一种新型细胞色素P450 3A5酶特异性探针底物及其应用

摘要

本发明提供了一种新型细胞色素P450 3A5酶特异性探针底物及其应用,属医药技术领域。该底物为五味子酯戊，可用于CYP3A5酶活的定量测定。具体操作流程如下：以五味子酯戊作为特异性探针底物，借助CYP体外孵育体系或人源细胞进行特异性底物的CYP催化反应，通过定量检测单位时间内的底物减少量或其2-O-脱甲基产物生成量来测定各种人源生物样品或人源细胞中CYP3A5酶的活性。本发明可实现不同来源的生物样本中CYP3A5酶活的定量评估。

说明书

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种新型细胞色素P4503A5酶特异性探针底物及其应用。

背景技术

细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)3A亚家族是人体中含量最多，代谢药物最多，亚型也较多的药物代谢酶家族(Science 1999；286:487)，参与近50％临床药物的体内代谢，直接影响药物的临床有效性和安全性。人类CYP3A亚家族主要包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43共4个成员(Clin Pharmacokinet 2006；45:13)。其中，CYP3A7为人类胎儿肝脏中检测出的主要CYP蛋白，出生后含量迅速降低；CYP3A43是最新发现的CYP3A亚型，其在肝内表达水平非常低。而CYP3A4和CYP3A5是成人CYP3A亚家族中最主要的两个成员。CYP3A4是成人肝脏表达最多的CYP蛋白(>85％)(Pharmacol Therapeut2013；138:103)，主要分布在肝脏和小肠，参与大部分临床用药的代谢；CYP3A5则以基因多态性的形式表达，主要包括三种基因型：CYP3A5*1*1(高表达高活性)、CYP3A5*1*3(中度活性)和CYP3A5*3*3(低表达低活性)(Nat Genet2001；27:383)；通常CYP3A5在成人肝脏中仅占CYP总蛋白的5％左右(Pharmacol Therapeut 2013；138:103)，而在肾、脑、肺等组织有较高表达；在10％～30％的高加索人和50％～70％的非裔美国人中存在CYP3A5*1表达(Clin Pharmacokinet2006；45:13)，此时CYP3A5的表达量约高达肝脏CYP3A总量的40％(Drug Metab Dispos 2007；35:1733)，因此CYP3A5的作用不容忽视。

此外，值得注意的是，CYP3A家族在部分肿瘤组织中也存在显著差异性表达。例如与正常组织相比，在结直肠癌组织中，CYP3A5蛋白有显著高表达，而 CYP3A4的蛋白表达量无显著变化(Clin Cancer Res 2005；11:3758)；与此相似，在卵巢癌组织中，CYP3A5蛋白表达量与正常组织相比显著上调，而CYP3A4蛋白却无明显改变(Clin Cancer Res 2005；11:7369)。由此可见，CYP3A4和3A5存在相当大的组织分布特异性。

CYP3A亚型所代谢的近50％的已上市药物代谢中包括了很多重要的治疗窗狭窄药物，如他克莫司、环孢菌素等免疫抑制剂，多烯紫杉醇、长春瑞滨、伊立替康等抗肿瘤药物，及抗癫痫药物卡马西平等(Biochem Pharmacol2004；68:1889；Drug Metab Dispos 2006；34:836；Lancet Oncol 2005；6:780；Cancer Treat Rev 2012；38:715；Pharmacogenomics 2013；14:555；Drug Metab Dispos2004；32:1434)。另一方面，CYP3A酶活性在人体的变异度可高达100倍以上(Drug Metab Dispos 2010；42:209)，且人肝中CYP3A蛋白含量的个体差异高达64倍(J Pharmacol Exp Ther 1997；283:1552)，因此，在使用以上狭窄治疗窗药物时，尤其需要慎重。例如，他克莫司，其药效约高于环孢菌素的50-100倍，是临床最常用的抗移植排斥反应的一线药物(Drugs 1993；46:746)，其治疗窗极其狭窄(5～15ng/ml)。在人体内主要他克莫司经由CYP3A4/3A5代谢，且CYP3A5介导其代谢的内在清除率略高于CYP3A4(Drug Metab Dispos 2006；34:836)；考虑到3A5的含量通常低于3A4(Pharmacol Therapeut 2013；138:103)，因此，倘若CYP3A5的贡献率明显大于3A4，3A5与3A4含量比例变化就会导致他克莫司代谢的变异度将在体内被进一步放大，产生严重的个体差异(Clin Pharmacol Ther 2003；74:245)。实际上，他克莫司在治疗过程中通常需要监测血药浓度来减少药物不良反应的发生(Clin Pharmacokinet 1995；29:404)。同样，多烯紫杉醇作为临床治疗乳腺癌和非小细胞肺癌的一线抗肿瘤药物，也由CYP3A4/3A5共同代谢，CYP3A4活性的个体变异及CYP3A5的多态表达均会严重影响其体内暴 露水平(Cancer Treat Rev 2012；38:715-25)。颇多研究结果表明，在使用抗癌药之前，先采用红霉素的呼吸实验预测机体的CYP3A总体处置能力，能有效降低约47％的多烯紫杉醇的个体变异度(Clin Cancer Res 2000；6:1255；Clin Pharmacol Ther 2008；84:111)。但红霉素是CYP3A4/3A5共底物(Curr Drug Metab2008；9:20)，该测试结果会低估CYP3A5或高估CYP3A4的活性。

由此可见，CYP3A亚型(CYP3A4和3A5)因其底物偏好性的差异、含量和活性的差异，导致各亚型贡献率的明显不同，该效应会在个体诊疗中被进一步放大(J Natl Cancer Inst 2002；94:1883)。因此，寻找亚型高选择性探针分子用于区分CYP3A4和CYP3A5两者的贡献率对于提高药物的有效性和安全性具有临床实际意义且至关重要。

然而，目前绝大多数已经报道CYP3A探针底物，如咪达唑仑、硝苯地平、睾酮和红霉素等，均由CYP3A4和CYP3A5共同参与代谢(Drug Metab Dispos2003；31:938)。优良的探针属性包括高选择性、高灵敏性和高安全性三方面(Pharmacogenetics 1994；4:171)。而关于CYP3A亚型高选择性的探针研究却鲜有报道。目前，已报道的倾向于CYP3A4高选择性代谢的探针底物主要有：奎尼丁(J Pharmacol Exp Ther 1999；289:31)、蟾毒灵(Chem.Commun 2013；49:9779)、异丙基乙缩醛荧光素等(Drug Metab Dispos 2009；37:1598)；相比之下，关于CYP3A5高选择性探针的报道很少，如Lu等人报道的抗艾滋病药物马拉维诺的二氟环己烷羟化反应，其最大转化速率仅约为0.93pmol/min/pmol CYP(Drug Metab Dispos 2012；40:2221)，以及Li等人报道的磷酸二酯酶5抑制剂T-5的脱烷基反应，其最大转化速率可达13.9pmol/min/pmol CYP，但同时还有CYP2C8和CYP2D6参与代谢(Drug Metab Dispos 2014；42:334)。不难看出，这两种CYP3A5底物本身均为药物，在安全性上受到较大局限。因此，目前仍缺乏具有 高转化效率或高灵敏性且安全性高的CYP3A5高选择性探针。

发明内容

本发明的目的在于提供一类木脂素类化合物以及其在检测CYP3A5酶活性中的用途及其检测方法，具体为五味子酯戊可作为CYP 3A5酶的高特异性探针底物，用于定量测定不同来源生物样本及体内CYP3A5的酶活。与目前已报道的CYP3A探针/标准底物不同，五味子酯戊具有高特异性表征CYP3A5酶活性的能力，CYP3A4催化活性极微弱可忽略不计。因此能够高特异性的评价机体或组织中CYP3A5酶对药物的代谢处置能力，对体内外药物代谢研究具有重要意义。

一种新型细胞色素P4503A5(CYP 3A5)酶特异性探针底物，该底物为五味子酯戊，可被CYP3A5特异性催化生成相应脱甲基产物，其结构如下所示：

一种新型细胞色素P4503A5(CYP 3A5)酶特异性探针底物的应用，该探针底物的2-O-脱甲基反应可用于标定不同实验体系中CYP 3A5酶的活性。

所述实验体系包括体外重组表达CYP酶、人源细胞及人源组织的制备物。

所属细胞色素P4503A5酶特异性探针底物测定生物体系中CYP3A5酶活性的方法，测定方法条件为：

——体系中以五味子酯戊作为探针底物；底物浓度范围为1-200μM；

——在pH 7.4且具有辅因子NADPH或其生成体系的孵育体系中，反应温 度为10-60℃之间；

——反应时间为5-60分钟；确保获得2-O-脱甲基代谢产物达到定量限且底物转化率低于20％时终止反应；

——通过检测单位时间内的底物减少量或2-O-脱甲基产物生成量，实现CYP3A5酶活性的检测。

所述反应温度优选37℃。

采用所述新型CYP 3A5酶特异性探针底物检测CYPP 3A5酶活性：通过定量定时测定相应代谢产物的生成速率或底物的减少速率实现CYP3A5酶活性的检测。

五味子酯戊仅能被CYP 3A5选择性代谢并生成一个主要代谢产物2-O-脱甲基五味子酯戊(见图1)，其余代谢酶包括CYP 3A5均难以催化其代谢，2-O-脱甲基反应符合米氏动力学，其单位时间内的转化速率可用于定量测定不同生物体系(包括重组单酶体系、人及动物细胞/组织制备液等)中CYP 3A5酶的活性。

采用重组CYP单酶考察五味子酯戊的代谢酶选择性，结果显示CYP3A5酶主导性介导五味子酯戊的脱甲基反应(图2)；进而采用14例个体人肝微粒体考察五味子酯戊脱甲基反应速度与微粒体中CYP3A4和CYP3A5蛋白的相关性，结果显示脱甲基反应速度与CYP3A5蛋白量具有高度相关性(r²＝0.9402,P<0.0001)，而与CYP3A4蛋白量相关性极低(r²＝0.046,P＝0.48)，见图3所示。以上结果证明五味子酯戊可特异性的经由CYP3A5酶代谢。五味子酯戊经CYP3A5代谢生成脱O-甲基五味子酯戊，高效液相图谱见图4，原形及代谢产物的质谱图见图5，核磁氢谱图见图6和表1。酶动力学结果(图7)显示CYP3A5介导的五味子酯戊2-O-脱甲基反应的最大反应速度高于CYP3A4的25.8倍，CYP3A5介导的最大反应速度高达63.4pmol/min/pmol>

表1五味子酯戊及其2-O-脱甲基代谢产物的核磁氢谱化学位移

作为高特异性的CYP 3A5的探针底物，五味子酯戊可以用来检测CYP 3A5酶活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的CYP3A5重组酶、多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中CYP 3A5的活性标定，以及体内CYP 3A5活性的标定。

其中检测底物减少量或其对应脱甲基产物生成量的定量检测方法为紫外吸收光谱、质谱、放射性同位素示踪技术、荧光激发光谱、蒸发光散射或电化学光谱检测。所有检测器包括紫外吸收光谱检测器、质谱、放射性同位素示踪技术、蒸发光散射或电化学光谱检测器中的一种或多种串联。

选用本发明所述CYP3A5酶的特异性探针底物检测CYP3A5酶活性具有以下 突出优势：>

(1)高特异性：五味子酯戊可被目标CYP 3A5高特异性地代谢成为相应的2-O-脱甲基产物。>

(2)高转化率：五味子酯戊在CYP3A5催化的2-O-脱甲基产物转化率高，10μM的五味子酯戊在0.4nM的CYP3A5单酶反应体系中孵育半小时，2-O-脱甲基产物转化率可达90％以上，高转化率特性助于探针灵敏性的提高。

(3)易于制备：底物五味子酯戊是五味子科植物茎叶及果实中富含的一种天然化学成分，来源简单且易于分离纯化。

(4)检测灵敏：该化合物为具有联苯环辛烯母核结构的化合物，有良好的紫外吸收特性(230～280nm)及质谱离子化效果，可通过常规分析手段(如LC-UV、LC-ESI-MS等)对其定量分析。在临床应用中，无需另行购买昂贵的检测设备。

附图说明

图1.五味子酯戊及其脱甲基产物的化学结构式；

图2.五味子酯戊的人重组单酶筛选实验结果；

图3.五味子酯戊2-O-脱甲基反应速度与个体人肝微粒体中CYP3A5和CYP3A4蛋白含量的相关性分析；

图4.五味子酯戊及其2-O-脱甲基代谢产物在人重组单酶CYP3A4和CYP3A5中的液相色谱图；

图5.五味子酯戊及其2-O-脱甲基代谢产物的质谱图；

图6.五味子酯戊及其2-O-脱甲基代谢产物的核磁氢谱图；

图7五味子酯戊在CYP3A4及CYP3A5单酶体系中的动力学行为；

图8.五味子酯戊测试14例人肝微粒体CYP3A5的活性差异

图9.五味子酯戊测试不同组织来源细胞的CYP3A5活性差异

具体实施方式

下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。

实施例1

五味子酯戊用于检测人重组CYP3A5及CYP3A5+细胞色素b5体系的酶活

利用五味子酯戊检测两种人重组单酶(重组表达体系中含有细胞色素b5和不含细胞色素b5两种)在催化活性上的差异，具体步骤如下：

(1)100微升体外代谢反应体系中，10mM葡萄糖-6-磷酸,1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,以及4mM MgCl₂，含有细胞色素b5的重组CYP3A5浓度为10nM，五味子酯戊终浓度为1-200μM，于37℃条件下预孵5分钟；

(2)于反应体系中加入10μl NADP⁺(终浓度1mM)起始反应；>

(3)反应5分钟后，加入100μl甲醇，剧烈震荡后，终止反应；

(4)采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系15分钟后，取上清，进行UFLC-UV检测分析；

(5)以同样操作进行不含有细胞色素b5的重组CYP3A5的活性测定。>

通过紫外吸收光谱在254nm下对五味子酯戊2-O-脱甲基产物生成量进行定量检测，利用五味子酯戊作为探针底物测得的含有细胞色素b5的重组CYP3A5的酶活性相比之于不含细胞色素b5的重组CYP3A5的酶活性提高了35％。

实施例2

五味子酯戊用于检测不同CYP3A5基因型的人肝微粒体的CYP3A5酶活

利用五味子酯戊检测不同CYP3A5基因型的人肝微粒体中的CYP3A5的催化活性差异，具体步骤如下：

(1)200微升体外代谢反应体系中，10mM葡萄糖-6-磷酸,1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,以及4mM MgCl₂，人肝微粒浓度为0.4mg/ml，五味子酯戊终浓度为1-200μM，于37℃条件下预孵5分钟；

(2)于反应体系中加入20μl NADP⁺(终浓度1mM)起始反应；>

(3)反应20分钟后，加入200μl甲醇，剧烈震荡后，终止反应；

(4)采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系15分钟后，取上清，进行UFLC-UV检测分析；

通过紫外吸收光谱在254nm下对五味子酯戊2-O-脱甲基产物生成量进行定量检测，利用五味子酯戊作为探针底物测得CYP3A5*1*1基因型的人肝微粒体中的CYP3A5活性水平约为CYP3A5*1*3基因型的人肝微粒体中的CYP3A5活性的3倍，而为CYP3A5*3*3基因型的人肝微粒体中的CYP3A5活性的近15倍。

实施例3

五味子酯戊用于14例个体人肝微粒体中CYP3A5酶活的测定>

购买商业化的十四例来自不同个体的人肝微粒体样本，利用五味子酯戊测定人肝样品中CYP3A5的酶活，具体操作流程如下：

(1)200微升体外代谢反应体系中，10mM葡萄糖-6-磷酸,1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,以及4mM MgCl₂，人肝微粒体浓度为0.4mg/ml，五味子酯戊终浓度为20μM，于37℃条件下预孵3分钟；

(2)于反应体系中加入20μl NADP⁺(终浓度1mM)起始反应；>

(3)反应20分钟后，加入200μl甲醇，剧烈震荡后，终止反应；

(4)采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系10分钟后，取上清，进行UFLC-UV检测分析；

通过紫外吸收光谱在254nm下对五味子酯戊2-O-脱甲基产物的生成量进行定量检测。测定结果表明，根据五味子酯戊代谢产物的生成速度在不同来源的人肝微粒体中具有较大差别，最高活性与最低活性差距达18.2倍，CYP3A5活性的个体变异度可高达60.2％(见图8)。

实施例4

五味子酯戊用于人源性不同组织来源的细胞中CYP3A5酶活的测定

利用五味子酯戊检测不同不同组织来源的细胞中CYP3A5的活性差异，具体步骤如下：

(1)采用标准方法复苏各组织来源的细胞系，包括：非小细胞肺癌细胞(A549)、结肠癌细胞(Caco-2)、胰腺癌细胞(CAPAN-2)、肝癌细胞(HepG2)和粒细胞性白血病细胞(K-562)，培养3天后，进行传代，并接种于12孔板中继续培养，细胞接种密度为1×10⁶个/ml，每孔细胞悬液总体积为1ml。

(2)细胞继续培养24小时后，加入五味子酯戊进行CYP3A5酶活性测试，五味子酯戊终浓度为20μM(二甲基亚砜终体积小于0.1％，v/v)，于37℃的二氧化碳培养箱反应60分钟；

(3)反应60分钟后，取出500微升细胞培养上清液，加入等体积甲醇后充分涡旋混匀，采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系15分钟后，取上清，进行UFLC-UV检测分析；

(4)吸除剩余培养基，加入200微升细胞裂解液裂解并收集细胞，采用Lowry 方法进行细胞蛋白定量。

通过紫外吸收光谱在254nm下对细胞培养基中的五味子酯戊2-O-脱甲基产物生成量进行定量检测，利用五味子酯戊作为探针底物测得不组织来源细胞的CYP3A5酶活性的差异可达3倍以上(见图9)。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。