用于确定蛋的受精和/或性别的非侵入性装置，以及相应的方法

摘要

一种用于确定蛋的受精和/或性别的非侵入性装置。此装置包含针对入射光信号得到对壳特异的光谱响应的装置，其包含被配置成将所述入射光信号聚焦在壳的至少一层的表面部分和/或内部部分上的聚焦装置，和根据对壳特异的所述光谱响应确定蛋的受精和/或性别的装置。

说明书

技术领域

本发明领域是家禽饲养的领域。

更具体地讲，本发明涉及一种用于确定蛋的受精和/或其性别(即，确定蛋(如果受精)中所含的胚胎是雄性还是雌性)的非侵入性技术。

背景技术

多年以来，在家禽饲养领域中一直存在关于在蛋孵化前确定受精和性别的问题。

传统上，通过人为干预对1天大的小鸡实施性别鉴定，主要通过两种技术：通过观察羽毛的羽毛性别鉴定法和通过观察肛门的肛门性别鉴定法。

虽然这些方法有效，但是它们主要的缺点是在生产周期中它们进入操作太晚。例如，在产蛋鸡的情况下，需要21天的孵育以将雌性与雄性分开(去除后者)。

在孵育早期确定胚胎性别将改善家禽饲养生产，同时时间和财务利润均获得增益。

因此，发展了一定数量的高或低侵入性技术以确定并评价未孵化的鸟蛋的受精和性别。

在专利US6029080中描述了第一种已知技术，其提出了通过核磁共振的确定方法。此技术用于将蛋分成三类：包含雄性胚胎的蛋、包含雌性胚胎的蛋和非受精或“无精”蛋。分类通过透过壳观察生殖器官来进行。更具体地讲，只能在冷冻蛋后观察以使胚胎的运动最小化。此技术的一个缺点是蛋的冷冻会对胚胎的日后发育造成干扰。另一个缺点是实施此技术成本相对较高。这阻碍了其产业化发展。

在专利申请US2011/0144473中描述了第二种已知技术，其描述了UV光谱法的使用。此技术由在紫外范围中发送波以在胚盘(blastodisc)的区域中提示自动荧光组成。为了确定胚胎的性别，计算出减小系数，然后与在停止UV波的发射后观察自动荧光的减小得到的数据库比较。但是，此技术的一个缺点是其需要通过侵入性清除进入胚盘。

第三种已知技术是基于红外光谱法。同样是侵入性的此方法由将探针引入胚盘区域以通过红外光谱法来表征其组成细胞组成。

第二种和第三种现有技术的一个主要缺点是它们是侵入性的：它们需要引入仪器并从胚中移除细胞。因此，这些操作对胚胎的日后发育并非全无风险。这两种技术的另一个缺点是有污染整个芽胞的风险。

为了克服此主要缺点，在专利申请US2013/0044210中描述了第四种非侵入性现有技术。它由以下组成：蛋反射的光谱的超光谱分析(即，从中红外到近紫外的分析)，减去壳的光谱响应并检测蛋的生物组分。此技术可确定蛋是否第二天受精以及在第十二天时胚胎的性别。此技术的一个主要缺点是其需要校正以弥补壳(通过减去其光谱响应)和环境干扰(光、湿度等)。为此，必须将每个蛋放在特定支撑体上，使辐射源、检测器与蛋之间保持已知距离。因此，此技术难以进行产业化实施。

可能是由于上述缺点，所以上述现有技术都没有真正地引导产业化发展。

发明内容

本发明，在至少一个实施例中，尤其旨在克服现有技术的这些不同缺点。

更具体地讲，本发明的至少一个实施例的目的是提供用于确定蛋的受精和/或性别的技术，其是非侵入性的(不需要通过任何工具渗入壳或从蛋中取出样品)并更容易实施，因此比文中上述的第四种现有技术更易产业化使用。

在本发明的至少一个实施例中，另一个目的是提供可靠的此类技术。

在下文看起来更清楚的这些目的和其它目的通过用于确定蛋的受精和/或性别的非侵入性装置实现。

根据本发明，所述装置包含用于针对入射光信号得到对壳特异的光谱响应(即壳特异性光谱响应)的装置，所述装置包含适于将所述入射光信号聚焦在壳的至少一层的表面部分和/或内部部分上的聚焦装置，和用于根据对壳特异的该光谱响应(或壳特异性光谱响应)确定蛋的受精和/或性别的装置。

因此，本发明的通用原理在于得到对入射光信号的壳特异性光谱响应并根据此光谱响应确定蛋的受精和/或性别。

为此，本发明因此实施所用的特定聚焦装置以将入射光信号聚焦在需检查的壳的非常精密的层的表面上和/或内部部分上。

因此，本发明的此特定实施例取决于非侵入性确定蛋的受精和/或性别的完全新颖的本发明方法，因为其取决于蛋壳的层的表面和/或内部部分的光谱法。实际上，如下文中进一步详述，发明人提出了假设，根据此假设，在胚胎的所有细胞中存在并在性别分化中起作用的鉴别物质并不只集中在性腺中而是遍布整个蛋中，但是尿囊液可以小但可测量的比例存在于壳表面和内部上。

可想到，第四种现有技术(发明人已知的唯一一种非侵入性技术)尝试与此相反，将壳从蛋去除而不需要壳的光谱响应，以只保留蛋中内容物(包含蛋白、蛋黄和胚盘)的光谱响应。

入射光信号是单波长光信号(即，具有单波长)或具有至少两个波长的多波长光信号(连续地或同时地)。

根据一个特定特征，入射光信号包含至少一个介于200至1100nm范围内的波长。

这些波长允许最佳功能。

根据一个特定方面，聚焦装置适于将入射光信号聚焦在壳外层的外表面的一部分上。

聚焦在壳表面上的优点是因为吸收更低，所以反射信号(例如反射的拉曼信号)具有更高值。

根据一个特定方面，聚焦装置包含相对于透镜具有聚焦距离D的探针和末端件，其第一端固定地附接到探针并放在离透镜距离d1处以及其第二端用于与蛋接触，末端件在第一端与第二端之间具有距离d2，且d2＝D-d1。

因此，此末端件允许探针始终距离蛋表面相同的距离。换句话讲，末端件允许装置轻易地适于所有尺寸的蛋而不需要额外的调整。因此，可自然地想到此类装置的产业化应用。

因为探针的透镜与蛋之间的距离通过在长度上校准的末端件固定，聚焦距离D可通过改变入射光信号的波长来轻易地调整。此方面也允许装置具有高精确度。此外，由于只考虑波长可变，所以此类装置的调整和维护更容易。

根据一个特定方面，用于得到光谱响应的装置包含探针，或所述探针，其适于将入射光信号传送到蛋并以零反射角接收入射光信号被蛋反射得到的反射光信号。

以此方式，即使反射光信号相对较弱，此类探针也确保并优化反射信号的恢复。

在本发明的一个特定实施例中，探针是拉曼类型探针。

此类探针允许在传送入射信号中以及在接收反射信号中的高精确度。

在本发明的一个特定实施例中，用于得到对壳特异的光谱响应的装置包含：

-衰减全反射探针，其包含接收入射光信号并产生反射光信号的晶体；

-光谱仪，其恢复由所述探针产生的反射光信号，以及

-加工装置，其被配置成根据所述入射光信号和所述反射光信号得到壳特异性光谱响应。

因为ATR探针的晶体与所研究的样品接触，所以用于得到壳特异性光谱响应的此类装置允许探针始终距离蛋表面相同的距离。此方面允许装置轻易地适于所有尺寸的蛋而不需要额外的调整。

在此光谱法中，一部分的入射信号被壳吸收，因此反射信号衰减。因为入射信号的光谱响应是已知的以及入射信号的光谱响应通过光谱仪精确地测量，所以对蛋壳特异的光谱响应可通过从入射信号的光谱响应减去反射信号的光谱响应而被加工装置轻易地推导出。换句话说，对壳特异的此光谱响应对应于由壳引起衰减的信号的光谱响应。

根据本发明的一个特定方面，用于确定蛋的受精和/或性别的装置包含用于将得到的光谱响应与至少一种参照光谱响应比较的装置。

此类比较利于确定蛋的受精和/或性别。实际上，所述比较装置可避免精确地确定存在的鉴别物质同时能够将得到的光谱的总体方面与一个或多个参照光谱的总体方面进行比较。

根据本发明的一个特定方面，所述至少一个参照光谱响应属于包含以下的群组：

-用于非受精蛋的第一参照光谱响应；

-用于包含死胚胎的受精蛋的第二参照光谱响应；

-用于包含雄性胚胎的受精蛋的第三参照光谱响应；以及

-用于包含雌性胚胎的受精蛋的第四参照光谱响应。

本发明还涉及一种用于确定蛋的受精和/或性别的非侵入性方法，其包含针对入射光信号从壳的至少一层的至少一部分得到光谱响应的步骤以及根据得到的光谱响应确定蛋的受精和/或性别的步骤。

附图说明

本发明的其它特征和优点将从以说明而非穷尽性实例的方式给出的以下说明，以及附图中明显看出，其中：

-图1显示受精蛋的简化结构；

-图2是蛋壳结构的截面图；

-图3呈示根据本发明的第一实施例的用于确定蛋的受精和/或性别的装置；

-图4是图3中装置的探针的功能的详细视图；以及

-图5说明利用图3中的装置得到的光谱的实例；以及

-图6呈示根据本发明的第二实施例的用于确定蛋的受精和/或性别的装置；以及

-图7是图6中装置的探针的操作的详细视图。

具体实施方式

基本原理

在本文件的所有附图中，相同步骤和元件由相同数值参考表示。

发明人基于多项观察得出结论，即：

1.胚胎的性别分化实质上不是由激素对性腺的作用导致的。

2.体细胞具有独立的性别认定。

3.参与雌性确定的主要物质包含：

a.涉及卵巢功能维护的蛋白，例如FOXL2；

b.由胚胎的卵巢分泌的雌激素，例如雌二醇；

c.协助类固醇激素转化成雌激素的酶，例如MHM或芳香酶(CYP19A1)；

d.存在于多种雌性胚胎组织中的遗传物质(例如基因HINTW(或WPKCI))以及基因DAX1、WNT4、FET1。

4.参与雄性确定的主要物质包含：

a.负责雌性上生殖道的消退的激素，例如AMH；

b.在睾丸的形成中起作用的遗传物质(例如基因DMRT1)或参与性腺形成的SOX9。

上述物质(下文也称为鉴别物质)具有不同类型：

●由生物合成得到的降解产物，例如表示类固醇存在的芳香酶、在雌性胚胎中以比雄性胚胎更大的量存在于尿囊液中的激素AMH、MHM酶或HINTW基因；

●类固醇(例如雌二醇)也存在于尿囊液中。

发明人提出这个假设，存在于胚胎的所有细胞中并在性别分化中起作用的这些鉴别物质不是只集中在性腺中而是通过尿囊液分散在蛋中并可以微小但可测量的比例向壳迁移并穿过壳(在水蒸气或CO2排放期间)或固定在壳中。视其尺寸而定，可在壳表面上见到或结垢在壳中(例如在壳膜中)。

如图1所示，蛋包含壳10和内部内容物本身，其包含蛋白20、蛋黄30和胚盘40。

如图2所示，壳10具有六层叠加，即(从蛋白20开始)：壳内膜11、壳外膜12、乳房层13、栅栏层14、穿孔17、单层垂直晶体(15)和最终的封装所有矿物质层的角质层16。

如上所述及图1中所示，多种鉴别物质15不仅存在于内层中(以及更具体地存在于蛋白20中)也存在于壳20的表面和/或内部。虽然小，但在壳20表面上和/或在壳20中的这些鉴别物质50的存在和量可通过光谱法测量。

第一实施例的说明

现参照图3，我们呈示了根据本发明的第一特定实施例的确定蛋的受精和/或性别的装置100。

拉曼光谱法是一种用于表征材料的结构的分子组成的非破坏性分析技术。此技术基于在样品与单色光束(拉曼散射)相互作用后对非弹性散射光子的检测。激发光子与反射光子之间的频率差提供关于引起散射的物质(分子)的化学性质的信息。换句话讲，拉曼散射是一种物理现象，通过该现象，介质能够轻微地改变流入其中的光的频率。此频率偏移对应于光线与介质之间的能量交换。此交换可具有多个起因：晶体或分子的振动、磁激发等。此偏移的测量可将此现象追溯到环境的某些性质。

在以下所述的特定实施例中，拉曼光谱法用以确定蛋的受精和/或性别。但是，明显的是，本发明不限于此类光谱法而可利用可用于得到壳的至少一层的至少一部分的光谱响应的任意技术实施。以下进一步所述的第二实施例是其实例。

所提出技术的基本原理如下：壳的小表面接收具有限定波长的至少一种入射电磁波。根据所用技术，产生的点(以下称为焦点或聚焦区域)具有例如几微米至150微米的直径。

入射波的更大部分以相同频率被反射以及入射波的小部分以不同频率被反射。视所用光谱法的类型而定，使用反射波的任一种。

在所呈示的实施例中，装置100包含：

●用于得到对蛋1的壳10特异的光谱响应的装置200。这些装置200包含光源101、第一光纤102、探针110、末端件104、第二光纤105和光谱仪106；

●用于根据对壳10特异的光谱响应确定蛋1的受精和/或性别的装置300。这些装置300包含计算机107、数据库109和显示单元108。

光源101例如是能够产生入射光信号的激光器。更具体地讲，由激光器101产生的光信号是例如具有单波长的电磁波，优选地位于200nm与1100nm之间(以及又更优选地位于500nm与700nm之间)。

在一个变体中(多波长光谱法)，入射光信号是具有至少两个波长(连续或同时)的每个在200nm与1100nm之间的多波长信号。此变体可得到更完整的光谱以及因此更可靠的结果。也消除了对荧光的需求。

探针110和末端件104一起形成聚焦装置。第一光纤102用以将入射光信号传送到探针110。

末端件104在长度上被校准并固定地附接到探针110。其能够使探针110距离蛋1恒定的距离。末端件104的第一端固定地附接到探针110以及末端件104的第二端接触蛋1。

因为被蛋1的壳10的表面反射的光信号的响应相对较小，所以在一个特定实施例中，探针110适于在与入射信号相同的轴线上恢复反射的信号。此类型的探针更常见地被称为拉曼探针。

此拉曼探针110的操作原理在图4中显示。来自第一光纤102的入射光信号通过第一透镜111准直。准直光是一种光，其光线基本上平行并在传播时被缓慢地展开。换句话讲，其是不随距离分散(理论上)或非常小程度地分散(实际上)的光。此准直信号然后通过第二透镜112被聚焦在位于所检测壳10的表面或内部的焦点或聚焦区域113上。焦点113也被称为点。

由于第一和第二透镜(111，112)被固定，所以聚焦距离只可通过改变入射光信号的波长来修改。文中，探针110的聚焦距离D被定义为第二透镜111与点113之间的距离。

在一个特定实施方式(图3中所述)中，点113位于壳10的外层16的外表面上。为此，根据公式：d2＝D-d1得到末端件104的长度d2，其中d1是末端件104(固定地附接到探针104)的第一端与透镜112之间的距离。离第一端距离d2的末端件104的第二端与蛋的外表面接触。

在此特定实施方式中，入射光信号被(对应于点113的蛋的表面的一部分)反射以及反射信号通过相同透镜112收集/准直，然后通过二色镜114导向光谱仪106。

为了优化光谱仪106接收的信号，通过二色镜114导向的信号首先通过用以消除瑞利散射的高通光学滤波器115，然后通过第三透镜116聚焦，最后通过第二光纤105传送到光谱仪106。

光谱仪106分析接收的信号并将光谱响应送到用以确定蛋1的受精和/或性别的装置300。

在用于确定蛋1的受精和/或性别的装置300中，计算机107和数据库109形成比较装置。这些装置用于利用光谱仪106传送的光谱响应并将其与参照光谱响应库比较。此比较涉及光谱响应的一个或多个线的幅度或整个光谱响应的状况。

一个特定实施例使用以下四个参照光谱响应：

-用于非受精蛋的第一参照光谱响应；

-用于包含死胚胎的受精蛋的第二参照光谱响应；

-用于包含雄性胚胎的受精蛋的第三参照光谱响应；

-用于包含雌性胚胎的受精蛋的第四参照光谱响应。

在一个变体中，非受精蛋群组和包含死胚胎的受精蛋群组可被分组在同一个群组中。换句话说，第一和第四参照光谱响应是同一个参照光谱响应。

显示单元108能够显示得到的光谱响应以及此光谱响应与参照光谱响应的数据库的比较结果。

得到数据库109包含例如以下步骤：

●步骤1：分批地(“配置分批”)，在不同的孵化日，对每个蛋读取拉曼光谱(参照图3和图4的根据上述技术的壳的光谱响应)；

●步骤2：进行相关联以确定光谱之间不同的区域(确定区域)。此方法用以将光谱分类(参照光谱响应)。

●步骤3：小鸡的性别鉴定则能够将这些类别分类，即，与以下信息片段中一个的每个类别的关联：“雄性胚胎”、“雌性胚胎”和“无精蛋或死胚胎”。

步骤1至3可对多个“配置批次”重复。数据库109因此通过新测量值的常规输入而增加。

涉及蛋的受精和/或性别的判定算法包含例如用于给定批次(“待检测批次”)的每个蛋的以下步骤：

●步骤a：对待检测的蛋读取拉曼光谱(参照图3和图4的根据上述技术的壳的光谱响应)；

●步骤b：对每个确定区域(参照上述定义)评价测量的质量，例如通过计算光谱的一阶导数和二阶导数。质量标准例如通过考虑由在区域中测量的最大偏差表示的测量的动力学、由一阶导数给出的区域中的斜率倒数值表示的数据变化和由在区域中的二阶导数的标准偏差给出的噪音水平来进行计算；

●步骤c：如果质量标准不足够，则对确定区域，通过与数据库的不同参照光谱关联来比较光谱以确定其类别并因此确定其性别(“雄性胚胎”、“雌性胚胎”和“无精蛋或死胚胎”)。

图5说明利用图3中装置100得到的对壳10特异的光谱响应(光谱)的实例。此光谱表示存在于蛋1的壳10的表面和/或内部上的物质50的响应组合。这些光谱与文献中提到的生物样品的光谱的比较能够将某些化合物或分子的存在与可视条带关联。例如，A条带与碳酸钙相关联，B条带与类胡萝卜素相关联，C条带与DNA相关联，D条带与脂质或蛋白结构相关联以及E条带与苯丙氨酸相关联。将数据库与这些条带比较以及与其中信号较弱的中间条带(例如在800cm^-1至900cm^-1区域中)比较。

在此实施例的一个变体中，计算末端件104的长度d2以使得焦点113位于壳10的一层中。换句话讲，鉴别物质50不再试图存在于壳10的外层16的外表面上而是在形成壳10的层(11、12、13、14、15和16)中的一个的内部。

第二实施例的描述

图6示出第二实施例，其中蛋的受精/性别通过衰减全反射红外光谱法(称为“ATR光谱法”)确定。

在此第二实施例中，装置100包含：

●用于从蛋1的壳10的至少一层的至少一部分得到光谱响应的装置400。这些装置400包含光源401、第一光纤402、探针410、晶体404、第二光纤405、光谱仪406和加工装置407；

●用于根据对壳10特异的光谱响应确定蛋1的受精和/或性别的装置500。这些装置500包含计算机507、数据库509和显示装置508。

光源401是多色源，比如例如能够提供入射光信号的二氧化碳激光器或受热的碳化硅长丝，该入射光信号的波长位于红外或近红外中。

探针410和晶体404一起形成聚焦装置。第一光纤402用以将入射光信号传送到探针410。

探针410是ATR(衰减全反射)类型探针并包含红外线可穿透的晶体404。晶体404具有高反射/折射指数或在任意情况中的比样品(文中，蛋1的壳10)的折射指数更高的反射/折射指数。

晶体404用于与蛋壳10接触并因此能够使探针410距离蛋1恒定的距离。

如图6和图7中所示，入射光信号Si被第一光纤402传送到探针410。入射光信号Si通过晶体并在理论上完全被晶体端反射。然后，反射的光信号Si通过第二光纤405朝光谱仪406传送。

但是，实际上，此反射现象因损耗波Oe的形成而受到干扰，损耗波Oe在入射光信号Si与壳10接触期间产生。实际上，入射光信号Si被壳10部分地吸收，因此使反射的光信号Sr衰减。

由光谱仪406得到的光谱响应随后必须通过加工装置407加工以得到对壳10特异的光谱响应，即，损耗波Oe的光谱响应Roe。

因为入射光信号Si的光谱响应RSi和反射光信号Sr的光谱响应RSr是已知的，所以足以导出损耗波Oe的光谱响应Roe。为此，从入射信号的光谱响应减去反射信号的光谱响应就够了，因此：

ROe＝RSi-RSr

损耗波Oe的光谱响应Roe等于/表示壳10的光谱响应。

加工装置407则向用以确定蛋1的受精和/或性别的装置500提供对壳特异的光谱响应。

在用于确定蛋1的受精和/或性别的装置500中，计算机507和数据库509形成比较装置。这些装置可利用由加工装置407传送的光谱响应并将其与参照光谱响应库比较。此比较涉及光谱响应的一个或多个线的幅度或整个光谱响应的状况。

此比较能够检测存在于壳10表面上的鉴别化学物质以确定蛋1的受精和/或性别。

显示单元508用以显示对壳特异的光谱响应以及此光谱响应与参照光谱响应的数据库的比较结果。

更一般地，计算机507、数据库509和显示单元507具有与参照第一实施例更详细描述的计算机107、数据库109和显示单元108相同的结构和操作。