RPMI1640细胞培养液混合均匀，制成红细胞悬浮液并至于样品池中待测；

（2）红细胞样品的拉曼光谱测试：利用激光光镊产生的光学势阱将样品池中的单个红细胞移至相对独立的区域，进行拉曼光谱检测，检测条件为：激光波长785nm，激光功率2-3mW，光谱积分时间40s，光谱测试范围420-1700cm-1；

（3）不同血型红细胞的平均光谱对比分析：将获得的原始红细胞光谱数据进行荧光背景扣除以及光谱面积归一化，并进行平均光谱对比分析，寻找不同血型红细胞拉曼光谱的特征性光谱差异；

（4）不同血型红细胞的诊断识别模型：将预处理后的数据导入PCA分析算法进行降维处理，获得少量的主成分（PCs），但这些主成分仍携带着原始数据中绝大部分的诊断信息；利用T检验对获得的主成分进行分析，挑选出最具有诊断价值的三个PCs；最后将这三个PCs导入LDA对不同的血型数据进行线性判别分析，以后验概率建立6个判别诊断模型，计算每个判别诊断模型最终的判别准确率，实现血型的客观鉴别；

所述6个判别诊断模型分别是区分A型和B型血型的判别诊断模型；

区分A型和AB型血型的判别诊断模型；

区分A型和O型血型的判别诊断模型；

区分B型和AB型血型的判别诊断模型；

区分B型和O型血型的判别诊断模型；

区分AB型和O型血型的判别诊断模型；

（5）待检测血型的鉴别：采集待检测者的新鲜血液，按照步骤（1）和（2）的方法获得待检测血液的拉曼光谱数据，将该拉曼光谱数据分别导入到6个判别诊断模型中的某一个判别诊断模型进行计算，得到对应的后验概率数值，即对6个判别诊断模型同时进行计算，得到归属于某同一个血型后验概率最大的3个判别诊断模型，这3个判别诊断模型判别出来的血型应是同一种血型，从而可以确定该待检测血液样品的血型。

进一步，所述步骤（1）的红细胞悬浮液装载于培养皿内，所述培养皿底部进行如下改装：将培养皿底部开一半径为1cm的小孔，用厚度为70-80 μm的高纯度石英片密封上述小孔，通过调节细胞的抓捕高度，可实现对不同悬浮高度的红细胞进行拉曼光谱测试，同时提高信噪比。

所述步骤（2），进行拉曼光谱检测时，调节物镜使红细胞悬浮于样品池底部20-25μm高度位置。

本发明利用100倍油镜作为物镜，将785nm激光汇聚于样品池内实现对单个红细胞的光镊“捕获”以及拉曼光谱测试，并且对获得的原始测量光谱进行荧光背景扣除处理，以获得单个红细胞的纯拉曼光谱信号；接着对单个红细胞的拉曼光谱进行面积归一化处理，减小由于激光功率涨落或仪器不稳定而带来的光谱差异，保证光谱对比分析以及多元统计分析的可靠性；对获得的不同血型红细胞的拉曼光谱进行平均光谱对比分析，寻找不同红细胞拉曼光谱的特征性差异，将红细胞拉曼数据导入PCA-LDA的多变量统计分析算法，建立判别诊断模型，实现客观、准确的人体血型鉴别。

本发明采用以上技术方案，利用光镊拉曼光谱技术实现对单个活性红细胞实时的捕获和快速拉曼光谱检测，在测量过程中可以维持红细胞的存活状态，并且检测环境又接近红细胞在体内循环时自然生理状态，极大限度地保持了红细胞的原始生化特性；由于拉曼光谱能提供红细胞的分子指纹信息，所以不同血型血液中的红细胞的拉曼光谱会出现差异；此外，多元统计诊断算法用来建立诊断模型对不同血型的红细胞光谱数据进行判别分析。本发明是一种非标记、快速、简便、准确而又客观的人体血型鉴别方法。

本发明激光光镊红细胞拉曼光谱血型判别分析方法可以拓展应用于其它癌细胞与正常细胞的判别分析。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明：

图1A是A型和B型血液的红细胞平均拉曼光谱对比示意图；图1B是A型和B型血液红细胞的PCA-LDA判别模型散点图，其中利用0.484的后验概率作为诊断阈值，可获得83.9%鉴别准确率。

图2A是A型和AB型血液的红细胞平均拉曼光谱对比示意图；图2B是A型和AB型血液红细胞的PCA-LDA判别模型散点图，其中利用0.5的后验概率作为诊断阈值，可获得100%鉴别准确率。

图3A是A型和O型血液的红细胞平均拉曼光谱对比示意图；图3B是A型和O型血液红细胞的PCA-LDA判别模型散点图，其中利用0.395的后验概率作为诊断阈值，可获得89.9%鉴别准确率。

图4A是B型和AB型血液的红细胞平均拉曼光谱对比示意图；图4B是B型和AB型血液红细胞的PCA-LDA判别模型散点图，其中利用0.5的后验概率作为诊断阈值，可获得100%鉴别准确率。

图5A是B型和O型血液的红细胞平均拉曼光谱对比示意图；图5B是B型和O型血液红细胞的PCA-LDA判别模型散点图，其中利用0.442的后验概率作为诊断阈值，可获得98.9%鉴别准确率。

图6A是AB型和O型血液的红细胞平均拉曼光谱对比示意图；图6B是AB型和O型血液红细胞的PCA-LDA判别模型散点图，其中利用0.061的后验概率作为诊断阈值，可获得100%鉴别准确率。

图7A是待测血型红细胞拉曼光谱；图7B是A型和B型血液红细胞的PCA-LDA判别诊断模型散点图，其中利用0.484的后验概率作为诊断阈值；图C是A型和O型血液红细胞的PCA-LDA判别诊断模型散点图，其中利用0.395的后验概率作为诊断阈值；图7D是A型和AB型血液红细胞的PCA-LDA判别模型散点图，其中利用0.5的后验概率作为诊断阈值。实心三角形代表待测血型红细胞并有箭头予以标注。

具体实施方式

实施例1

本发明的具体技术细节按照对人体ABO血型鉴别的实施阐述如下：

（1）制备红细胞待测样品：采集不同血型（A、B、AB、O）人群的新鲜血液各30例，实验样本的血型由临床血型检测确定。将获得的新鲜血液与PBS缓冲液混合、离心，离心转速设置为1000r/s，离心时间为3分钟，离心后去除上清液，再次加入PBS进行离心，重复三次该程序去除红细胞中的其他杂质。最后将纯净的活性红细胞与RPMI1640细胞培养液均匀混合，制成红细胞悬浮液至于样品池中待测。对装载红细胞的培养皿底部进行改装，具体是将培养皿底部开一半径为1cm的小孔，用厚度为为70-80 μm 的高纯度石英片密封上述小孔，将此石英片底部做为细胞拉曼光谱测试窗口。通过调节细胞的抓捕高度，可实现对不同悬浮高度的红细胞进行拉曼光谱测试，同时提高信噪比。

（2）利用光镊拉曼光谱技术测试红细胞拉曼光谱：利用高度汇聚的激光光镊产生的光学势阱将样品池中的单个红细胞移至相对独立的区域，并调整物镜将红细胞悬浮于样品池底部20-25μm高度位置，进行拉曼光谱检测，获得高质量的红细胞拉曼光谱。测试时，激光波长为785nm，激光功率为2到3mW，光谱积分时间为40s，光谱测试范围为420-1700cm-1。

（3）对比不同血型红细胞平均拉曼光谱：不同血型红细胞的原始光谱信号将经过荧光背景扣除和面积归一化的预处理，最终得到的平均拉曼光谱如图1-6所示。该系统能获得高质量的红细胞拉曼光谱信号，其中包含许多尖锐、显著的拉曼峰，例如490、567、621、676、753、791、827、857、898、937、1003、1031、1082、1128、1173、1224、1308、1337、1397、1447、1547、1583、1606和 1620 cm−1。不同血型红细胞的拉曼谱峰强度也存在着差异，例如753、1003和1224 cm−1。此外，在1500-1700cm^-1波段，不同红细胞也存在差异。

（4）基于多元统计算法PCA-LDA的血型鉴别分析：首先将预处理后的光谱数据导入SPSS软件进行PCA降维处理，将原有的635个光谱变量缩减为几十个PCs，再利用T检验对获得的PCs进行分析，选取p值小于0.05的PCs，即选取最具有诊断效能的PCs。

按照以上方案，PC2、PC3和PC5成为区分A型和B型血型的最具诊断效能的PCs；PC1、PC3和PC4成为区分A型和AB型血型的最具诊断效能的PCs；PC3、PC4和PC5成为区分A型和O型血型的最具诊断效能的PCs；PC1、PC3和PC4成为区分B型和AB型血型的最具诊断效能的PCs；PC2、PC4和PC5成为区分B型和O型血型的最具诊断效能的PCs；PC1、PC2和PC3成为区分AB型和O型血型的最具诊断效能的PCs。之后再将这些选取出的PCs分别进行LDA判别分析，以后验概率建立判别诊断模型，分别是区分A型和AB型血型的判别诊断模型；区分A型和O型血型的判别诊断模型；区分B型和AB型血型的判别诊断模型；区分B型和O型血型的判别诊断模型；区分AB型和O型血型的判别诊断模型。

如图1-6所示，利用0.484的后验概率诊断值，对A型和B型的鉴别准确率可达83.9%；利用0.5的后验概率诊断值，对A型和AB型的鉴别准确率可达100%；利用0.395的后验概率诊断线，对A型和O型的鉴别准确率可达89.9%；利用0.5的后验概率诊断线，对B型和AB型的鉴别准确率可达100%；利用0.442的后验概率诊断线，对B型和O型的鉴别准确率可达98.9%；利用0.061的后验概率诊断线，对AB型和O型的鉴别准确率可达100%。

（5）待检测血型的鉴别：采集待检测者的新鲜血液，按照步骤（1）和（2）的方法获得待检测血液的拉曼光谱数据，将该拉曼光谱数据分别导入到6个判别诊断模型中的某一个诊断模型进行计算，得到对应的后验概率数值，即对6个诊断模型同时进行计算，得到归属于某同一个血型后验概率最大的3个判别诊断模型，这3个诊断模型判别出来的血型应是同一种血型，从而可以确定该待检测血液样品的血型。

实施例2

（1）制备某未知血型红细胞待测样品：采集某种未知血型人的新鲜血液1毫升，将获得的新鲜血液与PBS缓冲液混合、离心，离心转速设置为1000r/s，离心时间为3分钟，离心后去除上清液，再次加入PBS进行离心，重复三次该程序去除红细胞中的其它杂质。最后将纯净的活性红细胞与RPMI1640细胞培养液均匀混合，制成红细胞悬浮液于样品池中待测。

（2）利用光镊拉曼光谱技术测试红细胞拉曼光谱：利用高度汇聚的激光光镊产生的光学势阱将样品池中的单个红细胞移至相对独立的区域，并调整物镜将红细胞悬浮于样品池底部20-25μm高度位置，进行拉曼光谱检测，获得高质量的红细胞光镊拉曼光谱，如附图7（A）所示。测试时，激光波长为785nm，激光功率为2到3mW，光谱积分时间为40s，光谱测试范围为420-1700cm^-1。

（3）将该条未知血型的红细胞光镊拉曼光谱数据进行主成分降维分析，并分别选取对六个诊断模型最有诊断价值的相应主成分分别导入对应的诊断模型同时进行判别分析，具体选择过程如下：选取PC2、PC3和PC5导入A型和B型判别诊断模型进行判别分析；选择PC1、PC3和PC4导入A型和AB型判别诊断模型进行判别计算；选取 PC3、PC4和PC5导入A型和O型诊断模型进行判别分析；选取PC1、PC3和PC4导入 B型和AB型判别诊断模型进行判别分析；选取PC2、PC4和PC5导入B型和O型判别诊断模型进行判别分析；选取PC1、PC2和PC3导入AB型和O型诊断模型进行判别分析。具体计算结果如下：1.在A型和B型判别诊断模型中计算出后验概率为0.88，判别为A型血；2. 在A型和O型判别诊断模型中后验概率为0.90，判别为A型血；3.在A型和AB型判别诊断模型中计算出后验概率为1.0，判别为A型血；该三种诊断诊断模型计算出来的后验概率散点图分布分别如图7（B、C、D）所示，其中实心三角形代表未知血型数据点，且由箭头予以标注。4.在 B型和O型判别诊断模型中后验概率为0.50；5.在B型和O型判别诊断模型中后验概率为0.49；6.在 AB型和O型判别诊断模型中后验概率为0.51；在后面三种判别诊断模型中，计算出来的后验概率都在0.5左右，无法进行血型准确判别，而在前三种诊断模型中，后验概率都远大于0.5，而且前三种模型都判别为A型血，因此根据该结果，我们就可以很客观的得出该未知血型为A型血。

本发明利用光镊拉曼技术探测不同血型活性红细胞特有的生化信息，并引入多元诊断算法PCA-LDA深入挖掘光谱数据中潜在的诊断信息，建立高精度的判别模型，开发出一种非标记、快速、准确而又客观的血型鉴别新方法。