调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E

摘要

本发明涉及一种调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E，该基因ThMYC4E具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1707位所示的核苷酸序列。本发明所获得的基因可应用在培育转染植株方面，从而调控花青素的合成。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E。

背景技术

蓝粒小麦的糊粉层含有四种主要类型的花青素（Abdel-Aal, E.S.M. and P. Hucl, Composition and stability of anthocyanins in blue-grained wheat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003. 51(8): p. 2174-2180）。花青素赋予植物器官和组织五颜六色，具有吸引昆虫帮其传粉的作用（Joaquin-Cruz, E., et al., Anthocyanin and phenolic characterization, chemical composition and antioxidant activity of chagalapoli (Ardisia compressa K.) fruit: A tropical source of natural pigments. Food Research International, 2015. 70: p. 151-157），还具有帮助植物形成特异性抗病，保护植物抵御生物和非生物胁迫因素，免受紫外线的伤害的功能（Treutter, D., Significance of flavonoids in plant resistance: a review. Environmental Chemistry Letters, 2006. 4(3): p. 147-157），对人类健康也具有重要的作用，如其抗氧化、抗病毒、抗癌、抗衰老、增强人体免疫力等功效。含花青素的小麦品种是膳食来源的生活性物质（Bowen-Forbes, C.S., Y.J. Zhang, and M.G. Nair, Anthocyanin content, antioxidant, anti-inflammatory and anticancer properties of blackberry and raspberry fruits. Journal of Food Composition and Analysis, 2010. 23(6): p. 554-560；Wang, L.S. and G.D. Stoner, Anthocyanins and their role in cancer prevention. Cancer Letters, 2008. 269(2): p. 281-290；Mazza, G., Bioactivity, absorption and metabolism of Anthocyanins. Proceedings of the 1st International Symposium on Human Health Effects of Fruits and Vegetables, 2007(744): p. 117-125）。

在遗传育种工作中，蓝粒小麦的特点显而易见，其可以运用于检测隔离距离对远交小麦品种的影响（Hanson, B.D., et al., Pollen-mediated gene flow from bluealeurone wheat to other wheat cultivars. Crop Science, 2005. 45(4): p. 1610-1617），鉴定杂合子小麦（Zeven, A.C., Wheats with purple and blue grains: areview. Euphytica, 1991. 56(3): p. 243-258），以及在小麦染色体工程中检测染色体的变化(Zheng, Q., et al., Utilization of blue-grained character in wheatbreeding derived from Thinopyrum poticum. Journal of Genetics and Genomics,2009. 36(9): p. 575-580)。4E染色体携带可育性基因，在育种工作中，可以建立4E-ms系，从而育成杂交小麦品种（Zhou, K., et al., The 4E- System of Producing HybridWheat. Crop Science, 2006. 46(1): p. 250-255）。

有关小麦的蓝粒性状，起初是从偃麦草、山羊草、黑麦、大麦中发现的（Zheng etal.2009）。其中，与蓝粒小麦性状相关的主效基因Ba1定位于长穗偃麦草（2n = 10x = 70,genome EStEStEStEStEeEeEeEeEeEe）(Zeven, A.C., Wheats with purple and bluegrains: a review. Euphytica, 1991. 56(3): p. 243-258；Zheng, Q., et al.,Utilization of blue-grained character in wheat breeding derived fromThinopyrum poticum. Journal of Genetics and Genomics, 2009. 36(9): p. 575-580）。细胞遗传学分析确定了深蓝色和蓝粒58的4D染色体被长穗偃麦草的一对染色体所代替，从而推测出，源于第四同源群的与蓝粒小麦性状相关的主效基因定位于长穗偃麦草。源于长穗偃麦草的蓝粒基因被命名为Ba1（Dubcovsky, J., et al., Genetic map ofdiploid wheat, Triticum monococcum L., and its comparison with maps ofHordeum vulgare L. Genetics, 1996. 143(2): p. 983-999），并将其定位于4Ag染色体常臂 FL0.71–0.80处，通过染色体异位赋予种子不同的籽粒颜色（Zheng, Q., et al.,Molecular cytogenetic characterization of wheat-Thinopyrum ponticumtranslocations bearing blue-grained gene(s) induced by r-ray. Euphytica,2006. 152(1): p. 51-60）。 由蓝粒和白粒小麦杂交的F2代群体中(Metzger and Sebesta2004)，蓝白粒基因的分离率为3:1，表明Ba1是一个显性基因，Ba1对非蓝色等位基因是不完全显性。一粒小麦，偃麦草中与Ba1 同源的基因分别位于4A，4J染色体上(Dubcovsky etal.1996;Singh et al.2007)。

花青素生物合成是由一个复杂的次生代谢途径来完成的，属于类黄酮次生代谢途径的一个分支，从苯丙氨酸开始经羟基化、糖基化、甲基化、酰基化修饰后转运富集至液泡储存。同时它也是一系列酶促反应的结果，主要包括8种结构酶基因：查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、类黄酮-3-羟化酶(F3H)、类黄酮-3'-羟化酶(F3'H)、类黄酮-3',5'-羟化酶(F3'5'H)、二羟基黄酮醇还原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、类黄酮3-O-葡糖苷转移酶(UFGT)（Saito, K., et al., The flavonoid biosynthetic pathway in Arabidopsis:structural and genetic diversity. Plant Physiology and Biochemistry, 2013.72: p. 21-34；Zhang, Y., E. Butelli, and C. Martin, Engineering anthocyaninbiosynthesis in plants. Current opinion in plant biology, 2014. 19: p. 81-90；Ishiguro, K., et al. Genetic engineering of floricultural crops: modificationof flower colour, flowering and shape. in XXIV International EucarpiaSymposium Section Ornamentals: Ornamental Breeding Worldwide 953. 2012）。目前，小麦花青素合成途径中有关查耳酮合酶，二氢黄酮醇4-还原酶等上调基因已经被克隆(Yang et al.2004;Yang et al.2003)。但这些基因表达模式之间的相关性以及对种子籽粒的颜色却鲜有研究。花青素代谢途径是一个次级代谢，其过程不会影响植物的生长发育。花青素合成中，主要的结构基因编码苯丙氨酸氨裂解酶、查耳酮合酶、查耳酮异构酶等(Dunlop and Curtis 1991)。这些结构基因主要由两种类型的转录因子调控：bHLH，Myb(Ishiguro et al.2012;Xu et al.2015)。其中任何反应环节受阻，都会导致植物表型缺失。

随着高通量RNA测序技术的发展，可以为转录组分析提供有效的技术手段（Dornet al. 2013;Firon et al. 2013;Zhang et al. 2014），从而获得转录组中核苷酸序列的基因表达信息。本专利中，采用RNA测序技术对蓝粒和白粒小麦花青素合成途径中，结构基因和转录因子的比较转录组分析，分离出在蓝粒小麦中具有较高转录水平的一类 bHLH 转录因子ThMYC4E，作为控制蓝粒性状的Ba1的候选基因，其功能已得到验证。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E。

为解决上述问题，本发明所述的调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E，其特征在于：该基因ThMYC4E具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1707位所示的核苷酸序列。

所述基因所编码的蛋白具有序列表中SEQ ID NO.2第1位到568位所示的氨基酸序列。

所述基因作为重组载体或宿主细胞中的一部分。

所述重组载体作为宿主细胞中的一部分。

所述宿主细胞是指除人或动物的生殖细胞或胚胎干细胞以外的细胞。

所述基因通过特异性引物ThMYC4EspF 和ThMYC4EspR从小麦品种中筛选而得。

如上所述的调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E在转化植物获得转基因植物中的应用，其特征在于：构建该ThMYC4E植物表达载体，并利用该表达载体转化植物细胞，进而培育成转基因植株。

如上所述的调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E在调控花青素合成中的应用，其特征在于：所述基因与具有序列表中SEQ ID NO.3第1位到644位所示的核苷酸序列的ZmC1基因共转染到植物中，使所述基因与所述ZmC1基因进行表达。

如上所述的调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E在调控花青素合成中的应用，其特征在于：所述基因所编码的蛋白与具有序列表中SEQ ID NO.3第1位到644位所示的核苷酸序列的ZmC1基因共转染到植物中，使所述基因与所述ZmC1基因进行表达。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、与蓝粒小麦性状相关的主效基因定位于长穗偃麦草（2n = 10x = 70, genomeEStEStEStEStEeEeEeEeEeEe）。细胞遗传学分析确定了深蓝色和蓝粒58的4D染色体被长穗偃麦草的一对染色体所代替，从而推测出，源于第四同源群的与蓝粒小麦性状相关的主效基因位于长穗偃麦草。Ba1对非蓝色等位基因是不完全显性。

本发明以Tubulin-F和Tubulin-R为引物扩增的微管蛋白基因为cDNA模板量作为规范，用引物ThMYC4E-F和ThMYC4E-R对本发明中ThMYC4E编码区表达水平在蓝粒和白粒小麦中进行检测，在蓝粒小麦中可以检测到ThMYC4E，然而在白粒小麦中却检测不到ThMYC4E。经过序列比对，检测到的ThMYC4E序列与转录组分析的序列结果一致。通过比较蓝粒不同组织中，ThMYC4E的表达水平，发现种子，胚芽鞘，颖壳中均有ThMYC4E的表达，这表明，ThMYC4E在种子和胚芽鞘中的表达可能与它调控花青素的合成有关，然而，ThMYC4E在颖壳中表达所起到的功能还有待进一步研究证明。在根、茎、叶中检测不到ThMYC4E的表达（参见图2）。因此，ThMYC4E具有调控花青素合成的功能，可以实现在具体转基因植物中的应用。

2、通过将本发明中ThMYC4E的目的基因片段连接到PGEM–T easy载体中，并转入大肠杆菌DH5α中，克隆到带有目标基因的重组质粒。

设计带有ATTB接头的引物ThMYC4EPromoter-F和ThMYC4EPromoter-F，利用Gateway技术将上述目标基因转入到终载体pBract214中，构成瞬时表达载体pBract214：ThMYC4E。利用基因枪轰击进入Opata的胚芽鞘中。光处理两天后，在体视显微镜下观察这些胚芽鞘细胞合成的红色花青素斑点。

3、本发明中的ThMYC4E不存在于乌拉尔图小麦，一粒小麦，圆锥小麦，节节麦中和普通小麦中。在进化关系上，ThMYC4E与来源于乌拉尔图小麦和节节麦的Bhlh蛋白进化关系较远。可以利用特异性引物ThMYC4EspF 和ThMYC4EspR，作为4E染色体和其他蓝粒小麦品种中ThMYC4E的筛选标记。

4、本发明中的bHLH转录因子ThMYC4E，通过与ZmC1互作，可以诱导Opata的胚芽鞘合成花青素。说明ThMYC4E在植物花青素的合成途径中发挥着重要的作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明花青素合成途径中结构基因的差异表达及该途径中的转录因子。其中：箭头标明代谢过程途径，缩写字母代表催化这一过程的关键酶基因。圆括号中第一个数字代表功能基因的总数，第二个数字代表控制蓝粒小麦性状的上调基因，第三个数字代表位于普通小麦四号染色体上的功能基因。

图2为本发明ThMYC4E的相对表达水平。其中：A表示 ThMYC4E‘在Blue 1’, ‘Blue2’, ‘White 1’ and ‘White 2’小麦中的表达水平；B表示 ThMYC4E在‘Blue1’的根，叶，茎，种子，颖壳，胚芽鞘中等组织器官中的表达水平。

图3为本发明玉米和水稻中，调控花青素合成代谢的ThMYC4E和bHLH 类转录因子氨基酸序列比对。其中：黑线表示 bHLH-MYC_N端保守域（与MYB蛋白转录因子相互作用），HLH域（促进DNA的结合）和ACT-like结构域（与DNA聚合酶相互作用，促使转录起始作用）。

图4为本发明基因枪轰击opata胚芽鞘，光照培养48小时后验证ThMYC4E的功能。其中：ZmC1, ZmR和ThMYC4E分别代表构建的质粒载体pBract214:ZmC1, pBract214:ZmR 和pBract214:ThMYC4E。

图5为本发明ThMYC4E在近等基因系以及其它自然群体中的分布。其中：A中1-8分别代表 ‘Blue1’, ‘Blue2’, ‘White1’, ‘White2’, ‘Blue Norco’, ‘Sebesta Blue1’,‘Sebesta Blue 2’ 和 ‘Sebesta Blue 3’, B中1-12代‘i:Jimai 22蓝粒’表近等基因系，13-15代表‘Jimai 22’三次重复扩增。

图6为本发明蓝粒和白粒中基因的差异表达。分为三种类型的基因：红色代表上调基因；绿色代表下调基因；蓝色代表基因的差异表达。X轴表示右边样本的表达水平；Y轴表示左边样本的表达水平。

具体实施方式

实施例1 调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E，该基因ThMYC4E具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1707位所示的核苷酸序列。其通过特异性引物ThMYC4EspF 和ThMYC4EspR从小麦品种中筛选而得。

调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E所编码的蛋白具有序列表中SEQ IDNO.2第1位到568位所示的氨基酸序列。

一、ThMYC4E基因的分离

1、DNA和总RNA的提取：

DNA从1克10天大的幼苗分离出（采用Yan ZH, Wan YF, Liu KF, Zheng YL, Wang DW，（2002) Identification of a novel HMW glutenin subunit and comparison of itsamino acid sequence with those of homologous subunits. Chinese ScienceBulletin 47:220-225的方法）。总RNA从十颗蓝粒种子的糊粉层提取采用Tiangen RNAprep植物提纯试剂盒(Tiangen公司,北京)。cDNA从总RNA中获得采用Thermo RevertAid FirstStrand cDNA 合成试剂盒(Thermo-Fisher Scientific, 中国上海)。

2、设计引物分离ThMYC4E的编码区：

基于bHLH转录因子编码区序列转录本分析，设计引物从蓝粒cDNA中分离出TaMYC4E基因。引物的设计使用Primer5 软件 (Premier Biosoft, Palo Alto, 加拿大)（参见表1）。

表1为本发明所使用的引物名称和序列

3、鉴定ThMYC4E在染色体上的位置：

近等基因系‘i:Jimai 22 蓝粒’ 是由‘Jimai 22’ 和‘Blue 58’经过6次回交和5次自交成生的后代品种。Blue 58的一对染色体被来源于长穗偃麦草的一对4E染色体所替换(Zheng et al.2009)。本实验中（参见表2），共使用了不具蓝粒性状的72个青海育成品种来验证ThMYC4E 不存在于A组, AB组和ABD 组小麦的基因组中。采用4个具有蓝色性状的小麦品种，验证了ThMYC4E 普遍存在于含有4E染色体的小麦品种中（参见表2）。特异性ThMYC4EspF ThMYC4EspR引物可作为ThMYC4E基因在普通小麦中的筛选标记（参见图5）。

图5展示了ThMYC4E在近等基因系以及其它自然群体中的分布。A中1-8分别代表‘Blue1’, ‘Blue2’, ‘White1’, ‘White2’, ‘Blue Norco’, ‘Sebesta Blue1’, ‘SebestaBlue 2’ 和 ‘Sebesta Blue 3’, B中1-12代‘i:Jimai 22蓝粒’表近等基因系，13-15代表‘Jimai 22’三次重复扩增。

表2为本发明所使用材料的表型和基因型

4、PCR扩增得到目的序列：

PCR扩增利用PCR仪GeneAmp PCR System 9700（Thermo-Fisher Scientific，中国上海），使用高保真酶high-fidelity Phushion DNA polymerase（Thermo-FisherScientific，中国上海），经过以下几步完成：预变性98℃2min；35个循环：98℃15s，61℃30s，72℃30s；72℃延伸5min。

反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶检测PCR产物ThMYC4E编码区。

5、PCR产物回收：

PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳用Tiangen TIANgel Midi 纯化试剂盒(Tiangen)得到胶回收产物。

6、目的基因的克隆：

将上述胶回收产物克隆至pGEM-T Easy 质粒载体(Promega Corporation, Madison,Wisconsin, USA)得到重组质粒，重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中，挑取6个阳性克隆送至华大基因进行测序，提取质粒备用（使用TIANpure Mini Plasmid Kit(Tiangen)试剂盒）。

二、蓝粒和白粒小麦的比较转录组分析

按照测序公司mRNA-Seq制备样本要求，构建蓝粒和白粒小麦糊粉层的cDNA文库(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)。采用双末端测序技术测序（北京，中国）。在组装拼接序列之前，将经测序仪读取的未处理过的序列进行筛选，从而获得高质量的可信序列。经过精确的序列筛选后，利用参数值将高质量的读取序列拼接，构建新的一致序列(Grabherr et al. 2013）。通过表达量来计算功能基因的表达水平。采用软件 IDEG6，卡方检验分析蓝粒和白粒糊粉层中功能基因的差异表达(Romualdi et al.2003)。运用BLASTX将搜集到花青素生物合成途径中有关的功能基因与经转录组测序的蓝色和白色的混合糊粉进行序列比对。

经过精细的序列筛选后，从白粒中获得34.59M测定的序列，从蓝粒中获得23.48M测定序列，可信序列分别占98.16%和83.94%（参见表3）。高质量的可信序列经过比对后，使用Trinity 软件拼接组装出73728个功能基因（参见表4）。基于表达量计算值的基础，确定出蓝粒和白粒功能基因的差异表达水平。通过差异表达水平的比较，在蓝粒和白粒中，共有5828个 差异表达的功能基因（参见图6）。以白粒作为参考对照，鉴定出4176个上调功能基因和1652个下调功能基因在蓝粒中的表达水平。

表3为本发明中的转录组测序数据

表4为本发明组装的功能基因

为了进一步确定控制蓝粒性状的关键基因，将有关花青素生物合成途径中的11个结构基因和两个转录因子在组装结构基因数据库中进行BLAST搜索。发现77个功能基因与花青素合成途径中的基因具有同源性。其中，8个功能基因在蓝粒中的转录表达水平高于在白粒中的表达量。这8个功能基因与一个苯丙氨酸氨裂解酶,一个类黄酮 3', 5'羟化酶，一个二氢黄酮醇还原酶 ，和五个bHLH 转录因子有关（参加图1；表5）。这五个bHLH转录因子均来自于CL3336.片段。在白粒小麦中，这五个转录因子的转录水平相当低，表达量小于0.29，然而，在蓝粒中表达量可达19.14，这表明在白粒小麦中，这个基因不表达。这个编码bHLH转录因子的基因被命名为ThMYC4E，可以作为Ba1基因的候选基因。

表5为糊粉层中与花青素合成有关的结构基因

图6展示了蓝粒和白粒中基因的差异表达。

三、ThMYC4E生物信息学分析

使用Vector NTI 10软件（Invitrogen）进行序列拼接及比对。利用Primer 5.0（Premier Biosoft, Palo Alto, 加拿大）软件进行引物设计。(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)网站被用来预测保守功能。预测保守功能域。使用MEGA 4.0构建bHLH蛋白的系统进化树(Tamurak et al., 2007)。

为了解ThMYC4E与其它同类基因的关系，从而预测ThMYC4E的生物学功能，对ThMYC4E进行生物信息学分析。我们选择了已知能够调控花青素合成的bHLH类转录因子的蛋白全长序列构建系统发生树。从同源性来看，在玉米和水稻中ThMYC4E与调控花青素合成代谢的bHLH类蛋白有较近的关系。bHLH蛋白在相同的聚群中划分在同一分支，而ThMYC4E在玉米，小麦和水稻中的聚类情况相对独立，这表明ThMYC4E并非来源于普通小麦的染色体。ThMYC4E蛋白与bHLH功能蛋白相比，包含的三个完整的结构域： bHLH-MYC_N末端, HLH 和ACT-like 域结构（参见图3）。

图3展示了在玉米和水稻中，调控花青素合成代谢的ThMYC4E和bHLH 类转录因子氨基酸序列比对。黑线表示 bHLH-MYC_N端保守域（与MYB蛋白转录因子相互作用），HLH域（促进DNA的结合）和ACT-like结构域（与DNA聚合酶相互作用，促使转录起始作用）。

四、ThMYC4E的表达谱

反转录PCR(RT-PCR)以Tubulin-F和Tubulin-R为引物扩增的微管蛋白基因为cDNA模板量作为规范，用引物ThMYC4EcdsF和ThMYC4EcdsR对ThMYC4E的表达水平进行检测。ThMYC4E编码区全长1707bp，编码588个氨基酸。在种子，胚芽鞘，颖壳中均有ThMYC4E的表达，这表明，ThMYC4E在种子和胚芽鞘中的表达可能与它调控花青素的合成有关，然而，ThMYC4E在颖壳中表达所起到的功能还有待进一步研究证明。在根、茎、叶中却检测不到ThMYC4E的表达(参见图2)。

图2展示了ThMYC4E的相对表达水平。A表示ThMYC4E‘在Blue 1’, ‘Blue 2’,‘White 1’ and ‘White 2’小麦中的表达水平；B表示 ThMYC4E在‘Blue1’的根，叶，茎，种子，颖壳，胚芽鞘中等组织器官中的表达水平。

五、ThMYC4基因调控花青素合成的转录活性功能验证

1、Gateway技术

设计带有ATTB接头的引物TaMYC1AttB1F和TaMYC1AttB2R从连接有全长ThMYC4E编码区的pGEM-T Easy载体上扩增；然后以该PCR产物为DNA模板，使用attB1 adapter和attB2adapter进行PCR扩增；扩增产物进行琼脂糖电泳、回收、测定浓度。根据Gateway克隆试剂盒说明书进行BP反应构建入门载体pDONR207-ThMYC4E，步骤如下：

⑴BP反应：200~400ng PCR回收产物

100ng pDONR207载体

1µl BP ClonaseⅡ

加水至5µl

25℃水浴12~16h

⑵向反应体系中加入0.5µl Proteinase K (2µg/µl)，37℃水浴15min。

⑶将重组质粒转化进DH5α，阳性克隆筛选并测序，然后提取质粒备用（TIANpureMini Plasmid Kit(Tiangen)试剂盒）。

⑷瞬时表达载体的构建：

本发明所用瞬时表达载体 pBRACT214:ThMYC4E，pBRACT214:ZmR 和pBRACT214:ZmC1，已经过Gateway改造。根据Gateway克隆试剂盒说明书进行LR反应构建瞬时表达载体，步骤如下：

①LR反应：300ng pDONR207-重组质粒

100ng 瞬时表达载体

1µl LR ClonaseⅡ

加水至5µl

25℃水浴12~16h

②向反应体系中加入0.5µl Proteinase K (2µg/µl)，37℃水浴15min。

③将重组质粒转化进DH5α，阳性克隆筛选并测序，然后提取质粒备用。

2、基因的功能验证

瞬时表达载体重组载体使用Ahmed N, Maekawa M, Utsugi S, Himi E, Ablet H,Rikiishi K, Noda K (2003) Transient expression of anthocyanin in developingwheat Coleoptile by maize C1 and beta-peru regulatory genes for anthocyaninsynthesis. Breeding Science方法，利用基因枪轰击进入Opata的胚芽鞘中。两天后使用实体显微镜对所有被处理过的胚芽鞘(Leica Co., Oskar Barnack Germany)进行观察拍照（参见图4）。胚芽鞘红细胞数量进行统计并保存在Microsoft Excel 2003中（参见表6）。

表 6 基因枪轰击之后胚芽鞘红细胞数量

注：BCN，轰击的胚芽鞘数量；RCN，胚芽红细胞鞘数量；ADCNEC，平均每个胚芽鞘上的红细胞数量；SD，标准差；MaxiRCNEC，单个胚芽鞘红细胞最大数；MiniRCNEC，单个胚芽鞘红细胞最小数。

图4展示了基因枪轰击opata胚芽鞘，48小时后验证ThMYC4E的功能。

实施例2 调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E作为重组载体，该重组载体作为宿主细胞中的一部分。

实施例3 调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E作为宿主细胞中的一部分。

上述实施例2~3中的宿主细胞是指除人或动物的生殖细胞或胚胎干细胞以外的细胞。

实施例4 调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E在转化植物获得转基因植物中的应用是指：构建该ThMYC4E植物表达载体，并利用该表达载体转化植物细胞，进而培育成转基因植株。

实施例5 调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E在调控花青素合成中的应用是指：该基因与具有序列表中SEQ ID NO.3第1位到644位所示的核苷酸序列的ZmC1基因共转染到植物中，使基因与ZmC1基因进行表达。

实施例6 调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E在调控花青素合成中的应用是指：该基因所编码的蛋白与具有序列表中SEQ ID NO.3第1位到644位所示的核苷酸序列的ZmC1基因共转染到植物中，使基因与ZmC1基因进行表达。

<110>中国科学院西北高原生物研究所

<120>调控花青素合成与代谢的小麦新基因ThMYC4E

<160>2

<210>1

<211>1707

<212>DNA

1ATGCG GGAAA TAGCT ACTCA GCGGT GTGGT AATCG ATCAA TGGCG CTATC

51 AGCTC CTCCC AGTCA GGAAC AGCCG TCGGG GAAGC AATTC GGCTA CCAGC

101TCGCT GCTGC TGTGA GGAGC ATCAA CTGGA CTTAT GGCAT ATTTT GGTCC

151ATTTC CGCCA GCCCG CGCCC AGGCC ACTCC TCAGT TCTGG CGTGG AAGGA

201TGGGT TCTAC AACGG CGAGA TAAAG ACTAG AAAGA TTACC GGCTC GACCA

251CTACG GAGCT TACAG CGGAC GAGCG CGTCA TGCAC AGAAG CAAGC AACTG

301AGGGA GCTCT ACGAA TCGCT CTTGC CCGGC AACTC CAACA ACCGG GCAAG

351GCGAC CAACC GCCTC ACTGT CACCG GAGGA TCTCG GGGAC GGCGA GTGGT

401ATTAC ACCAT AAGCA TGACT TACAC CTTCC ACCCT AATCA AGGGT TGCCA

451GGCAA AAGCT TTGCG AGCAA TCAAC ATGTT TGGCT GTACA ACGCT CAATA

501CGCAA ACACC AGAGT TTTCC CCCGC GCGCT CTTAG CAAAG ACAAT CGTTT

551GCATT CCCTT CATGG GCGGT GTGCT TGAGC TCGGA ACGTC GGATC AGGTG

601TTGGA GGACC CGAGC ATGGT GAAGC GGATC AGCAC GTCTT TCTGG GAGCT

651GCACT TGCCG TCATC CTTGG AGTCG AAGGA TCCGA GCTCC AGCAC ATCAG

701CAAAC GATAC CAGGG AGGCC ACCGA CATCA TCTTG TTCGA GGATT TCGAC

751CACAA CGACA CAGTT GAGGG GGTGA TCTCT GAGCA AAGGG AGGTC CAGTG

801CCCGT CCAAC GTCAA TCTGG AGCGC CTCAC AAAGC AGATG GACGA GTTCC

851ACAGC CTTCT CGGTG GACTG GACGT GCATC CTCTC GAAGA CAGAT GGATC

901ATGGA CGAGC CCTTT GAGTT TACGT TTTCC CCAGA AGTGG CGCCG GCTAT

951GGATA TGCCG AGCAC CGACG ATGTC ATCGT CACTT TAAGT AGGTC CGAAG

1001 GCTCT CGTCC ATCCT GCTTC ACAGC GTGGA AGGGA TCATC CGAGT CGAAA

1051 TACGT GGCTG GCCAG GTCGT TGGGG AGTCA CAGAA GTTGC TGAAT AAAGT

1101 TGTGG CTGGT GGTGC ATGGG CGAGC AATTA TGGCG GTCGC ACCAT GGTGA

1151 GAGCT CAGGG AATTA ACAGC AACAC CCATG TCATG ACAGA GAGAA GACGC

1201 CGGGA GAAAC TCAAC GAGAT GTTCC TGGTT CTCAA GTCAC TGGTC CCGTC

1251 CATTC ACAAG GTAGA CAAAG CATCC ATCCT CACAG AAACG ATAGG TTATC

1301 TTAGA GAACT GAAGC AAAGG GTAGA TCAGC TAGAA TCCAG CCGGT CACCG

1351 TCTCA CCCAA AAGAA ACAAC AGGAC CGAGC AGAAG CCATG TCGTC GGCGC

1401 TAGGA AGAAG ATAGT CTCGG CCGGA TCCAA GAGGA AGGCG CCAGG GCTGG

1451 AGAGC CCGAG CAATG TCGTG AACGT GACGA TGCTG GACAA GGTGG TGCTG

1501 TTGGA GGTGC AGTGC CCGTG GAAGG AGCTG CTGAT GACAC AAGTG TTTGA

1551 CGCCA TCAAG AGCCT CTGTC TGGAC GTTGT CTCCG TGCAG GCATC CACAT

1601 CAGGT GGCCG TCTTG ACCTC AAGAT ACGAG CTAAT CAGCA GCTTG CGGTC

1651 GGTTC TGCTA TGGTG GCACC TGGGG CAATC ACCGA AACAC TTCAG AAAGC

1701 TATAT AG

<210>2

<211>568

<212>DNA

1 MREIA TQRCG NRSMA LSAPP SQEQP SGKQF GYQLA AAVRS INWTY GIFWS

51ISASP RPGHS SVLAW KDGFY NGEIK TRKIT GSTTT ELTAD ERVMH RSKQL

101 RELYE SLLPG NSNNR ARRPT ASLSP EDLGD GEWYY TISMT YTFHP NQGLP

151 GKSFA SNQHV WLYNA QYANT RVFPR ALLAK TIVCI PFMGG VLELG TSDQV

201 LEDPS MVKRI STSFW ELHLP SSLES KDPSS STSAN DTREA TDIIL FEDFD

251 HNDTV EGVIS EQREV QCPSN VNLER LTKQM DEFHS LLGGL DVHPL EDRWI

301 MDEPF EFTFS PEVAP AMDMP STDDV IVTLS RSEGS RPSCF TAWKG SSESK

351 YVAGQ VVGES QKLLN KVVAG GAWAS NYGGR TMVRA QGINS NTHVM TERRR

401 REKLN EMFLV LKSLV PSIHK VDKAS ILTET IGYLR ELKQR VDQLE SSRSP

451 SHPKE TTGPS RSHVV GARKK IVSAG SKRKA PGLES PSNVV NVTML DKVVL

501 LEVQC PWKEL LMTQV FDAIK SLCLD VVSVQ ASTSG GRLDL KIRAN QQLAV

551 GSAMV APGAI TETLQ KAI

<210>3

<211>644

<212>DNA

1 ATGGC GAAGG CAGAT GGAAG GAAGT CCCCC TCAAA GCCGG TCTGC GGCGG

51TGCGG CAAGA GCTGC CGGCT GCGGT GGCTC AACTA CCTCC GGCCG AGCAT

101 CAAGC GGGGC AACAT CTCCG ACGAC GACGA GGAGC TCATC GTCAG GCTCC

151 ACCGC CTCCT CGGCA ACAGG TGGTC CCTCA TCGCG GGCAG GCTGC CCGGC

201 CGAAC AGACA ACGAA ATCAA GAACT ACTGG AACAG CACCC TTGGC CGGAA

251 GGCGC TCCCG GCGCG ACTGG ACACC ACCAG GACGG TCGCC ACACC CTGCC

301 CCTCC GCCAG CTCCG GCTCC TCCAC CCGGG GCGTC GACAG CATGG CTTTC

351 CTCTA ACTGC GGGGA TGGTA CAAGT GCCAA GGCTG CGGGG CTGCT GTCGT

401 CGGCC TCGGT GTGGG TGCCC AAGCC CGTGA GGTGC ACAGG CGGTC TCTTC

451 CTCAG CCGGG ATGCG CCGCC CCCGC CGGTC ATGGA GACGC GGGCC GTGGG

501 AGGAG ACGCA GATGA GTGCA GCGGC AGCAG CTTGG TGGCA TCGTC GGGCG

551 GTGGC GACTG GATGG ACGAC GTAAG AGCCT TAGCG TCGTT TCTCG AGTCC

601 GACGA GGACT GGGAC TGGGT CAAGT CCCTG CAGAT GGCGT ATAA