腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒

摘要

本发明公开了腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒，生物标志物包括甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)。联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，AUC为0.872，具有一定准确度。本发明提供的生物标志物可以用于无创诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，克服膀胱镜检查的不足，有望代替活检，可以开发成诊断试剂或试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及生物标志物，具体涉及腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒，用于无创诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌。

背景技术

腺性膀胱炎是一种黏膜增生性病变，镜检除见上皮细胞巢、腺体和小囊肿外，在固有膜内尚有不同程度的浆细胞浸润【参考文献：汤昊等，第二军医大学长海医院泌尿外科，腺性膀胱炎及其诊治，临床泌尿外科杂志，2008年】。PantuckAJ等通过免疫组化方法发现了腺性膀胱炎及膀胱癌中单抗表达的相关性，证实腺性膀胱炎是膀胱癌的癌前病变，同时容易被误诊为膀胱癌【参考文献：Adenocarcinoma of the urachus and bladder expresses a unique colonic epithelial epitope:an immunohistochemical study,J Urol.1997 Nov；158(5):1722-7】。

腺性膀胱炎临床表现为尿频、尿急、尿痛、排尿困难、肉眼或镜下血尿，如并发肾积水，可出现腰酸、腰胀等不适症状。影像学检查中，B超、IVU可发现膀胱占位性病变，但无特异性；CT检查敏感性高，当发现膀胱内占位性病变伴膀胱壁广泛增厚时，要高度怀疑本病，增强扫描对鉴别膀胱癌和腺性膀胱炎意义不大。所有这些都是非特异性的，确诊主要依据膀胱镜检加活检。膀胱镜检可见：(1)滤泡样水肿，表现为片状浸润型的滤泡状水肿隆起或绒毛状增生；(2)膀胱黏膜乳头状增生，可见带蒂的乳头状物，充血水肿；(3)慢性炎症，表现为局部黏膜粗糙、血管纹理增多及模糊不清；(4)黏膜无显著改变。其中乳头状病变与膀胱乳头状肿瘤很难鉴别，仔细观察可发现腺性膀胱炎的乳头状肿物末端透亮且无血管进入，而膀胱乳头状肿瘤则末端不透亮且可见有血管进入乳头。但确诊只能依据活检。【参考文献：汤昊等，第二军医大学长海医院泌尿外科，腺性膀胱炎及其诊治，临床泌尿外科杂志，2008年】。但是，膀胱镜检查有很多禁忌，如尿道、膀胱处于急性炎症期不宜进行检查，膀胱容量过小不宜进行检查，妇女月经期或妊娠3个月以上不宜进行检查。而且，术前准备和术后处理繁琐。这些增加了检查者的身体和心理痛苦。

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院泌尿外科丁德鑫等研究了腺行膀胱炎和膀胱癌中livin和caspase-9的表达，结果发现livin和caspase-9在腺行膀胱炎和膀胱癌中差异表达，提示livin和caspase-9可以作为诊断早期膀胱癌的检测指标【参考文献：丁德鑫等，腺性膀胱炎及膀胱癌中livin和caspase-9的表达，现代生物医学进展，2016】。上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院泌尿外科杨安卿等发现P27蛋白阳性表达率在正常膀胱组织、腺性膀胱炎组织及膀胱癌组织中分别为80％、48.84％及32％，其中后两者显著低于前者，表明P27蛋白的减弱或缺失，与腺性膀胱炎及膀胱癌的发生密切相关，可以作为诊断早期膀胱癌的检测指标【参考文献：杨安卿等，P27蛋白在腺性膀胱炎的表达及其与膀胱癌的关联，贵州医药2016年7月第40卷第7期】。国内外的类似研究也都关注于蛋白分子的表达。

申请人2016年11月14日提交了两份申请(申请号为2016109975148和201610997535X)，分别以外周血循环微小RNA和血浆代谢物为生物标志物对不同类型的腺性膀胱炎进行诊断分型，可以将这些生物标志物制备成诊断区分腺性膀胱炎的诊断试剂，不通过介入手段就可以对腺性膀胱炎诊断分型，仅需患者少量血浆，检查时没有禁忌，克服了膀胱镜检查的不足。

申请人在研究腺性膀胱炎和膀胱癌患者血浆中微小RNA谱和代谢物谱时，发现了可以准确诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的标志物，可以用于开发成诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的诊断试剂或试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物，用于无创诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，以克服膀胱镜检查的不足，有望代替活检。

本发明上述目的是通过以下技术方案得以实现：

循环微小RNA角度：

用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的生物标志物，包括SEQ ID NO.1所示的miR-383-3p、SEQ ID NO.2所示的miR-423-3p、SEQ ID NO.3所示的miR-299-5p。联合应用miR-383-3p、miR-423-3p和miR-299-5p诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，AUC为0.844，具有一定准确度。

进一步包括SEQ ID NO.4所示的miR-371a-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

进一步包括SEQ ID NO.5所示的miR-215-5p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

进一步包括SEQ ID NO.6所示的miR-423-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

进一步包括SEQ ID NO.4所示的miR-371a-3p和SEQ ID NO.5所示的miR-215-5p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

进一步包括SEQ ID NO.4所示的miR-371a-3p和SEQ ID NO.6所示的miR-423-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

进一步包括SEQ ID NO.5所示的miR-215-5p和SEQ ID NO.6所示的miR-423-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

进一步包括SEQ ID NO.4所示的miR-371a-3p、SEQ ID NO.5所示的miR-215-5p和SEQ ID NO.6所示的miR-423-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

生物标志物在制备诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的诊断试剂或诊断试剂盒方面的用途。

SEQ ID NO.1所示的miR-383-3p在预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变易感性方面的应用。miR-383-3p在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调1.8～2.2倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调2.3～2.5倍，表明miR-383-3p可以预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变的易感性。

小分子代谢物角度：

用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的生物标志物，包括甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)。联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，AUC为0.872，具有一定准确度。

进一步包括二酰基磷脂酰胆碱(40:4)。进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

进一步包括次黄嘌呤。进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

进一步包括二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和次黄嘌呤。进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。

所述生物标志物源于血浆。

生物标志物在制备诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的诊断试剂或诊断试剂盒方面的用途。

甲基巴豆酰肉碱和花生四烯酸在预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变易感性方面的应用。甲基巴豆酰肉碱在腺性膀胱炎患者血浆中水平比膀胱正常人上调2.4～2.6倍，在膀胱癌患者血浆中水平比腺性膀胱炎患者进一步上调1.9～2.3倍；花生四烯酸在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调3.6～3.9倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调1.6～2.0倍。这表明甲基巴豆酰肉碱和花生四烯酸可用于预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变的易感性。

本发明的有益效果：

联合应用miR-383-3p、miR-423-3p和miR-299-5p诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌具有一定的准确性，AUC＞0.8，可以用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，可以制备成诊断试剂或诊断试剂盒；联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌具有一定的准确性，AUC＞0.8，可以用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，可以制备成诊断试剂或诊断试剂盒。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。

实施例1：基于外周血循环微小RNA诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌

第一部分：筛选阶段

一、实验材料和实验方法

1、血浆样本：腺性膀胱炎组研究对象23例，年龄45～55岁，平均51.3岁，男12例，女11例，经膀胱镜检查包括慢性炎症型6例(3M/3F)、滤泡水肿型5例(3M/2F)、乳头状瘤型5例(2M/3F)、肠腺瘤样型7例(4M/3F)；膀胱癌组研究对象21例，年龄43～54岁，平均50.1岁，男12例，女9例，具体为膀胱尿路上皮癌(12M/9F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。各组研究对象的年龄无显著性差异，所有患者均有正常的心肺肝肾及造血功能。收集上述患者的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。

2、血浆总RNA提取：取400μL血浆，使用mirVanaTM RNAIsolation试剂盒(Ambion公司)抽提总RNA，依照试剂盒说明书操作，采用分光光度计测定所提取RNA的质量。

3、分离标记：将1μg RNA，7μL DEPC水，2μL RNA Spike Control Oligospoly，5μL ATP浓度为1mmol/L Tris的溶液混合后快速离心。向上述溶液加入1.5μL 25mmol/L MnCl₂，1.5μL>

4、芯片杂交：采用Affymetrix公司miRNA芯片试剂盒，遵从试剂盒说明书进行操作。.杂交液的配制：50μL 2×杂交Mix，5μL 20×杂交对照物，5μL去离子甲酰胺，10μL DEPC水，1.7μL对照物寡聚核苷酸B₂及10μL二甲基亚砜。将上述杂交液与生物素样本混合后99℃孵育5min，45℃孵育5min，取100μL用于微阵列杂交，48℃，60r/min孵育16h。

5、芯片扫描及图像数据处理：通过GenePix 4000B microarray scanner(Axon Instruments，Foster City，CA)扫描仪对芯片扫描，并采集荧光强度。然后再通过Genepix Pro 6.0 software(Axon)图像分析软件对采集的杂交图像进行数字化分析，用每个探针的原始信号值减去该点的背景值得到每个探针的修正值；用同一批次实验中在每张芯片上修正值≥50的非对照探针做标准化，以这部分探针中值作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理。经过标准化处理后，用腺性膀胱炎组/膀胱癌组计算相应miRNAs分子的差异倍数，挑选差异大于1.5或小于0.5的miRNA作为有表达差异的miRNAs，即获得初筛结果，用于进一步验证。

6、表达验证：对初筛有表达差异的miRNAs进行验证，其引物参照GenBank数据库基因序列进行设计。按照qPCR逆转录试剂盒说明书，20μL反应体系，37℃孵育60min，95℃温育5min终止反应，逆转录成cDNA后-20℃储存备用。遵照qPCR试剂盒说明书，20μL反应体系，95℃预变性2min，40个循环，反应条件为95℃，15s及60℃，60s。通过ABI 7500定量PCR仪获得Ct值，单个反应重复2次。

二、实验结果

1、腺性膀胱炎和膀胱癌相比有差异性表达的miRNA

芯片结果显示：与腺性膀胱炎组相比，膀胱癌组患者血浆中miR-383-3p、miR-371a-3p、miR-215-5p、miR-204-5p、miR-423-3p、miR-361-3p、miR-367-3p、miR-452-5p、miR-299-5p这9种miRNAs表达上调或下调，表达差异显著(P＜0.05)。

2、qPCR表达验证结果

对腺性膀胱炎组和膀胱癌组血浆中的上述差异性miRNA进行qPCR验证，结果显示：与腺性膀胱炎组相比，膀胱癌组患者血浆中miR-383-3p上调2.3～2.5倍，miR-423-3p下调0.2～0.4倍，miR-299-5p上调1.6～1.8倍，miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p上调1.5～2.0倍。

第二部分：验证阶段

血浆样本：腺性膀胱炎组研究对象81例，年龄45～55岁，平均50.4岁，男42例，女39例，经膀胱镜检查包括慢性炎症型20例(11M/9F)、滤泡水肿型22例(11M/11F)、乳头状瘤型21例(11M/10F)、肠腺瘤样型18例(8M/10F)；膀胱癌组研究对象54例，年龄42～57岁，平均51.6岁，男29例，女25例，具体为膀胱尿路上皮癌(29M/25F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。各组研究对象的年龄无显著性差异，所有患者均有正常的心肺肝肾及造血功能。收集上述患者的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。

其它试验材料和方法同筛选阶段。

受试者工作特征曲线(ROC)分析：构建ROC曲线来验证上述qPCR表达验证的miRNAs对腺性膀胱炎诊断分型的能力。

结果显示：联合应用miR-383-3p、miR-423-3p和miR-299-5p诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，ROC曲线下面积(AUC)为0.844，灵敏度和特异性分别为91.3％和92.5％(在最佳cutoff值下，下同)，单个应用时ROC曲线下面积均小于0.7；进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p后，ROC曲线下面积(AUC)均在0.9以上，具体见表1。

表1 ROC曲线验证miRNAs诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的能力

结论分析：ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。结果表明，联合应用miR-383-3p、miR-423-3p和miR-299-5p诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌具有一定的准确性，进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，具有较高的准确性。这6个miRNAs可以用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，可以制备成诊断试剂或诊断试剂盒。

通过与申请人先前申请(申请号2016109975148)比较发现，miR-383-3p在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调1.8～2.2倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调2.3～2.5倍，表明miR-383-3p可以预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变的易感性。

实施例2：基于血浆小分子代谢物诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌

第一部分：筛选阶段

一、实验材料和实验方法

1、血浆样本：腺性膀胱炎组研究对象23例，年龄45～55岁，平均51.3岁，男12例，女11例，经膀胱镜检查包括慢性炎症型6例(3M/3F)、滤泡水肿型5例(3M/2F)、乳头状瘤型5例(2M/3F)、肠腺瘤样型7例(4M/3F)；膀胱癌组研究对象21例，年龄43～54岁，平均50.1岁，男12例，女9例，具体为膀胱尿路上皮癌(12M/9F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。各组研究对象的年龄无显著性差异，所有患者均有正常的心肺肝肾及造血功能。收集上述患者的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。

2、LC-MS分析用样品的制备

取血浆50μl，加入200μl乙腈，手动混合30s后超声混合20min，再以10,000×g离心30min，收集上清液于分离式玻璃管中，沉淀继续用200μl体积浓度50％的甲醇萃取，将甲醇萃取的上清液与乙腈萃取的上清液合并，氮气吹干，残留物于-80℃保存。LC-MS分析前，用100μl体积浓度5％的乙腈水溶液将残留物溶解，14,000×g离心5min，上清液进样分析(8h内有效)。

3、LC-MS分析参数

色谱系统：Waters Acquity HPLC/Q-TOF Micro MS

色谱柱：Acquity UPLC^TM>

流动相：A相为水(含0.1％甲酸)；B相为乙腈(含0.1％甲酸)

梯度条件：0-2min，2-50％B；2-3min，50-98％B；3-4.5min，98％B；4.5-6min，2％B。

流速：0.5mL/min；柱温：45℃。

MS条件：电喷雾(UPLC/Q-TOF/MS ESI)离子源，在正、负离子模式下，扫描范围m/z100-1000；毛细管电压3.0kV，锥孔电压35kV，离子源温度100℃，干燥气温度为450℃，干燥气流速900L/h，锥孔气流量50L/h。

4、数据处理分析和差异代谢结构鉴定

将LC-MS得到的数据导入SIMCA软件(version 13.0.2，Umetrics)进行多元统计分析。通过建立OPLS-DA模型，寻找腺性膀胱炎组和膀胱癌组之间代谢轮廓贡献较大(VIP＞1.0且p＜0.01)的代谢物，然后将这些代谢物的确切分子质量数据提交至在线数据库KEGG(http://wwwkeg.com)、METLIN(http://www.metlin.scipps.edu)、HMDB(http://www.hmdb.ca)搜寻，解析化合物质谱，对化合物进行结构鉴定，最终通过这些化合物标准品确证差异代谢物的结构。

5、定量验证：采用质谱对差异代谢物定量，测定差异代谢物在各组样本中的浓度水平。

二、实验结果

质谱定量(三重四级杆QqQ-MS)结果显示：与腺性膀胱炎组相比，膀胱癌组血浆中甲基巴豆酰肉碱上调1.9～2.3倍，花生四烯酸上调1.6～2.0倍，溶血磷脂酰胆碱(18:2)下调0.4～0.6倍，溶血磷脂酰胆碱(20:3)下调0.3～0.5倍，二酰基磷脂酰胆碱(40:4)下调0.3～0.5倍，次黄嘌呤上调1.7～1.9倍。这6个代谢物的VIP值和p值见表2。

表2 腺性膀胱炎组和膀胱癌组差异代谢物

差异代谢物VIP值p值甲基巴豆酰肉碱2.870.001花生四烯酸2.690.002溶血磷脂酰胆碱(18:2)2.540.009溶血磷脂酰胆碱(20:3)1.920.004二酰基磷脂酰胆碱(40:4)2.130.006次黄嘌呤1.770.003

第二部分：验证阶段

血浆样本：腺性膀胱炎组研究对象81例，年龄45～55岁，平均50.4岁，男42例，女39例，经膀胱镜检查包括慢性炎症型20例(11M/9F)、滤泡水肿型22例(11M/11F)、乳头状瘤型21例(11M/10F)、肠腺瘤样型18例(8M/10F)；膀胱癌组研究对象54例，年龄42～57岁，平均51.6岁，男29例，女25例，具体为膀胱尿路上皮癌(29M/25F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。各组研究对象的年龄无显著性差异，所有患者均有正常的心肺肝肾及造血功能。收集上述患者的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。

其它试验材料和方法同筛选阶段。

受试者工作特征曲线(ROC)分析：构建ROC曲线来验证上述质谱定量验证的差异代谢物对腺性膀胱炎和膀胱癌的诊断区分能力。

结果显示：联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，ROC曲线下面积(AUC)为0.872，灵敏度和特异性分别为90.8％和91.9％(在最佳cutoff值下，下同)，单个应用时ROC曲线下面积均小于0.5；进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，ROC曲线下面积(AUC)均在0.9以上，具体见表3。

表3 ROC曲线验证差异代谢物诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的能力

结论分析：ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。结果表明，联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌具有一定的准确性，进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，准确度进一步提高，具有较高的准确性。这6个血浆代谢物可以用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，可以制备成诊断试剂或诊断试剂盒。

通过与申请人先前申请(申请号201610997535X)比较发现，甲基巴豆酰肉碱在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调2.4～2.6倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调1.9～2.3倍；花生四烯酸在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调3.6～3.9倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调1.6～2.0倍。这些表明甲基巴豆酰肉碱和花生四烯酸可以用于预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变的易感性。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京拓睿谱基因科技有限公司

<120> 腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒

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