一株高产过氧化氢酶的黑曲霉菌株及其应用

摘要

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产过氧化氢酶的黑曲霉菌株及利用其生产过氧化氢的方法。本发明提供了一株高产过氧化氢酶的黑曲霉(Aspergillus niger)LDG1，保藏编号为CGMCC No.13167；本发明还公开了利用该菌株生产过氧化氢酶的工业生产方法，用该菌株经种子培养和液体深层发酵可使发酵液酶活达到152000U/mL以上，经提取制得的过氧化氢酶产品，成品低廉，耐碱耐高温，可广泛的应用于食品、造纸和纺织行业，使得这些行业中的生产过程更加绿色环保。

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产过氧化氢酶的黑曲霉菌株及利用其生产过氧化氢的方法。

背景技术：

过氧化氢酶几乎存在于所有好氧生物的体内，能够催化过氧化氢分解为水和氧气的反应，具有清除自由基、保护细胞免受氧气损害等保护生物机体的功能。过氧化氢是一种强氧化剂，广泛应用于纺织、食品和医疗领域的漂白和消毒，但是其残留物对生产工艺和身体健康有很大影响。利用过氧化氢酶特异性的去除过氧化氢是一种高效环保的方法。

目前过氧化氢酶的生产主要是通过微生物发酵的方法获得，因在纺织、食品和医疗领域的广泛应用，就要求过氧化氢酶不但具有耐酸耐碱和耐热等的性能，还要发酵酶活水平高，成本低。目前，一些文献及专利报道的过氧化氢酶产酶菌株，发酵酶活水平低，只注重在纺织工业中强碱高温环境中的应用，未考虑其它行业中的使用环境，且多数的产酶菌株为杆菌类。

如中国专利CN103555620A公布了一株节杆菌用于碱性过氧化氢酶的生产，摇瓶液体深层发酵的过氧化氢酶活水平能达到49706U/mL；中国专利CN105483061A公布了一株解脲芽孢杆菌，其摇瓶发酵的酶活水平能达到41426U/mL。

尽管这些研究也已经达到了较高的水平，但没有提出一个有效的工业生产方法，对于用黑曲霉进行工业化发酵生产过氧化氢酶的方法未见报道。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供一株高产过氧化氢酶的黑曲霉菌株及其工业发酵方法。

本发明提供的技术方案之一，是一株高产过氧化氢酶的黑曲霉菌株，所述菌株是从含有纺织厂及食品厂的工业园区的土壤中分离获得的黑曲霉LDG1，经鉴定其属于黑曲霉(Aspergillus niger)，该菌株已于2016年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.13167。

本发明所提供的技术方案之二，是所述黑曲霉菌株CGMCC No.13167酵发过氧化氢酶的方法，主要包括如下步骤：

a.种子罐培养：将菌种接至种子培养基中，33℃，180-300rpm，发酵50h；

b.发酵罐培养：在无菌条件下，按照7％的接种量，将种子液压入发酵罐，进行发酵罐培养，33℃，300-800rpm，发酵至40h-110h，通过补料控制DE值在55-60之间；当发酵至110h-170h时，通过补料将DE值控制在35-40之间；当发酵至170h-185h菌体自溶严重，酶活无明显提高时停止补料；当发酵至185h-195hDE值降低至20时放罐；

c.提取与精制：发酵液中加入200ppm聚丙烯酰胺和2.5％珍珠岩进行絮凝和板框压滤，然后进行超滤浓缩6-8倍，最后加入防腐剂(添加与超滤浓缩液质量体积比为0.1％-0.3％的亚硝酸钠、0.6％-0.8％的苯甲酸钠和0.3％-0.4％的山梨酸钾)和保护剂(添加与超滤浓缩液质量体积比为7％-9％葡萄糖和10％-15％甘油)配兑并用硅藻土过滤除菌，得到过氧化氢酶成品酶制剂；

培养基质量体积百分百组成如下：

种子培养基：蔗糖4％-4.8％，葡萄糖1％-2％，硫酸镁0.1％-0.2％，氯化钾0.05％-0.08％，硝酸钠0.3％-0.4％，磷酸二氢钾0.2％-0.4％，其余为水，pH 7.0；

发酵培养基：玉米淀粉9％-11％，玉米粉5％-8％，豆饼粉2.5％-3％，氯化钙0.03-0.04％，硫酸铵1％-1.5％，磷酸二氢钾0.5％-0.8％，磷酸二氢钠0.4％-0.7％，柠檬酸钠0.2％-0.4％，玉米浆1％-3％，其余为水，pH 7.0；

补料培养基：玉米淀粉25％，玉米浆2.3％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.2％-0.5％，pH 7.0。

利用上述黑曲霉菌株CGMCC No.13167及方法进行发酵，所产过氧化氢酶的发酵酶活水平可达到152000U/mL以上；

所产过氧化氢酶的酶学特性如下：

1、最适反应温度：55℃；

2、最适反应pH：9.0；

3、热稳定性：在80℃条件下保温1h仍能保持90％以上的活性；

4、pH稳定性：在pH7.0-12的条件下24h后，相对酶活力仍然保持在85％以上。

有益效果：

1、本发明首先提供了一株高产过氧化氢酶的黑曲霉菌株，利用该菌株进行工业化发酵生产的发酵酶活水平可达到152000U/mL以上，大大降低了生产成本，有利于过氧化氢酶的大规模应用，节能减排。

2、本菌株所产的过氧化氢酶最适反应温度为55℃，在80℃条件下保温1h仍能保持90％以上的活性；最适反应pH为9.0，在pH7.0-12的条件下24h后，相对酶活力仍然保持在85％以上；以上这些耐碱耐高温的特性，使应用该菌株及配套工艺制备的过氧化氢酶可以广泛的适用于食品和纺织等工业，因此本发明提供的菌株及工艺具有广泛的应用前景和显著的经济效益。

附图说明：

图1不同温度下过氧化氢酶酶活力曲线；

图2过氧化氢酶耐热性曲线；

图3不同pH下过氧化氢酶酶活力曲线；

图4过氧化氢酶耐酸碱性曲线。

具体实施方式：

以下通过具体实施例对本发明做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1过氧化氢酶酶活测定方法

一个标准酶活单位(1U)定义为：在37℃条件下，1min分解1umolH₂O₂(消光系数为39.4L/mol/cm)所需的酶量。

H₂O₂的分解速率用紫外可见光分光光度计S53在240nm，30℃条件下进行测定。反应总体积为3mL,含0.1mL酶液和2.9mL含有120mmol/L>2O₂和50mmol/L的磷酸二氢钾、磷酸氢二钾缓冲液(pH7.0)。

实施例2产酶菌株的筛选

从含有纺织厂和食品厂的工业园区土壤中筛选并经平板培养，滴加H₂O₂产气泡情况再筛选，并比较过氧化氢活性大小而得到。

土壤经过两次察氏液体培养基增值培养，涂布察氏培养基平板，培养后滴加0.2mL8％过氧化氢于大小均一的菌落上，选择产气泡迅速且持续时间久的菌落进行试管发酵培养，通过比较分解过氧化氢的能力大小，最终筛选得到菌株CGMCC No.13167。经鉴定该菌株属于黑曲霉(Aspergillus niger)。

实施例3液体发酵生产过氧化氢酶及其提取

(1)种子罐培养：将菌种接至种子培养基中，33℃，180rpm，发酵50h；

(2)发酵罐培养：在无菌条件下，按照7％的接种量，将种子液压入发酵罐，进行发酵罐培养，33℃，300rpm，发酵至40h-110h，通过补料控制DE值在55-60之间；当发酵至110h-170h时，通过补料将DE值控制在35-40之间；当发酵至170h菌体自溶严重，酶活无明显提高时停止补料；当发酵至185h DE值降低至20时放罐；

(3)提取与精制：发酵液中加入200ppm聚丙烯酰胺和2.5％珍珠岩进行絮凝和板框压滤，然后进行超滤浓缩6倍，最后加入防腐剂(添加与超滤浓缩液质量体积比为0.1％亚硝酸钠、0.6％苯甲酸钠和0.3％山梨酸钾)和保护剂(添加与超滤浓缩液质量体积比为7％葡萄糖和10％甘油)配兑并用硅藻土过滤除菌，得到过氧化氢酶成品酶制剂；

(4)培养基质量体积百分百组成如下：

种子培养基：蔗糖4％，葡萄糖1％，硫酸镁0.1％，氯化钾0.05％，硝酸钠0.3％，磷酸二氢钾0.2％，pH 7.0；

发酵培养基：玉米淀粉9％，玉米粉5％，豆饼粉2.5％，氯化钙0.03％，硫酸铵1％，磷酸二氢钾0.5％，磷酸二氢钠0.4％，柠檬酸钠0.2％，玉米浆1％，pH 7.0；

补料培养基：玉米淀粉25％，玉米浆2.3％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.2％，pH7.0；

应用上述方法，发酵周期为185小时时，过氧化氢酶发酵液酶活力为：152884U/mL。

实施例4液体发酵生产过氧化氢酶及其提取

(1)种子罐培养：将菌种接至种子培养基中，33℃，300rpm，发酵50h；

(2)发酵罐培养：在无菌条件下，按照7％的接种量，将种子酵液压入发酵罐，进行发酵罐培养，33℃，800rpm，发酵至40h-110h，通过补料控制DE值在55-60之间；当发酵至110h-170h时，通过补料将DE值控制在35-40之间；当发酵至185h菌体自溶严重，酶活无明显提高时停止补料；当发酵至195h DE值降低至20时放罐；

(3)提取与精制：发酵液中加入200ppm聚丙烯酰胺和2.5％珍珠岩进行絮凝和板框压滤，然后进行超滤浓缩8倍，最后加入防腐剂(添加与超滤浓缩液质量体积比为0.3％亚硝酸钠、0.8％苯甲酸钠和0.4％山梨酸钾)和保护剂(添加与超滤浓缩液质量体积比为9％葡萄糖和15％甘油)配兑并用硅藻土过滤除菌，得到过氧化氢酶成品酶制剂；

(4)培养基质量体积百分百组成如下：

种子培养基：蔗糖8％，葡萄糖2％，硫酸镁0.2％，氯化钾0.08％，硝酸钠0.4％，磷酸二氢钾0.4％，pH 7.0；

发酵培养基：玉米淀粉11％，玉米粉8％，豆饼粉3％，氯化钙0.04％，硫酸铵1.5％，磷酸二氢钾0.8％，磷酸二氢钠0.7％，柠檬酸钠0.4％，玉米浆3％，pH 7.0；

补料培养基：玉米淀粉25％，玉米浆2.3％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.5％，pH7.0。

应用上述方法，发酵周期为195小时时，过氧化氢酶发酵液酶活力为：152965U/mL。

实施例5液体发酵生产过氧化氢酶及其提取

(1)种子罐培养：将菌种接至种子培养基中，33℃，240rpm，发酵50h；

(2)发酵罐培养：在无菌条件下，按照7％的接种量，将种子液压入发酵罐，进行发酵罐培养，33℃，500rpm，发酵至40h-110h，通过补料控制DE值在55-60之间；当发酵至110h-170h时，通过补料将DE值控制在35-40之间；当发酵至180h菌体自溶严重，酶活无明显提高时停止补料；当发酵至190h DE值降低至20时放罐；

(3)提取与精制：发酵液中加入200ppm聚丙烯酰胺和2.5％珍珠岩进行絮凝和板框压滤，然后进行超滤浓缩7倍，最后加入防腐剂(添加与超滤浓缩液质量体积比为0.2％亚硝酸钠、0.7％苯甲酸钠和0.35％山梨酸钾)和保护剂(添加与超滤浓缩液质量体积比为8％葡萄糖和13％甘油)配兑并用硅藻土过滤除菌，得到过氧化氢酶成品酶制剂；

(4)培养基质量体积百分百组成如下：

种子培养基：蔗糖4.5％，葡萄糖1.5％，硫酸镁0.15％，氯化钾0.06％，硝酸钠0.35％，磷酸二氢钾0.3％，pH 7.0；

发酵培养基：玉米淀粉10％，玉米粉6％，豆饼粉3％，氯化钙0.04％，硫酸铵1.5％，磷酸二氢钾0.6％，磷酸二氢钠0.5％，柠檬酸钠0.3％，玉米浆2％，pH 7.0；

补料培养基：玉米淀粉25％，玉米浆2.3％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.4％，pH7.0；

应用上述方法，发酵周期为190小时时，过氧化氢酶发酵液酶活力为：153780U/mL。

实施例6最适反应温度

取实例5得到的过氧化氢酶成品酶制剂，以正常条件pH7.0，温度55℃测定的酶活力为100％，pH7.0，不同温度下测定酶活力，计算相对酶活力。结果如图1所示，最适反应温度为55℃。

实施例7耐热性

取实例5得到的过氧化氢酶成品酶制剂，以55℃，pH7.0条件下保温1h条件下测定的酶活力为100％，计算相对酶活力。将盛有9mL pH7.0缓冲液的试管分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃的水浴锅中预热10min,分别加入1mL过氧化氢酶，迅速摇匀并准确计时1h,迅速取出于冰水浴中冷却，冷却后用pH7.0缓冲液继续稀释至相应倍数，测定酶活力。测定结果如图2所示，在80℃条件下保温1h仍能保持90％以上的活性。

实施例8最适反应pH

取实例5得到的过氧化氢酶成品酶制剂，在55℃，不同pH值3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11条件下，测定同一液态酶制剂样品的酶活力。选取在55℃，pH9.0条件下测定的酶活为100％，计算相对酶活。结果如图3所示，最适pH为9.0。

实施例9耐酸碱性

取实例5得到的过氧化氢酶成品酶制剂，以pH9.0，55℃条件下测定的酶活力为100％，计算相对酶活力。分别取9ml不同pH的缓冲液(分别配制0.2mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，取相应的体积调节至所需pH)于21支试管中，加入1ml过氧化氢酶摇匀，室温下放置24h后，摇匀继续用pH7.0缓冲液稀释至相应倍数，测定酶活力。测定结果如图4所示，在pH7.0-12的条件下24h后，相对酶活力仍然保持在85％以上。