一种多穗柯叶有效部位的指纹图谱检测方法

摘要

本发明公开了一种多穗柯叶有效部位的指纹图谱检测方法。涉及中药质量控制方法。指纹图谱检测方法包括以下步骤：对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与0.1％甲酸组成的梯度洗脱液，柱温是25℃；紫外检测波长为285nm；时间为140min；高效液相色谱法测得指纹图谱。本方法可以有效地用于多穗柯叶的质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及中药提取物及其质量控制方法，具体涉及多穗柯叶有效部位的指纹图谱检测方法的建立。

背景技术

多穗柯，来源于壳斗科石柯属Lithocarpus polystachyus(Wall.)Rehd.，又名多穗石柯、多穗石栎；因叶子嚼之有甜味，故名为甜茶，在贵州称为甘茶，在广东称为大叶稠子。在我国长江以南各省区均有分布，尤以武夷山分布最广，此外，在桂、湘、皖等省资源最丰富，其中在广西(桂)的资源贮藏量约达数百吨。在粤、云、川、闽等省资源量次之。印度，泰国也有少许分布。

多穗柯是一种兼具药、茶、糖三种功能的药食两用植物，民间常取其嫩叶泡茶，茶色金黄鲜艳，味道甜中略有苦涩，回味持久，古人常用于清暑解渴。多穗柯叶中含有高达10％的高甜度、低热量的非糖甜味剂，其甜味成分主要为二氢查尔酮类根皮苷、3-羟基根皮苷、三叶苷等。

多穗柯叶具有降糖、降脂、抗氧化等功用，现代研究表明，其富含的丰富的黄酮类成分为其主要有效成分。为进一步完善多穗柯的质量标准，同时为探索前期药理实验不稳定的原因，本实验展开对其有效成分的指纹图谱的研究。

发明内容

本发明的目的是建立多穗柯叶有效部位HPLC指纹图谱的检测方法。

为达到本发明的目的所采用的技术方案：用高效液相色谱法建立多穗柯叶有效部位的指纹图谱检测方法，具体包括如下步骤：

①对照品溶液的制备：精密称取3-OH根皮苷对照品，加入50％乙醇进行溶解，配成浓度为0.50mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

②供试品溶液的制备：取多穗柯叶药材，打粉，并过二号筛，准确称取5.00g，放置于125mL具塞锥形瓶中，量取40mL50％的乙醇加入其中，放置于恒温水浴锅中，80℃加热回流提取60min，连续提取三次，最后将三次提取液混合均匀，放冷，过滤，将滤液定容于250mL量瓶中，取适量，过0.45μm微孔滤膜，续滤液置于液相瓶中，即得；

③色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇与甲酸组成的梯度洗脱液，柱温是20～30℃；紫外检测波长：200～400nm；

④测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

进一步优选的方法可以通过下述步骤实施：

①对照品溶液的制备：精密称取3-OH根皮苷10.05mg，加入50％乙醇进行溶解，定容于10mL容量瓶中，精密移取1mL上述溶液，50％乙醇定容于10mL容量瓶中，配成浓度为0.1005mg/mL的溶液；精密称取根皮苷5.00mg，加入50％乙醇进行溶解，定容于10mL容量瓶中，配成浓度为0.50mg/mL的溶液，即得；

②供试品溶液的制备：取批号为20140815的多穗柯叶药材，打粉，并过二号筛，准确称取5.00g，放置于125mL具塞锥形瓶中，量取40mL50％的乙醇加入其中，放置于恒温水浴锅中，80℃加热回流提取60min，连续提取三次，最后将三次提取液混合均匀，放冷，过滤，将滤液定容于250mL量瓶中，取适量，过0.45μm微孔滤膜，续滤液置于液相瓶中，即得；

③色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与0.1％～2.0％甲酸水溶液组成的梯度洗脱液，柱温是20～30℃；紫外检测波长为200～400nm；

④测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施：

步骤③色谱条件中流动相为甲醇与0.1％甲酸水溶液组成的梯度洗脱液，柱温为25℃，检测波长为254nm，流速为0.8mL/min；分析时间为140min。

步骤③色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0分钟时，流动相A为18％的甲醇溶液、流动相B为82％的0.1％甲酸水溶液；

20分钟时，流动相A为35％的甲醇溶液、流动相B为65％的0.1％甲酸水溶液；

60分钟时，流动相A为35％的甲醇溶液、流动相B为65％的0.1％甲酸水溶液；

120分钟时，流动相A为60％的甲醇溶液、流动相B为40％的0.1％甲酸水溶液；

140分钟时，流动相A为60％的甲醇溶液、流动相B为40％的0.1％甲酸水溶液。

具体见下表：

多穗柯叶有效部位指纹图谱的检测方法，具体包括如下步骤：

①对照品溶液的制备：精密称取3-OH根皮苷10.05mg，加入50％乙醇进行溶解，定容于10mL容量瓶中，精密移取1mL上述溶液，50％乙醇定容于10mL容量瓶中，配成浓度为0.1005mg/mL的溶液；精密称取根皮苷5.00mg，加入50％乙醇进行溶解，定容于10mL容量瓶中，配成浓度为0.50mg/mL的溶液，即得；

②供试品溶液的制备：取批号为20140815的多穗柯叶药材，打粉，并过二号筛，准确称取5.00g，放置于125mL具塞锥形瓶中，量取40mL50％的乙醇加入其中，放置于恒温水浴锅中，80℃加热回流提取60min，连续提取三次，最后将三次提取液混合均匀，放冷，过滤，将滤液定容于250mL量瓶中，取适量，过0.45μm微孔滤膜，续滤液置于液相瓶中，即得；

③色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与0.1％～2.0％甲酸水溶液组成的梯度洗脱液，柱温是20～30℃；紫外检测波长为200～400nm；

④测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

所述指纹图谱中有10个特征共有峰，其中3号色谱峰为3-OH根皮苷，最强峰为6号色谱峰，也是参照峰根皮苷，图谱总长度为140min，具体如下：

按照本发明所得多穗柯叶有效部位指纹图谱中有10个特征共有峰，其中3号色谱峰为3-OH根皮苷，最强峰为6号色谱峰，也是参照峰根皮苷，图谱总长度为140min，其中单峰面积超总峰面积2％的有7个，它们是1、3、5、6、7、8、9号峰，其中单峰面积超总峰面积10％的有1个，它们是6号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积15％的有1个，它们是6号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积20％的有1个，它们是6号色谱峰。

具体如下：

1号峰，平均保留时间RT为33.20min，RSD为0.41％，峰面积为292467.2，RSD为34.25％；

2号峰，平均保留时间RT为38.35min，RSD为0.35％，峰面积为159295.1，RSD为48.19％；

3号峰，平均保留时间RT为40.84min，RSD为0.90％，峰面积为551159.5，RSD为26.29％；

4号峰，平均保留时间RT为46.65min，RSD为0.92％，峰面积为166383.2，RSD为24.90％；

5号峰，平均保留时间RT为48.64min，RSD为0.65％，峰面积为669754.3，RSD为43.54％；

6号峰，平均保留时间RT为61.09min，RSD为0.76％，峰面积为6032428.7，RSD为34.22％；

7号峰，平均保留时间RT为68.70min，RSD为0.65％，峰面积为555096.1，RSD为32.46％；

8号峰，平均保留时间RT为72.24min，RSD为0.66％，峰面积为212800.3，RSD为44.16％；

9号峰，平均保留时间RT为90.31min，RSD为0.45％，峰面积为503140.4，RSD为32.30％；

10号峰，平均保留时间RT为98.52min，RSD为0.32％，峰面积为105901.2，RSD为34.59％。

RT为5min以前出现的峰为溶剂峰。

本发明的原理是从多穗柯叶有效部位的成分研究发现，多穗柯叶的有效成分主要为二氢查耳酮苷类化合物，该类化合物具有多方面的生物活性。建立多穗柯叶有效部位的HPLC指纹图谱检测方法，其有效部位的指纹图谱能从色谱的整体面貌上体现多穗柯叶有效成分含量情况。用本方法测定从市面上收集的多穗柯叶药材均能得到相同、相近的指纹图谱。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明所提供的方法能为进行进一步的药理药效学实验提供参考，为进一步开发利用多穗柯资源提供科学依据。

(2)指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学城分而判定多穗柯叶有效部位成分整体质量的片面性，又减少了为质量达标而认为处理的可能性。

(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

(4)该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

附图说明

图1多穗柯叶有效部位的HPLC指纹图谱。

图2 10批多穗柯叶的有效部位特征指纹图谱。

图3多穗柯叶有效部位HPLC共有模式的指纹图谱。

具体实施方式

为了能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与精神。借由以下结合附图与具体方式对本发明的详述得到进一步的了解。

实施例一：检测多穗柯叶有效部位的指纹图谱

1.仪器与试药

1.1仪器FZ-230型万能粉碎机(温岭市牧III与百乐机床厂)；万分之一SartoriusBP110s分析电子天平(德国sartorius公司)；十万分之一Sartorius CP225D分析电子天平(德国sartorius公司)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；DK-8AD电热恒温水浴锅(上海精密仪器仪表有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(河南巩义市予华仪器厂)；日本岛津Shimadzu高效液相色谱仪(LC-20AT高效液相泵，SIL-20A自动进样器，SPD-20A二极管阵列检测器，CTO-20A柱温箱)；高效液相色谱柱：Phenomenex luna C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),Thermo Hypersil Gold C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),Kromasil(C18 250mm×4.6mm,5μm)柱；

1.2试剂 分析用甲醇、乙腈(色谱级，德国默克公司)，甲酸、乙酸(分析级，天津大茂化学试剂厂)，磷酸(分析级，广州东巨化学试剂厂)，怡宝纯净水。

2.高效液相色谱

2.1 C18反相色谱柱Kromasil(C18 250mm×4.6mm,5μm)；流动相系统为甲醇-0.1％甲酸系统，具体梯度条件如下表；柱温为25℃,；流速为0.8mL/min；检测波长为254nm，进样体积为25μL；采集时间为140min；

梯度洗脱程序如下表：

梯度洗脱条件

2.2对照品溶液的制备：精密称取3-OH根皮苷10.05mg，加入50％乙醇进行溶解，定容于10mL容量瓶中，精密移取1mL上述溶液，50％乙醇定容于10mL容量瓶中，配成浓度为0.1005mg/mL的溶液；精密称取根皮苷5.00mg，加入50％乙醇进行溶解，定容于10mL容量瓶中，配成浓度为0.50mg/mL的溶液，即得；

2.3供试品溶液的制备：取批号为20140815的多穗柯叶药材，打粉，并过二号筛，准确称取5.00g，放置于125mL具塞锥形瓶中，量取40mL50％的乙醇加入其中，放置于恒温水浴锅中，80℃加热回流提取60min，连续提取三次，最后将三次提取液混合均匀，放冷，过滤，将滤液定容于250mL量瓶中，取适量，过0.45μm微孔滤膜，续滤液置于液相瓶中，即得；

2.4测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，如图1。

实施例二：10批多穗柯叶的有效部位的指纹图谱

取多穗柯药材10批次，按实施例一方法制备多穗柯叶有效部位并按实施例一条件进行检测，得10批样品的HPLC图谱。通过10批HPLC图谱的比较，进行相似度评价，确定其特征共有峰：

指纹图谱中有10个特征共有峰，现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及总峰面积汇总，具体如下：

1号峰，平均保留时间RT为33.20min，RSD为0.41％，峰面积为292467.2，RSD为34.25％；

2号峰，平均保留时间RT为38.35min，RSD为0.35％，峰面积为159295.1，RSD为48.19％；

3号峰，平均保留时间RT为40.84min，RSD为0.90％，峰面积为551159.5，RSD为26.29％；

4号峰，平均保留时间RT为46.65min，RSD为0.92％，峰面积为166383.2，RSD为24.90％；

5号峰，平均保留时间RT为48.64min，RSD为0.65％，峰面积为669754.3，RSD为43.54％；

6号峰，平均保留时间RT为61.09min，RSD为0.76％，峰面积为6032428.7，RSD为34.22％；

7号峰，平均保留时间RT为68.70min，RSD为0.65％，峰面积为555096.1，RSD为32.46％；

8号峰，平均保留时间RT为72.24min，RSD为0.66％，峰面积为212800.3，RSD为44.16％；

9号峰，平均保留时间RT为90.31min，RSD为0.45％，峰面积为503140.4，RSD为32.30％；

10号峰，平均保留时间RT为98.52min，RSD为0.32％，峰面积为105901.2，RSD为34.59％。

RT为5min以前出现的峰为溶剂峰。

所述多穗柯叶有效部位的指纹图谱中有10个特征共有峰，其中3号色谱峰为3-OH根皮苷，最强峰为6号色谱峰，也是参照峰根皮苷，图谱总长度为140min，其中单峰面积超总峰面积2％的有7个，它们是1、3、5、6、7、8、9号峰，其中单峰面积超总峰面积10％的有1个，它们是6号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积15％的有1个，它们是6号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积20％的有1个，它们是6号色谱峰。

相似度评价：将10批多穗柯叶有效部位的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(中国药典委员会2004A版)”，选号峰(根皮苷)作为参照峰，如图2，确定了10个共有峰。采用中位数法自动匹配自动生成对照图谱R，得各药材相似度。10批次多穗柯的相似度大于0.90。见表1。

表1 10批多穗柯叶药材有效部位的HPLC指纹图谱的相似度

通过上述方法所建立的多穗柯叶有效部位HPLC共有模式的指纹图谱如图3所示。

以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，于此所揭示的实施例与所有观点，应被视为用以说明本发明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此本发明的保护范围应以权利要求为准，并涵盖合法均等物。