诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度的方法

摘要

本发明涉及了一种诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度的方法，包括：在用于珊瑚藻培养的海水中加入蛋氨酸锌有机微量元素螯合物，充分搅匀，使培养液中蛋氨酸锌有机微量元素螯合物的最终浓度达到0.05mg.L

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物技术和农业资源开发领域，具体是涉及一种诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度的方法。

背景技术

科学研究已经确切证明，组成机体的元素共计有18种，分为常量元素和微量元素。常量元素是指含量占机体重量0.01％以上的元素；微量元素是指含量占机体重量0.01％以下的元素。其中，碳、氮、氧、氢、钙、磷6种元素占机体总量的99％，称之为常量元素，其余的12种元素约为1％，因而称为微量元素，它们是碘、硫、钠、氯、铁、铜、钾、镁、锰、钴、锌、硒。它们量虽少，但作用极为重要，不可多，不可少，缺一不可。其中，锌是生物体内200多种酶的激活剂和调节因子的组成成分,这些酶主要包括碳酸酐酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶等,锌通过各种酶和调节因子发挥多种重要的生理功能。在海洋环境里，锌是藻类细胞生长与代谢中的必需元素。锌是藻类碳酸酐酶的组成成分，缺锌时呼吸和光合作用均会受到影响。锌也是谷氨酸脱氢酶及羧肽酶的组成成分，因此它在氮代谢中也起一定作用，缺锌会影响氮代谢过程。研究表明，培养液中适当浓度的微量元素锌对盐藻细胞生长和物质积累有促进作用，而锌浓度过高或过低则都是相对不利的。

有机微量元素是指微量元素的无机盐与有机物及其分解产物形成的化合物。有机微量元素可主要为6类：①金属元素特定氨基酸复合物，由可溶性的金属盐类与特定的氨基酸复合而成，一般是由单一已知氨基酸与单一金属离子结合；②金属元素氨基酸复合物，由一个特定的可溶性金属盐类(如锌、铜、锰盐)与一个氨基酸复合而成；③金属元素氨基酸螯合物，由一个可溶性金属盐类中的金属离子与氨基酸相反应而成；④金属元素蛋白盐，由一个可溶性金属盐类与氨基酸或部分水解的蛋白质螯合而成；⑤金属元素多糖类复合物，由一个可溶性盐类和多糖类溶液复合而成，这类物质只是一种有机矿物质，含有的矿物质和多糖类之间没有任何化学键存在；⑥金属元素有机酸盐，由可溶性金属元素与可溶性有机酸相结合而成。

有机微量元素具有以下的生物学特性：1、化学结构稳定。金属元素氨基酸螯合物中的金属离子与氨基酸配位体以共价键和离子键结合，微量元素被封闭在螯合物的螯环内，化学性质稳定；2、生物学效价高。一般无机盐及简单有机盐中的金属元素被生物体摄入后，必须与氨基酸或其他物质螯合后才能被机体吸收。大量研究表明，有机微量元素比无极微量元素的生物学效价高。研究表明，与Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺的硫酸盐相比，其相应蛋氨酸羟基类似物的螯合物相对生物活性更高。近些年来，有机微量元素水溶肥料在植物上的应用逐步增多，例如在油菜上的增产效应，氨基酸锌有机微肥在降低苹果小叶病等方面，还有提高水稻秧苗素质和产量，防止倒伏；有机微量元素硼、硒肥料还能提高蔬菜生理作用，改善蔬菜口味等等。例如美国著名肥料品牌戴乐锌就属于使用纯天然螯合剂的有机微量元素肥料产品，以糖醇为运输载体，预防和矫正作物缺锌。施用后能快速被植物根系、叶片、枝茎、花果吸收利用，能促进根系和生殖生长，提高作物抗旱、抗热、抗寒和抗病能力，肥效明显。而且经有机物螯合的戴乐锌耐雨水冲刷，施用于作物，能很好的粘附在其表面，肥效持久。然而，氨基酸锌等有机微量元素对于海洋藻类的生理效应，仍很不清楚，属于研究空白。

多糖，又称多聚糖，具有复杂的单糖组成与结构，广泛存在于动物、植物、微生物中，是所有有机生命体必不可少的组成成分，具有多方面的生物活性和功能，维持着有机体的种种生命机能。多糖具有独特的生物学活性，其入药始于1943年。以往，人们对多糖的研究多集中于黄芪和灵芝等药用植物类多糖的生物活性。近年来，随着海洋药物的兴起，人们逐渐发现海洋藻类多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射和降血糖等活性功效，其作为药物和药物中间体的研究已成为药物研究的重点。由于海洋藻类的生长条件和环境特点，决定了海洋藻类多糖具有一些有别于陆生植物多糖的结构和功能。因此，加快海洋藻多糖的开发可以弥补陆地植物多糖药用特性的不足。近年来随着海洋药物的兴起,人们逐渐发现海洋藻类多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗辐射和降血糖等活性功效,其作为药物和药物中间体的研究已成为药物研究的重点。对螺旋藻(Spirulina sp.)、盐藻(Dunaliella salina)、小球藻(Chlorella sp.)和紫球藻(Porphyridium cruentum)等藻类多糖的提取、分离纯化和生物活性等已进行了大量的研究。生物活性多糖生理活性广泛，已被证明有抑菌性和抗炎性。Matsui等报道了红藻硫酸多糖抑制皮肤出现红斑。常向东等发现葛仙米水溶性多糖有抑制霉菌、大肠杆菌及绿脓杆菌的活性。Martins等研究表明伞菇多糖能够促进小鼠腹膜巨噬细胞杀死感染的白色念珠菌。生物活性多糖的抗菌和抗炎作用越来越受到重视。

近几年来,红藻中的多糖成分因其具有抗氧化、抗病毒、抗凝血和抗肿瘤等多种生物活性而受到国内外的广泛关注。从红藻植物发现的主要化合物结构类型有多糖、萜类、本类、脂肪酸、酚类等并含有少量生物碱、脂肪烃、糖苷类化合物。药理活性筛选表明：红藻植物中的大量化合物显示抗凝血、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、酶抑制、降压等生物活性。红藻多糖是从麒麟菜、江蓠等红藻中提取出来的富大量硫酸根的多聚糖，是一种具有重要经济价值的高粘度、高凝胶强度的线性高分子海藻多糖。经过国内外专家学者长期研究结果表明：红藻中提取的多糖具有多方面的生物活性，如抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、提高机体免疫力等。

藻类胞外多糖是一种酸性杂多糖，超过75％的多糖由6种以上单糖组成，葡萄糖是出现频率最高的单糖。胞外多糖的性质因种而异，多数蓝藻的胞外多糖呈现阴离子特性，这主要是由于糖醛酸和硫酸基团等带电基团的存在，而乙酰基团、缩氨酸部分及脱氧糖等疏水基团的存在使多糖呈乳化特性。因此，海藻胞外多糖在食品、化妆品、制药、污水处理等行业有广阔的应用前景。近年来发现多糖类化合物在免疫系统中起着关键的作用,不仅能作为生物效应调节剂影响巨噬细胞、淋巴细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞、细胞毒细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞等免疫细胞的分化、成熟和繁殖,还能影响抗体的生成和补体的活化，抗肿瘤，抗病毒，抗氧化衰老。目前,藻类胞外多糖化合物已经作为一种免疫调节剂应用于癌症的免疫治疗,它可恢复因化疗导致的免疫功能低下,提高宿主的免疫功能或对肿瘤细胞呈致毒作用,抑制肿瘤生长。此外,胞外多糖类化合物还具有抗病毒、抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、抗衰老、艾滋病等作用，具有巨大的资源开发潜力。

珊瑚藻(Coralline algae)是属于红藻门(Rhodophyta)、红藻纲(Rhodophyceae)、真红藻亚纲(Florideophycidae)、珊瑚藻目(Corallinales)的一类钙化藻，是一群细胞壁含有大量碳酸钙、叶状体坚硬、生物多样性丰富的特殊植物类群，由于其藻体钙化程度较高，某些种类藻体在外观上与造礁石珊瑚非常相似，故称之为珊瑚藻。珊瑚藻在珊瑚礁生态系统中发挥着重要的功能性作用，是珊瑚礁生态系统中不可或缺的生物类群之一。珊瑚藻的生态功能是珊瑚礁生态学研究中的一个重要研究内容，相关研究工作主要集中在珊瑚藻的初级生产力、钙化与生长以及在诱导底栖无脊椎动物幼虫附着与变态等方面，珊瑚藻在珊瑚礁发育、造礁造岩过程中发挥着重要作用。珊瑚藻在全球海洋中广泛分布，种类达数百种，中国现有记录的珊瑚藻种类共有77种，为人类广泛食用。珊瑚藻具有较宽的生态幅，从两极到热带海域、从潮间带到400m水深的海底，甚至在巴哈马880m水深的海底也发现了存活的壳状珊瑚藻(Crustose Coralline Algae,CCA)。据《全国中草药汇编》记载,珊瑚藻全藻供药用,具有驱蛔虫之功效。作为一种珍贵稀有海藻,生物学家研究发现其具有抗肿瘤活性。

然而目前，在海藻胞外多糖资源的开发利用技术中，较少采用微量元素诱导藻类多糖分泌的生物技术，尤其是通过制备应用有机微量元素，促进珊瑚藻的胞外多糖分泌，提高胞外多糖生物活性，从而明显增强珊瑚藻生产高活性海洋生物产物胞外多糖的能力，提高珊瑚藻类海洋生物资源利用价值的相关技术仍是空白。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种蛋氨酸锌有机微量元素螯合物及其制备方法，所制备得到的氨酸锌有机微量元素螯合物可有效用于诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度。

实现上述目的的技术方案如下。

蛋氨酸锌有机微量元素螯合物的制备方法，包括以下步骤：

将蛋氨酸溶于蒸馏水中,加入蛋氨酸质量的2±0.5％的碱式碳酸锌,70℃～85℃搅拌反应4～6h；加入盐酸溶液,加热至蛋氨酸全部溶解,溶液呈透明淡黄色；

调节pH值为6.0～6.5，在不断搅拌情况下趁热过滤；

加入无水乙醇将螯合物沉淀出来,经离心分离，再于105℃～115℃烘干,得到白色产物，即得。

上述蛋氨酸锌有机微量元素螯合物采用液相法制备，制备工艺步骤依次为：氨基酸→溶解→加金属盐→调节pH值→加热螯合物→加有机溶剂沉淀→分离→干燥→产品。上述制备方法的资源利用率高，生产设备较简单，生产效率高，基本无环境污染。

本发明的另一目的是提供一种诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度的方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度的方法，包括以下步骤：在用于珊瑚藻培养的海水中加入上述蛋氨酸锌有机微量元素螯合物，充分搅匀，使海水中蛋氨酸锌有机微量元素螯合物的最终浓度为0.05mg.L^-1～0.15mg.L^-1，对珊瑚藻进行培养。

本发明的诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度的方法，通过在用于珊瑚藻培养的海水中添加有蛋氨酸锌有机微量元素螯合物，能明显促进珊瑚藻生理活性,提高珊瑚藻胞外多糖分泌强度，从而增强珊瑚藻资源利用价值，改善珊瑚藻的环境适应能力和逆境抗性，因此具有明显的海洋生物资源利用与环境保护价值。

具体实施方式

本发明的其中一个实施例涉及了蛋氨酸锌有机微量元素螯合物，其制备方法，包括以下步骤：

将蛋氨酸溶于蒸馏水中,加入蛋氨酸质量的蛋氨酸质量2±0.5％的本实施例加入2％碱式碳酸锌,70℃～85℃搅拌反应4～6h；加入1mol/L盐酸溶液,加热至蛋氨酸全部溶解,溶液呈透明淡黄色；

调节pH值为6.0～6.5，在不断搅拌情况下趁热过滤；

加入无水乙醇将螯合物沉淀出来,经离心分离，再于105-115℃烘干,得到白色产物，即得到蛋氨酸锌有机微量元素螯合物。

本实施例还涉及到一种诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度的方法，包括以下步骤：在用于珊瑚藻培养的海水中加入上述方法制备得到的蛋氨酸锌有机微量元素螯合物，充分搅匀，使海水中蛋氨酸锌有机微量元素螯合物的最终浓度达到0.05mg.L^-1～0.15mg.L^-1，最优选为0.10mg.L^-1对珊瑚藻进行培养。

上述制备得到的蛋氨酸锌有机微量元素螯合物，按照上述诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度的方法进行以下实验，结果表明，添加有机微量元素蛋氨酸锌，能明显诱导珊瑚藻提高胞外多糖分泌强度，增加胞外多糖的自由基清除能力，进而提高珊瑚藻的生理活性和生长速度。

试验例1有机微量元素对珊瑚藻胞外多糖分泌和生理活性的影响

1.1试验材料

珊瑚藻(Corallina officinalis)属于红藻门隐丝藻目珊瑚藻科,是在中国和很多其它国家广泛食用的一种红藻。珊瑚藻又名钙化藻，属红藻门，藻体直立丛生，生出羽状侧枝，再生出复羽状小枝。主枝与侧枝的节间基部为圆柱形，中部及上部略扁，向上端稍有扩展，枝顶端的节间圆柱状，前端稍平，小羽状枝的节间圆柱形，有时略扁，生于潮下带及中、低潮带的岩石上或石沼内。试验用珊瑚藻样品采集于深圳大鹏湾潮间带,将采集的鲜活海藻去除杂藻,挑选生长旺盛且相对完整的藻体，用蒸馏水洗去泥沙及其他附着物,用混合抗生素对藻体组织表面作灭菌处理,再用灭菌海水漂洗3～4次，放入锥形瓶中进行培养，每瓶添加藻体质量为3.0±0.05g。试验中将珊瑚藻样品分为对照组、试验组Ⅰ和试验组Ⅱ。在试验组Ⅰ和试验组Ⅱ分别加入ZnSO₄·7H₂O和上述制备方法得到的述蛋氨酸锌有机微量元素螯合物(以下简称蛋氨酸锌)，使海水中ZnSO₄和所述的蛋氨酸锌有机微量元素螯合物的最终浓度分别达到0.1mg.L^-1,而对照组内不添加任何元素，温度为20℃,光强为70μmol·m^-2·s^-1,光暗比为12h∶12h，每天摇动藻体2次，每隔2d换一次水，共培养15d。培养结束时分别测定藻体的鲜重。海藻测完鲜重后于40℃烘干,粉碎过40目筛，保存于干燥器中备用。海藻粉每100g经85％乙醇回流提取2次后,干燥,得藻粉91.06g。此方法不仅可脱脂,而且能去除小分子以及盐等杂质,有利于后续多糖的纯化。

1.2珊瑚藻糖类的测定

细胞总糖是将磨碎的新鲜藻样加入6mol/L HCl于100℃煮沸30min,冷却后用6mol/L NaOH中和至pH 7,离心(8000g,10min)后上清液即为细胞总糖粗提液。总糖粗提液加水溶解，定容至5 0m l，再用氯仿-正丁醇混合溶液萃取洗涤残留蛋白，上清液减压浓缩至原体积的1/3,加入浓度为2mmo l/L的三氯乙酸沉淀蛋白4℃下静置3h。5 000r/min离心15min去沉淀,加入4倍体积的乙醇到上清液中,静置过夜,所得的沉淀物即为胞内粗多糖。上清液于60℃旋转蒸发浓缩,透析96h以去除小分子物质。透析后,加入乙醇并静置过夜。所得醇析物用适量蒸馏水溶解后,加入三氯乙酸,充分摇匀,4℃下静置3h,5 000r/min离心15min去沉淀,上清液加入乙醇醇析,所得沉淀物即为胞外粗多糖。取粗多糖适量,用蒸馏水充分溶解,抽滤去除杂质,滤液用Sevage法除去蛋白质,至游离蛋白质完全去除(分层后中间无蛋白质带),将上层溶液置于透析袋中,用自来水淋洗48h,再对蒸馏水透析24h,用3倍体积的无水乙醇沉淀多糖,静置12h,4 000r/min离心10min后取沉淀,沉淀在冰箱中冷冻24h后真空冷冻干燥,即得精制多糖。将精制多糖用蒸馏水溶解,按要求配成不同剂量的溶液,即可进行余下实验。以上所得的细胞总糖、胞外多糖、胞内多糖的定量测定均利用苯酚硫酸法进行。

1.3海藻鲜重和相对生长率的测定

分别在实验开始和结束时对珊瑚藻体的鲜重进行测量，测定时先用吸水纸将藻体表面的海水吸干，迅速称得鲜重。海藻相对生长率按式(1-1)计算：

相对生长率(RGR，％)＝(ln Wt-ln Wo)/t×100％[61]式(1-1)

注：Wo为实验开始时海藻的鲜重，Wt为实验t天后海藻的鲜重。t为实验中藻类培养时间，单位(d)。

1.4胞外多糖自由基清除能力测定：

胞外多糖对于羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O₂^－·)，总抗氧化能力(T-AOC)的测定。采用南京建成生物工程研究所的总抗氧化能力(T-AOC)及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)清除能力以及可溶性蛋白含量采用试剂盒测定，蒸馏水空白对照，Vc作阳性对照，准确吸取胞外多糖样品待测溶液2mL，与自由基底物充分混合后在37℃水浴中反应30min测吸光度，计算胞外多糖样品对各类自由基的清除率。试剂盒购于南京建成生物工程研究所，实验过程严格按照试剂盒说明书操作。叶片丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸比色法；细胞膜透性用相对电导率表示，采用电导率仪测定。取0.2g左右的新鲜藻体放入试管中，用去离子水浸泡0.5h，期间换水两次，将浸泡好的材料，放入装有10m>

1.5数据处理

所有试验数据采用SPSS18.0进行分析,采用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验各处理与对照的差异显著性。数值P<0.05为有显著性差异。

1.6结果分析

表1不同处理下珊瑚藻细胞多糖含量相对百分数

由表1可知，与对照相比，补充微量元素锌的培养条件下珊瑚藻的胞内多糖和胞外多糖含量均有所升高，细胞总糖含量也随之上升。与常规无机锌处理相比，蛋氨酸锌处理的珊瑚藻的胞内多糖、胞外多糖以及细胞总糖含量均有明显增加(P<0.05)。

表2不同处理下珊瑚藻设置生长及生理特性指标相对百分数

相对百分数(％)对照组试验组Ⅰ试验组ⅡRGR(相对生长率)100104108MDA含量1009387细胞电导率1009592可溶性蛋白质含量100102117

表2结果显示，锌微肥(ZnSO₄)处理能促进珊瑚藻生长，而以本发明所述的蛋氨酸锌有机微量元素螯合物处理效果更明显。

蛋氨酸锌制备的微量元素肥(蛋氨酸锌有机微量元素螯合物)还能明显增加藻体可溶性蛋白含量，增长幅度达到17％。常规无机锌对于珊瑚藻可溶性蛋白含量方面作用与蛋氨酸锌相比效果不明显。

丙二醛(MDA)含量的高低可以反映生物膜脂过氧化强度和膜系统受伤害的程度，是逆境生理研究中的一项重要指标。从表2可以看出，蛋氨酸锌制备的微量元素肥处理下，珊瑚藻体内MDA含量都有降低趋势，效果好于常规无机锌处理。

与此相类似的是，所述蛋氨酸锌有机微量元素螯合物处理能有效降低藻体内的细胞电导率，降低幅度达到8％，效果好于常规微生物菌肥(ZnSO₄)处理。

表3不同处理下珊瑚藻胞外多糖自由基清除率相对百分数

由表3结果可知，所述蛋氨酸锌有机微量元素螯合物能明显增强珊瑚藻分泌胞外多糖的自由基清除能力，常规无机锌对于胞外多糖清除自由基，提高抗氧化能力方面作用效果不显著。

所述蛋氨酸锌有机微量元素螯合物培养下珊瑚藻胞外多糖总抗氧化能力(T-AOC)明显升高28％，达到了显著效果(P＜0.05)。在自由基清除效果方面，胞外多糖清除最明显的是DPPH自由基，达到32％，其次是超氧阴离子自由基，达到24％，均达到了显著效果(P＜0.05)。羟基自由基清除率(24％)与其它两种类型自由基变化趋势类似。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。