直立百部愈伤组织高效诱导成苗的方法

摘要

本发明公开了一种直立百部愈伤组织高效诱导成苗的方法，以直立百部嫩芽作外植体，置于MS初代诱导培养基中进行诱导得到无菌试管苗，将试管苗置于MS愈伤诱导培养基中进行愈伤组织培养，所得愈伤组织置于MS分化培养基中得到大量丛芽，将丛芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养，得到的健壮植株置于MS生根培养基进行生根培养。试验表明，采用本发明的繁殖方法得到的丛生芽增殖系数为40～80倍，获得组培苗生根率在95％以上，移栽苗床成活率在90％以上。因此，本发明可有效利用现有资源快速繁殖直立百部，解决了直立百部工厂化生根育苗的问题，并能充分保障其医药用途开发所需原料来源。

说明书

技术领域

本发明属于直立百部组织培养领域，尤其涉及一种直立百部愈伤组织高效诱导成苗的方法。

背景技术

直立百部(Stemona sessilifolia(Miq.)Miq.)为百部科百部属植物，产浙江、江苏、安徽、江西、山东、河南等省。直立百部块根是《中国药典》(2015年版)收载中药百部的三种法定来源之一，具润肺下气止咳，杀虫灭虱的功效，用于新久咳嗽，肺痨咳嗽，顿咳；外用于头虱，体虱，蛲虫病，阴痒。研究表明，直立百部的主要有效成分为百部科植物独有的一类具有吡咯或吡啶并氮杂薁母核结构的百部生物碱，如根含百部碱、原百部碱、百部定碱、异百部定碱、直立百部碱、霍多林碱、对叶百部碱等。现代药理研究表明，百部生物碱具有驱虫、杀虫、镇咳平喘、神经肌肉传导、抗肿瘤和抗菌等作用。经考证，《图经本草》所载滁州百部即为直立百部。

一直以来，直立百部都依靠挖取野生品作药用，由于只挖不种，加上生长较慢，其野生资源日趋枯竭。同时，由于直立百部分布范围有限，市场上几乎难以找到直立百部商品药材，故直立百部人工种植和抚育势在必行。目前，虽有关于直立百部组织培养(专利申请号201410540445.9公开日2014年12月24日)和同科同属植物蔓生百部(李克烈，蔓生百部组织培养快繁技术，广西农业科学，2005，36：505-506)及对叶百部(杨振德，对叶百部组织培养快繁技术研究，现代农业科技，2016，2：105-107，115)组织培养的相关报道，但是尚未有直立百部愈伤组织诱导成苗的文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种实用、简单、高效的直立百部愈伤组织高效诱导成苗的方法，以有效利用现有资源快速繁殖直立百部。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

直立百部愈伤组织高效诱导成苗的方法，以直立百部嫩芽作外植体，置于MS初代诱导培养基中进行诱导得到无菌试管苗，将试管苗置于MS愈伤诱导培养基中进行愈伤组织培养，所得愈伤组织置于MS分化培养基中得到大量丛芽，将丛芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养，得到的健壮植株置于MS生根培养基进行生根培养。

MS初代诱导培养基以MS基本培养基为基础，添加1.0～2.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2～1.0mg/L吲哚乙酸、0.1～0.5mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS愈伤诱导培养基以MS基本培养基为基础，添加0.5～1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.1～0.5mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS分化培养基以MS基本培养基为基础，添加1.0～3.0mg/L玉米素、0.1～0.5mg/L吲哚丁酸、0.10～0.50mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS壮苗培养基以MS基本培养基为基础，添加1.0～2.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2～0.5mg/L萘乙酸、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS生根培养基以1/2MS基本培养基为基础，添加0.2～1.0mg/L萘乙酸、10g/L蔗糖、5g/L琼脂，1.5g/L活性炭，培养基的pH为5.8。

上述直立百部愈伤组织高效诱导成苗的方法，按以下步骤操作进行：

(1)外植体的选择与消毒

取直立百部的嫩芽作外植体，依次用体积浓度2％洗洁精水溶液浸泡5分钟，线状自来水冲洗15～20分钟，添加2～3滴吐温-20的100mg/L0.1％升汞消毒8～10分钟，无菌水冲洗3～5次，最后用消毒滤纸去除表面水份，得到外植体；

(2)初代诱导培养获得无菌试管苗

将步骤(1)得的外植体接种到MS初代诱导培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，获得无菌试管苗；

(3)愈伤组织诱导培养

将步骤(2)得到的无菌试管苗剪切成1cm左右茎段，置于MS愈伤诱导培养基中，在温度为22～26度，黑暗条件下培养30天，获得愈伤组织；

(4)愈伤组织分化培养

将步骤(3)得到的愈伤组织置于MS分化培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到大量丛生芽；

(5)壮苗培养

将步骤(4)得到的丛生芽切割成单个芽，置于MS壮苗培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到健壮植株；

(6)生根培养

将步骤(5)得到的健壮植株置于MS生根培养基培养，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到带根完整植株；

(7)炼苗与移栽

组培瓶中加入自来水，松开瓶盖，炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽到大田。

针对直立百部野生来源缺乏、人工种植困难的问题，发明人建立了一种直立百部愈伤组织高效诱导成苗的方法，以直立百部嫩芽作外植体，置于MS初代诱导培养基中进行诱导得到无菌试管苗，将试管苗置于MS愈伤诱导培养基中进行愈伤组织培养，所得愈伤组织置于MS分化培养基中得到大量丛芽，将丛芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养，得到的健壮植株置于MS生根培养基进行生根培养。试验表明，采用本发明的繁殖方法得到的丛生芽增殖系数为40～80倍，获得组培苗生根率在95％以上，移栽苗床成活率在90％以上。因此，本发明可有效利用现有资源快速繁殖直立百部，解决了直立百部工厂化生根育苗的问题，并能充分保障其医药用途开发所需原料来源。

相对于现有技术，本发明的突出优点在于：

(1)对直立百部进行愈伤组织培养，快速获得丛生芽，在短时间内培育出大量适合移栽的直立百部种苗，显著提高了直立百部种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足市场上的需求。

(2)在MS分化培养基中添加的玉米素和激动素属于常见植物生长调节剂，便宜易得，可大大降低直立百部组织培养中的成本消耗，达到降低成本的目的。

(3)在MS壮苗培养基中添加6-苄氨基嘌呤和萘乙酸可促进芽长高展叶。

(4)本发明可重复性操作，方法简单易行。

(5)本发明为后续直立百部的转基因研究打下了基础。

具体实施方式

实施例1

(1)外植体的选择与消毒

取直立百部的嫩芽作外植体，依次用体积浓度2％洗洁精水溶液浸泡5分钟，线状自来水冲洗15～20分钟，添加2～3滴吐温-20的100mg/L0.1％升汞消毒8～10分钟，无菌水(经高压灭菌的蒸馏水)冲洗3～5次，最后用消毒滤纸去除表面水份，得到外植体；

(2)初代诱导培养获得无菌试管苗

将步骤(1)得的外植体接种到MS初代诱导培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，获得无菌试管苗；

其中，MS初代诱导培养基以MS基本培养基为基础，添加1.0mg/L6-苄氨基嘌呤、0.5mg/L吲哚乙酸、0.2mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

(3)愈伤组织诱导培养

将步骤(2)得到的无菌试管苗剪切成1cm左右茎段，置于MS愈伤诱导培养基中，在温度为22～26度，黑暗条件下培养30天，获得愈伤组织；

其中，MS愈伤诱导培养基以MS基本培养基为基础，添加0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.2mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

(4)愈伤组织分化培养

将步骤(3)得到的愈伤组织置于MS分化培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到大量丛生芽；

其中，MS分化培养基以MS基本培养基为基础，添加1.0mg/L玉米素、0.3mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

(5)壮苗培养

将步骤(4)得到的丛生芽切割成单个芽，置于MS壮苗培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到健壮植株；

其中，MS壮苗培养基以MS基本培养基为基础，添加1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

(6)生根培养

将步骤(5)得到的健壮植株置于MS生根培养基培养，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到带根完整植株；

其中，MS生根培养基以1/2MS基本培养基为基础，添加0.5mg/L萘乙酸、10g/L蔗糖、5g/L琼脂，1.5g/L活性炭，培养基的pH为5.8。

(7)炼苗与移栽

组培瓶中加入少量自来水，松开瓶盖，炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽到大田。

结果：丛生芽增殖系数为40倍，获得组培苗生根率在95％以上，移栽苗床成活率在90％以上。

实施例2

与实施例1基本相同，仅如下不同：

MS初代诱导培养基以MS基本培养基为基础，添加1.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.3mg/L吲哚乙酸、0.5mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS愈伤诱导培养基以MS基本培养基为基础，添加1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS分化培养基以MS基本培养基为基础，添加1.0mg/L玉米素、0.5mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS壮苗培养基以MS基本培养基为基础，添加1.0mg/L6-苄氨基嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS生根培养基以1/2MS基本培养基为基础，添加0.5mg/L萘乙酸、10g/L蔗糖、5g/L琼脂，1.5g/L活性炭，培养基的pH为5.8。

结果：丛生芽增殖系数为70倍，获得组培苗生根率在95％以上，移栽苗床成活率在90％以上。

实施例3

与实施例1基本相同，仅如下不同：

MS初代诱导培养基以MS基本培养基为基础，添加2mg/L6-苄氨基嘌呤、0.5mg/L吲哚乙酸、0.5mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS愈伤诱导培养基以MS基本培养基为基础，添加1.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、0.2mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS分化培养基以MS基本培养基为基础，添加3.0mg/L玉米素、0.5mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L激动素、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS壮苗培养基以MS基本培养基为基础，添加2.0mg/L6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、30mg/L蔗糖、5mg/L琼脂，培养基的pH为5.8；

MS生根培养基以1/2MS基本培养基为基础，添加1.0mg/L萘乙酸、10g/L蔗糖、5g/L琼脂，1.5g/L活性炭，培养基的pH为5.8。

结果：丛生芽增殖系数为80倍，获得组培苗生根率在95％以上，移栽苗床成活率在90％以上。